Ugrás a tartalomhoz

Fermentációs biotechnológia

Dr. Kutasi József (2007)

Glia Kft.

Immunológiai termékek

Immunológiai termékek

Az immunológiában jól ismert antitesteket ma már nem csak állatok immunizálásával, hanem emlőssejtek fermentációjával is előállítják. Ezek lehetnek immunglobulinok, monoklonális antitestek pl. speciális molekulákat vagy ráksejt receptorokat felismerő antitestek egyaránt. A technika fejlődésével az emlőssejtek irányított tenyésztésével hormonokat, citokineket, vírusfehérjéket, sőt interferonokat is képesek már előállítani. Az emlőssejtek tenyésztését a monoklonális ellenanyagtermelés különböző fázisainak ismertetésével kívánjuk bemutatni.

Az emlőssejtek speciális tenyésztése

Az emlőssejtek tenyésztése a mikrobiológiában szokatlan új eszközök használatát tette indokolttá. Az emlős sejttenyészetek szaporítása nem lehetséges egyszerű üvegeszközökben, hanem csak a sejtek megtapadását segítő felülettel rendelkező sterilezett flaskákban (x. kép). Ezeket nem rázóasztalra, hanem az emlőssejtek életfunkcióihoz szükséges gázkeveréket tartalmazó szén-dioxid kamrákba kell helyezni.

Fluorescens mikroszkóp által kimutatott nem elő pirosan fluoreszkáló Saccharomyces sejtek

Amennyiben nem megfelelő élesztőtörzseket alkalmazunk a bendő környezetében elpusztulnak és megfestve, gerjesztési hullámhosszon piros fényt bocsájtanak ki.

Nagyobb mennyiségben (300-1000 ml) un. forgatható hengeres rollerüvegekben a sejteket folyadékban lebegő életmódhoz adaptálhatjuk. 1-40 liter térfogatban csak automatizált, air-lift kíméletes keverésű, gázkeveréket (N2, O2, CO2 és levegő) adagoló emlőssejt fermentorokban lehetséges nagyobb térfogatú emlőssejt kultúrák létrehozása.

Az emlőssejt tenyésztés legspeciálisabb módszere a hollow fiber hordozóhoz kötött tenyésztés. A módszer lényege, hogy a sejtek kapilláris kötegekben rögzülve szaporodnak az extrakapilláris térben. Az intrakapilláris térben a táptalajt folyamatosan áramlás alatt tartva, az ultraszűrő hollow fiber membránon keresztül diffúzióval jutnak el a tápelemek a sejtekhez. A termelt fehérjék és ellenanyagok a sejteket tartalmazó térben halmozódnak fel, ahonnan folyamatosan eltávolíthatók.

A táptalajokat, mivel vitaminokat, hormonokat, antibiotikumokat és vérsejteket tartalmaznak, nem lehet autoklávban sterilezni. Minden táptalajkomponenst autoklávozott desztillált vízben kell oldani, majd 0,2 µm pórusméretű membránszűrőn sterilre szűrünk. Általában a szükséges steril vérszérumot FCS (Fetal Calf Serum) formában adagolják a tenyészetekhez.

A monoklonális ellenanyag termelés

A molekulákat felismerő monoklonális ellenanyagot termelő hybridóma sejtvonalakat az adott anyagra immunizált egerek lépéből származó B limfocitáinak és halhatatlan, korlátlanul szaporodó (tumor) mieloma sejtek fúziójával nyerik. A fúziót általánosan PEG (polietilénglikol)–gel idézik elő, amely erősen dipólus jellegénél fogva megbontja a sejtek vízburkát, így elősegíti az egymás közelében lévő sejtek lipid membránja közötti kölcsönhatást és így a membrán fúzió létrejöttét. Ma már általánosan elterjedt az elektromos, illetve mágneses tér létrehozásával indukált fúzió is.

A továbbiakban a hibrideket elkülönítik a mieloma sejtektől és a megfelelő sejteket szövettenyésztő 96 vagy 24 lyukú plate-ken limitáló hígítás módszerével klónozzák (minden tenyésztő lyukba egyetlen, egyféle genetikai tulajdonsággal rendelkező sejt kerül). Az emlőssejtek speciális tulajdonsága, hogy egymaguk képtelenek az életben maradásra, ezért a klónozás során segítő feeder sejtekkel és/vagy interferonok, interleukinek adagolásával szaporítják őket. A mikrobiológiai gyakorlatban hosszúnak számító két-három héten belül a mikrokultúrák már elegendő számú sejtet tartalmaznak, ahhoz, hogy kellő mennyiségű ellenanyagot termeljenek a rögzült sejtek felülúszóiból történő kimutatáshoz. A kimutatás történhet ELISA, RIA vagy FACS speciális immunkimutatási módszerekkel egyaránt. Ettől fogva a megfelelő monoklonális antitest termelő klónokból léptéknövelési kísérletek keretében flaska-, roller- és fermentor tenyészeteket állítanak elő, majd az ezekből kapott nagy mennyiségű felülúszókat affinitás kromatográfiának alávetve az antitesteket tisztított és koncentrált formában kinyerik.

A tenyésztés során a konkrét sejtvonal 10-75 cm2-es flaskákban tenyésztett sejtjeivel rollertenyészeteket oltanak 40-60 ml induló térfogattal 1-2x105 sejt/ml kezdeti sejtszámmal. A sejttenyészethez naponta friss médiumot adva 4 nap alatt 300-1000 ml végtérfogatig lehet tenyészteni, a sejtszám a maximális 106 sejt/ml. A sejtek életképességét, nem a mikrobiológiában megszokott szélesztéssel, hanem fordított mikroszkóppal tripánkékkel megfestett tenyészetekben bürker kamrás eljárással vizsgálják (a halott sejtek citoplazmája festődik, az élő, ép sejthártyájúak nem) és a viabilitási százalék megállapításával jellemzik.

A fermentorban a sejteket alacsony oxigéntenzión (pl.OD=12), így oxigénigényük messze elmarad a baktériumok és gombák igényeitől. A sejtek mebránját a fellépő nyírófeszültségek könnyen károsítják, ezért csak a legalacsonyabb a sejtek kiülepedését még éppen megakadályozó alacsony fordulatszámon kell kevertetni (pl. 40 fordulat/perc). A pH –t semleges 7,0 - 7,2 tartományban tartja az automatika és kis mennyiségű gázbeáramlás mellett (0,5 l/perc, a fermentor vezérlőegysége az OD-nak és a pH-nak megfelelően adagolja szükség szerint a négyféle gázt) tenyészthetünk. A fermentáció során a pH csökken a sejtek laktáttermelése miatt, de ezt a sejtek jól tolerálják, jobban mint a pH növekedést.

Emlőssejtfermentor

Az emlőssejtfermentorok legnagyobb mérete nem haladja meg a néhány száz litert, az emlőssejtek nagy érzékenysége miatt. A sejtek mebránját a fellépő nyírófeszültségek könnyen károsítják, ezért csak a legalacsonyabb a sejtek kiülepedését még éppen megakadályozó alacsony fordulatszámon kell kevertetni (pl.40 fordulat/perc). A pH .t semleges 7,0 - 7,2 tartományban tartja az automatika és kis mennyiségű gázbeáramlás mellett (0,5 l/perc, a fermentor vezérlőegysége az OD-nak és a pH-nak megfelelően adagolja szükség szerint a négyféle gázt) tenyészthetünk.

A monoklonális antitest termelő tenyészetek termelését csak az immonológiai gyakorlatban már rutinszerűen alkalmazott ELISA módszerrel lehet nyomon követni. Az eljárás eredményeként spektrofotometriásan kimutatható az antitestek koncentrációja.

3.4. táblázat - Különböző mikroorganizmusok és tengeri halak olajának zsírsav összetétele (KYLE és GLADUE 1992, Tocher és mtsi.1998)

Óra0244872Roller inokulum
Extinkció E480 nm0,0300,0950,2270,255E480 nm: 0,137

A sejttenyészetek felülúszói ideális estben is csak 10-20 µg/ml koncentrációban tartalmazzák a termelt antitesteket, így sokszor protein A/protein G affinitás-kromatográfiás tisztításuk és koncentrálásuk is szükségessé válik.

A világon négyféle terápiás monoklonális antitest készítményt hoztak forgalomba a fenti emlőssejt eljárás szerint, ezeket úttörő jelentőségük miatt felsoroljuk: Simulect (Basiliximab), Zenapax (Daclizumab), immunszupresszió indukálása renális allograftnál, Reopro (Abciximab) Percutan coronária intervencióhoz társuló cardiális ischaemiás szövődményekre, Herceptin (Trastuzumab) HER2-t overexpresszáló emlőrák ellen.