Ugrás a tartalomhoz

Fermentációs biotechnológia

Dr. Kutasi József (2007)

Glia Kft.

Rekombináns génmódosított termékek

Rekombináns génmódosított termékek

Az élesztőgombák és baktériumok fermentációja során klónozó rendszerek segítségével emberi és állati fehérjék egyaránt előállíthatók, ezek az r-proteinek, azaz rekombináns fehérjék. A géntechnológia rohamos fejlődésével hormonok (inzulin, kalcitonin), véralvadásgátlók (pl. hirudin, antikoaguláns peptidek), valamint oltóanyagként alkalmazható vírus- és baktériumfehérjék DNS szekvenciájának klónozása is lehetővé vált. Eukarióta géneket hasonló módon vektorokkal vagy közvetlenül a kromoszómába beépítve fehérjék halmozódnak fel (gyógyászati célú rekombináns fehérjék).

DNS steril fülke.

A kisméretű fülke DNS mentes steril levegőárammal biztosítja a genetikai munkát.

Gélelektroforézis kád DNS molekulák elválasztására.

A DNS molekulák elválasztásához leggyakrabban olyan porózus gélt használnak, amellyel a molekulák nem reagálnak és amely egyben molekulaszűrőként is szolgál. A pórusok nagyságától függően a különböző méretű DNS-ek vándorlása befolyásolható: ha molekula mérete kicsi a pórusokhoz képest, gyorsan mozog, ha nagy, a DNS szinte mozdulatlan marad a gélben (a pórus mérete változtatható).

PCR (DNS sokszorozó, polimeráz láncreakció ) készülék

DNS polimeráz láncreakció (PCR) segítségével a fontos DNS szakaszt szintetizálhatjuk.A készülék megfelelő hőmérséklettel a DNS-t olvadáspontra hevíti, így a kettős hélix kinyílik, majd a polimeráz enzim a megfelelő DNS szakaszt optimális hőmérsékleten szintetizálja. A készülékben 5-10 mikroliter DNS oldatokkal dolgoznak,így a bepárlódás elkerülésére a kép felső részén látható fejfűtéssel biztosítják az oldatok térfogatának állandóságát.

Sötétkamra bemutatása, UV fényben átvilágított DNS kimutatása gélben CCD kamera és LCD kijelzo segítségével .

DNS mentes levegőt és környezetet biztosító steril fülke, eppendorf centrifugával és PCR készülékkel.

Gyógyászati célú termékek rekombinációs előállítása

A fermentációs termelési célzattal a legsikeresebb az E. coli, Bacillus subtilis, baktériumba, a Saccharomyces bayanus, S. cerevisiae és a Pichia pastoris élesztőgombákba klónozott génekről termelődött – a fermentlébe kiválasztott, expresszálódott vagy a baktériumban, gombában felhalmozódott (inclusion body) - fehérjék. Az első iparszerűen termelt r-fehérje az E. coli baktériumból termelődő r-inzulin volt. Addig sertések hasnyálmirigyéből vonták ki a sertés inzulint és alkalmazták az emberi cukorbetegség gyógyítására. A humán inzulin génről származó inzulin messenger RNS-ről (mRNS), amely az ember hasnyálmirigyéből nagy mennyiségben kinyerhető, elkészíthető az inzulin génjét kódoló c-DNS (komplementer DNS). Ezt a reakciót egy reverz transzkriptáz (fordítva átíró) enzim segítségével lehet végrehajtani. Bár a természetben éppen fordítva a DNS-ről képződik mRNS molekula a fehérjeszintézis során, a kutatók felfedezték, hogy egyes vírusok pl. RNS tumorvírusok (retrovírusok) termelnek ilyen RNS minta alapján DNS-t készítő enzimet.

cDNS készítés vázlata

cDNS készítés vázlata

A reverz transzkriptáz működésének feltétele, hogy a DNS lánc meg legyen kezdve. A poli – Timidin (T) nukleotid láncból elindulva az RNS-ről teljes hosszában hibrid molekula képződik, amelynek egyik szála RNS, a másik DNS lánc. A hibrid molekula RNS részét lúggal elbontják, majd a ma már rutinszerűen használt DNS polimeráz láncreakció (PCR) segítségével a hiányzó DNS szakaszt szintetizálhatjuk. Így elkészült az mRNS-ről készített - kétfonalas c-DNS. Ezt a c-DNS-t un. bakteriális E. coli plazmidvektorba építették. A baktériumokban a kromoszómán kívül gyűrű alakú DNS molekulák találhatók, amelyek képesek átjutni más baktériumok sejtjeibe. Így képesek az antibiotikum rezisztencia képességet is átadni egymásnak, de így lehetséges idegen géneket bevinni baktériumok sejtjeibe, klónozni is.

A cDNS klónozás vázlata

A cDNS klónozás vázlata

Mivel az inzulinfehérje előállítása csak két fehérjeláncból és proinzulinból lehetséges, az inzulin un. fúziós, összekapcsolt fehérjeként keletkezett a baktériumokban. A fehérjeláncba beépítettek egy metionin aminosavat is, így brómciános hasítással elválaszthatók egymástól az egyes láncok, sőt az E. coli sejtekből a kinyerést is meg kellett oldani, hiszen szignál szekvencia – a fehérjének a sejtből a tápközegbe való jutását lehetővé tévő fehérje szekvencia - beépítése itt nem volt lehetséges.

Az aktív emberi r-inzulin kinyerése

Az aktív emberi r-inzulin kinyerése

Laboratóriumi automatizált szupercentrifuga (10000 r.p.m. ).

A gyorsulást és lassulást automatikusan szabályozó centrifuga 15-30000 g nehézségi erővel képes a molekulákat elválasztani egymástól és ülepedési képesség szerint szeparálni egymástól.

Laboratóriumi automatizált centrifuga muködése.

Élesztőkkel, mint eukariótákkal bár bonyolultabb a biotechnológusok dolga, tízszer vagy százszor nagyobb mértékű az esetleges helyesen kifejeződő génről a fehérjék expressziója. A Saccharomyces cerviceae és S. bayanus a rekombináns fehérjeexpresszió legtöbbet alkalmazott szervezete, így a Magyarországon is kutatott rekombináns véralvadásgátló hirudin, illetve a rekombináns csontritkulást gátló kalcitonin hormon előállítása is ezekkel a mikrobákkal valósult meg (Gyógyszerkutató Intézet).

Ugyanakkor a legújabb kutatások szerint a metilotróf Pichia pastoris a gyakorlatban rendelkezik az S. cerevisiae minden előnyével, de még nagyobb fermentációs hozamok valósíthatók meg velük. A TAP (tick anticoagulant peptide)-ot, mint specifikus inhibítorát egy kulcsfontosságú véralvadási faktornak rekombinánsan P. pastorisban sikerült előállítani és a gyógyászatban alkalmazni (1,7 g/l fermentlé).

A biotechnológiai ipar csúcstermékei közé tartoznak a rekombináns antitestek (lásd még immunológiai termékek fejezet). Szignál szekvenciát alkalmazva ezek termeltethetők baktériumokkal, de a termelés csak kis mennyiségű volt. Ezért P. pastorist kezdtek alkalmazni és sikeresen használni a nyúlból származó, a humán leukémiát gátló faktort felismerő antitestek termeltetésére, expresszálására sikerrel. A fehérjék fúzióját ma már elterjedten végzik különböző expressziós rendszerekben pl. a nagy specifitású proteáz enzimek előállításában a mosószeriparban. Ilyen fúziós proteáz az eredetileg a szarvasmarhából nyert enterokináz, amelynek génjét E. coli baktériumból P. pastorisba klónozták. A fermentáció 6,5 mg/liter enzimet eredményezett, de az r-enzim százszor reaktívabb, mint az eredeti natív molekula, mivel a Pastoris élesztő képes részben glikozilálni (cukorláncokat kötni) a termelt fehérjéket, és így az emlős sejtben előállított molekulához hasonlatossá tenni.