Ugrás a tartalomhoz

Fermentációs biotechnológia

Dr. Kutasi József (2007)

Glia Kft.

Egysejt olajok

Egysejt olajok

Az egysejt olajok (single cell oil, SCO) a mikroorganizmusokban felhalmozódó telítetlen zsírsavak összefoglaló jelentése. Nagy mennyiségben fonalas gombák és algák képesek olajcseppek formájában vagy a sejtmembránban felhalmozni. Esszenciális, többszörösen telítetlen (PUFA polyunsaturated fatty acid) ω-3 és ω-6 zsírsavaikat a koleszterinszint csökkentésére, hiánybetegségek gyógyítására és immunstimulálásra alkalmazzák.

Az esszenciális SCO olajok élettani hatásai a humán szervezetre és jelentőségük.

Az ω-3 eikoza-pentaénsav (EPA) és dokoza-hexaénsav (DHA) elsősorban a szív és érrendszeri betegségekben, mint koleszterinszintet-csökkentő és trombózist gátló alkalmazható, így az már ismert, hogy megelőzni vagy kezelni lehet vele érelmeszesedést, trombózist, hypertrigliceridemiát és magas vérnyomást. Az ω-3 zsírsavak csökkentik a vér viszkozitását, akár 15%-kal is, valamint csökkentik a vér koleszterin-szintjét, főleg az LDL (low density lipoprotein) típusút. A gyulladási folyamatokra gyakorolt kedvező hatásukat valószínűleg a prosztaglandinok és leukotriének közötti kiegyensúlyozó szerepük okozza, így kezelhetők velük allergiás betegségek és izületi gyulladások. Kimutathatóan csökkentik a makrofágok prosztaglandin, lipoxigenáz és leukotrién B4 szintézisét. Ugyanakkor immunmodulánsként is alkalmazhatók, mivel serkentik a cytokinek termelődését, sőt daganatos sejtek urokináz enzimaktivitásának gátlásávál egyes tumorsejtek burjánzását is megakadályozzák. A DHA miután bekerül a szervezetbe, néhány óra múlva EPA-vá alakul és így fejti ki hatását. A DHA a humán szövetekben (pl. idegszövetben) sokkal nagyobb százalékban található meg, mint az EPA, de pontos élettani funkciója nem ismert. A legújabb kutatások szerint a DHA a magzat illetve a csecsemők szellemi fejlődéséhez nélkülözhetetlen, így bébitápszerek kiegészítését javasolják DHS-sel. Sőt az idegsejtmembrán fluiditásának növelésével az agy öregedési folyamataira is jótékony hatással van.

Az EPS és a DHS molekulákban a láncvégtől három szénatomnyira helyezkedik el az utolsó kettős kötés, ezért nevezik ezeket ω-3 vagy n-3 zsírsavaknak.

Az EPS és a DHS kémiai szerkezete csupa-cis-5,8,11,14,17-eikoza-pentaénsav

Az EPS és a DHS kémiai szerkezete csupa-cis-5,8,11,14,17-eikoza-pentaénsav

Az EPS és a DHS kémiai szerkezete csupa-cis-4,7,10,13,16,19-dokoza-hexaénsav

Az EPS és a DHS kémiai szerkezete csupa-cis-4,7,10,13,16,19-dokoza-hexaénsav

Az ω-6 esszenciális zsírsav, az arachidonsav (ARA) szintén részt vesz a prosztaglandinok szintézisében, továbbá gyulladásszabályozó, vérzésgátló hatása van, valamint szintén részt vesz a sejthártyák felépítésében. Az AA biológiai aktivitása nem tisztázott, de sok esetben az EPA-val együtt alkalmazzák gyógyszer és gyógyhatású termékek kombinációjában. Az ω-6 zsírsavak kinyerése olíva vagy napraforgóolajokból is lehetséges, ezért biotechnológiai jelentőségük kisebb.

A mikroalgák (egysejtű moszatok) és kisebb koncentrációban a nem termőtestképző, imperfect fonalas gombák - mint egyedüli szervezetek a természetben -, 16 - 18 szénatomszámú telített zsírsavakból képesek többszörösen telítetlen ω-3 EPA és DHA zsírsavakat előállítani. E két zsírsavat az állati és emberi szervezet megfelelő deszaturáz enzimek hiánya miatt csak a 18 szénatomszámú 2 és 3 telítetlen kötéssel rendelkező linolsavból és linolénsavból, mint prekurzorból képes csak szintetizálni. A magasabb rendű növények alacsonyabb szénatomszámú telített zsírsavakból (16 - 18) képesek PUFA-kat előállítani, azonban EPS és DHS szintézisre nem képesek. Ugyanakkor a szinte korlátlan mennyiségben rendelkezésre álló tengeri halak olajából az ω-3 zsírsavak kinyerése ma még olcsóbb, mint az algakultúrákból előállítható EPS-ben és DHS-ben gazdag algaolaj kinyerése. Így gazdaságossági szempontból az algaolaj konkurenciát egyelőre nem jelent a halolaj számára. A mikroalgákból kinyerhető ω-3 zsírsavak jelentősége abban áll, hogy különleges enzimrendszerüknek köszönhetően, mint növényi szervezetek egyedüli forrásai ezeknek a zsírsavaknak és különleges hatású zsírsavszármazékaiknak.

Az esszenciális olajok előfordulása

Az esszenciális politelítetlen zsírsavakat nagyobb mennyiségben először északi-tengeri halak olajában fedezték fel, majd a későbbiekben más tengeri állatokban is kimutatták. Kiterjesztették a vizsgálatokat a halak beleiben élő baktériumokra, gombákra és végül a fitoplanktonra is.

3.1. táblázat - Különböző mikroorganizmusok és tengeri halak olajának zsírsav összetétele (KYLE és GLADUE 1992, Tocher és mtsi.1998)

OrganizmusokTeljes zsírsavtartalom (%-ban) 25 ℃
Organizmusok14:016:016:118:018:118:218:3ARAEPADHA
20:420:522:6        
Baktériumok          
Sevanella sp.????????1012
Vibrio sp.228        
Gombák          
Mortierella alpina (20-17)-16-82114-28L1-
M. alpina+;α-linolinsav-6-39928345-
Élesztők          
Candida curvatum-2811444102---
C. curvatum mutant R22.102-26-411684---
Mikroalgák          
Cyclotella cryptica12194232---6-
Phaeodactylum tricornutum62231-1633-20,7-
Chlorella minutissima-21,17,40,77,36,114,73,24,63,6
Halolaj71413312222179

Régóta ismert, hogy egyes algák sejtjeiben, mint anyagcsere termékek, lipidek halmozódnak fel. A 70-es években már felfedezték a Botryococcus braunii a zsírsavakat lipidcseppek formájában kiválasztó teleptestű zöldalga fajt, igaz esszenciális lipideket nem termel.

Botryococcus braunii Kütz olajtermelő alga mikroszkópos képe

A 70-es években már felfedezték a Botryococcus braunii a zsírsavakat lipidcseppek formájában ( a képen jól láthatók a kiszabadult olajcseppek) a sejtekből kiválasztó teleptestű zöldalga fajt. Igaz esszenciális lipideket nem termel, viszont mint alternatív üzemanyagtermelő algát tartják számon

A tengeri egysejtű mikroalgákban jelentős mennyiségben van jelen EPA és DHA a kovamoszatokban (Bacillariophyta), egyes zöldmoszatokban (Chlorophyta), és a vörösmoszatokban (Rhodophyta). Édesvízi algafajok közül a kovaalgák (Bacillariophyta) és a dinoflagelláták (Dinoflagellata) képesek számottevő mértékben telítetlen zsírsavszintézisre és felhalmozásra. A Centralesekhez tartozó Cyclotella cryptica biomassza szárazanyagának mintegy 22,0% politelítetlen zsírsav, amiből 80-90% eikoza-pentaénsav, a szárazanyagtartalom 17,4 %-a, ami a tengeri fajok EPA termelésének mintegy 3-4 szerese.

A waterlooi (Canada) egyetem munkatársai több tengeri és édesvízi algatörzs lipidtartalmát vizsgálták meg. Az eredményeket a két táblázat mutatja be.

3.2. táblázat - Mikroalgák zsírsav- és EPA összetétele rázott lombikos kultúrában néhány halfajjal összehasonlítva (KYLE és GLADUE 1989)

 BiomasszaEPA tartalom (%)
 zsírsavtartalma (%)LipidbenBiomasszában
Mikroalgák   
Cylindrotheca fusiformis24,47,21,8
Navicula pelliculosa25,49,02,3
Nitzschia angularis7,724,72,2
Porphrydium cruentum6,83,70,3
Pavlova gyrans21,08,31,7
Prymnesium parvum12,023,32,8
MK8620[a]40,112,65,1
Halak   
Tőkehal1,811,00,2
Baráthal3,80,10,1
Lazac19,09,61,8

[a] szabadalmaztatott tengeri kovaalgatörzs (Martek Bioscience)


3.3. táblázat - Jól szaporodó algák biomasszája és lipidtartalma (YANGMANITCHAI és WARD 1989)

Mikroalgákszárazanyag (mg/l)Lipidtartalom a szárazanyag %-ban 
Chlorella minutissima UTEX 221948314,3 
Dunaliella primolecta MBAUK81138617,4 
D. tertiolecta MBAUK 83124715,3 
Nannochloris oculata UTEX LB146314,3 
Phaeodactylum tricornutum UTEX 640248517,4 
P. tricornatum UTEX 646163813,7 
Porphyridium cruentum UTEX 161180416,7 

A politelítetlen zsírsavak (PUFA egysejtolajok) bioszintézise mikroszervezetekben.

A telítetlen zsírsavak a sejtben egyrészt, mint tartalék tápanyagok halmozódnak fel, másrészt a sejtmembrán szerkezetének és a fotoszintetikus membránok működésének megőrzésében játszanak szerepet. A hidegtűrő algák membránlipidjeinek telítetlen zsírsavtartalma alacsony hőmérsékleten megemelkedik, így hárítva el a membrán dermedését, és a fotoszintetikus apparátus működésképtelenségét. Általában a mikroorganizmusok sejtmembránjában, illetve citoplazmájában megjelenő többszörösen telítetlen esszenciális egysejtolajok biológiai funkciója azonban ismeretlen, sőt a mikroalgák EPA tartalma és a hőmérséklet változása között közvetlen összefüggés nem mutatható ki.

Az EPA és DHA bioszintézisének útjára többféle, részben kapcsolódó feltételezés van. Az ω-3 zsírsavak szintézise azonos bioszintézis úton valósul meg, míg az ω-6 zsírsavak szintézise más úton valósul meg. A két eltérő szintézis út között azonban lehetséges kapcsolat, ennek eredményeként egyes deszaturáz enzimek közreműködésével az ω-6 zsírsavból az arachidonsavból (ARA) EPA szintetizálódhat.

Telítetlen zsírsavak szintézise mikroorganizmusokban (YANGMANITCHAI és WARD 1989)

Telítetlen zsírsavak szintézise mikroorganizmusokban (YANGMANITCHAI és WARD 1989)

abra_065-text

abra_065-text

Telítetlen zsírsavak feltételezett szintézise algákban (COHEN et. al 1993 és Pereira 2004)

Telítetlen zsírsavak feltételezett szintézise algákban (COHEN et. al 1993 és Pereira 2004)

Az, hogy a többféle bioszintézis út közül melyik valósul meg, főleg a tenyésztési körülményektől (hőmérséklet, fény, tápanyagok) függ. A telítetlen kötések keletkezéséhez a deszaturáz enzimek működése szükséges. Ezek az enzimek főleg alacsony hőmérsékleten és limitált körülmények között lépnek működésbe. Mikroalgáknál a nitrogén, foszfor hiánya és a fényintenzitás fokozása játszik lényeges szerepet. A táblázatokból jól látszik, hogy míg a gombáknál a hőmérséklet a telítetlen zsírsavszintézis indukálásának fő tényezője, a mikroalgánál a hőmérséklet nem befolyásolja jelentősen az EPA tartalmat. Sótűrő algáknál limitáló tényezőként jöhet még szóba a nátrium-klorid koncentráció növelése, valamint kovaalgáknál a nátrium-szilikát koncentráció csökkentése.

Egyes telítetlen zsírsavak (pl. az olajsav), és egyes herbicidek a deszaturáz enzimeket kódoló gének működését szabályozó regulátor proteineket gátolni képesek, vagyis koncentrációjuktól függően megy végbe a deszaturáz enzim gének expressziója. Az összes lehetséges lánchosszabbító (elongációs) és deszaturációs (Δ) lépéseket az ábra mutatja.

Az ω-6 és ω-3 politelítetlen zsírsavak bioszintézise a lehetséges elágazási pontokkal. (n, ahol n jelzi a keletkezett kettőskötés helyét) (KYLE és GLADUE 1992)

Az ω-6 és ω-3 politelítetlen zsírsavak bioszintézise a lehetséges elágazási pontokkal. (n, ahol n jelzi a keletkezett kettőskötés helyét) (KYLE és GLADUE 1992)

A tapasztalatok azt mutatják, hogy a fotoszintetizáló szervezeteknél a deszaturációs lépések az EPA-ig haladnak, és csak néha jut tovább a DHA-ig. Ha azonban ezeket a szervezeteket - pl. tengeri Nitzshiákat, Chlorellákat és Dinoflagellatakat - heterotróf (sötét, szerves szénforrás) körülmények között sikerrel tenyésztik, a megváltozott körülmények hatására a végtermék DHA lesz.

EPS és DHS forrás egysejtolaj termelő algák fejlesztése

A tengeri halakból kinyert EPA és DHA tartalmú halolaj nagyon sok zavaró szennyeződést tartalmaz. Sokszor olyan anyagok vannak jelen, amelyek az oxidációra érzékeny telítetlen zsírsavakat oxidálják, esetleg élettanilag antagonista bioaktív zsírsavak (pl. arachidonsav, koleszterin) vagy nem ritkán a halak szervezetében felhalmozódó mérgező anyagok [pl.poli- klór-benzoénsav (PCBA)] teszik lehetetlenné a halolaj felhasználását ráadásul a halolajból készült terméknek kellemetlen halszaga és halíze van.

Az algák gazdaságossági szempontból megfelelő alternatív EPA, DHA forrásnak tekinthetők a többi mikroorganizmussal szemben. Szubmerz kultúrában tenyészthető fonalas gombák csak alacsonyabb hőmérsékleti viszonyok között (12-l7 ℃) adnak megfelelő (antagonista zsírsavaktól, pl. arachidonsavtól mentes) hozamot (20-112 mg EPA/1). Baktériumok tenyésztésénél az utóbbi időkig csak alacsony hozamot lehetett megfigyelni (10-26 mg EPA/1, azonban új kutatási adatok szerint hidegtűrő tengeri baktériumok többszörös hozamot is produkálhatnak.

Szennyeződések és antagonista bioaktív zsírsavak az alga nyerstermékben (biomasszában) nem lehetnek jelen. Az algaolajban található EPS és DHS oxidációval szembeni érzékenysége kisebb (stabilabb), mint a halolajban, a potenciális terméknek halszaga és halíze nincs. Míg a halolaj az EPS és DHS mellett igen sok telített, illetve alacsony telítettségű zsírsavakat is tartalmaz kb. 60-70 % mennyiségben, addig a hasonló mennyiségben EPS-t tartalmazó algaolaj csak kb. 30% alacsony telítettségű zsírsavat és kb. 40% arányban élettanilag aktív klorofillokat, karotinoidokat és xantofillokat - köztük különböző vitaminokat és vitamin előanyagokat (B l, B2, B6, B 12, biotin, béta-karotin) – tartalmaz.

EMS (etil-metil-szulfonát, mutagén) kezelés hatására olyan un. olajszerű törzseket izolálhatunk, amelyek sejtjeiben nagyobb mennyiségben halmozódnak fel telítetlen zsírsavak. Tengeri és édesvízi Chlorella protoplasztok fúziójával létrejött regenerált hibrid törzstenyészet EPA termelésének növekedését regisztrálták. Prokarióta kékalgák esetében - közvetlenül a genetikai állományba beavatkozva - vektorokkal zsírsav-deszaturáz enzim géneket a sejtekbe juttatva, olyan hidegtűrő transzformánsokat hozhatunk létre, amelyek sejtmembránjában telítetlen zsírsavak (pl. linolsav) halmozódnak fel.

Szaporodásukhoz fényt nem igénylő heterotróf algatörzsekkel elsősorban magas DHA hozamot sikerült elérni. Amerikai kutatók egy Nitzshia alba törzs nagy tömegű tenyésztését oldották meg ahol a DHA arányaiban nagyobb mennyiségben termelődik, mint a fotoszintetikus viszonyok között az EPA. A Martek Corporation gyógyszergyártó cég a csecsemők agyi fejlődését elősegítő, egy Dinoflagellata heterotróf algából kinyert DHA hatóanyag tartalmú gyógytápszert szabadalmaztatott. A közlemény szerint a fototróf algáknál nagyságrendekkel nagyobb DHS hozamot sikerült elérni (4 g DHA /liter fermentlé). Irodalmi adatok szerint a heterotróf Dinoflagelláták DHS termelőképessége az 1960-as évek óta ismert, ugyanakkor nagy tömegű tenyésztésük ez ideáig nem volt megoldott. Kínai kutatók egy Nitzshia levis kovaalga heterotróf perfúziós tenyésztése során 1112 mg/l EPA koncentrációt értek el. Természetesen nagy előny, hogy szaporodásuk fényt nem igényel, de a szénforrásként a kultúrához adagolt glükóz jelenléte nagymértékben megnehezíti a steril, fertőzésmentes fermentációt, és ezt nehezíti a heterotróf kultúra szerves-nitrogén igénye (élesztőkivonat) is. Mixotróf kultúrák létrehozása hasonló gondokat vet fel, kiegészítve a megfelelő fényviszonyok kialakításával. Továbbá a 4-6 napig tartó, 100-150 órás tenyészidő, valamint a speciális eszköz és készülék igény (pl. perfúziós technika) különösen bonyolulttá teszi az ilyen típusú fermentációk kivitelezését. Színtelen algakultúra lombikban Tengeri algakultúrákkal megfelelő megvilágítás mellett 20-25 ℃C-on 1 hét fermentálással 50-60 mg EPA/1 hozamot lehet elérni. Az Egyesült Államokban 0,5 m3-es fotobioreaktorban 2 hét tenyésztéssel 2 kg olajban gazdag - 5-6 % EPA / gramm - algaport (KYLE és GLADUE 1989), míg Portugáliában nyitott medencékben 74 nap folyamatos tenyésztés során 4 g/m2/nap - 3,9 % EPA / gramm - algaszárazanyagot állítottak elő (VELOSO et al. 1991).

Akut tejsav acodozis

Akut tejsav acodozis

Táblázat EPS, DHS és AA tartalmú olaj (SCO) fermentációs gyártása fotobioreaktorban, valamint SCO táplálék-kiegészítők és gyártóik

Táblázat EPS, DHS és AA tartalmú olaj (SCO) fermentációs gyártása fotobioreaktorban, valamint SCO táplálék-kiegészítők és gyártóik

A politelítetlen esszenciális ω-3 zsírsavak nagy tömegű felhasználása takarmányadalékként

Az emlősök és madarak szervezetében a PUFA-ak bioszintézisénél a zsírsavak telítetlensége (deszaturáció), illetve lánchossza (elongációval rövidülve) csak korlátozott mértékben változhat. A deszaturáció olyan szabályozottságú, amely nem teszi lehetővé az első hat szénatom között a kettős kötés kialakulását, ezért a tápláléknak ezeket tartalmaznia kell.

A tenyészállatok esetében a tojótyúkok esszenciális PUFA ellátottsága hatással van a tojások méretére és minőségére. A tojás nagysága csökken, ha az esszenciális zsírsavakból a takarmány nem tartalmaz eleget. Amikor a tojás nagysága csökken a tojás sárgája lesz kisebb, ami azzal jár, hogy kevesebb lesz a tojás zsírtartalma. Továbbá a megfelelő zsírsavellátás a tyúktojás minőségét kedvező irányban befolyásolja, mivel a tojás magas koleszterinszintjét a beépülő EPA és DHA ellensúlyozni képes (okostojás kép). Mindezek a hatások elérésére EPA-t és DHA-t tartalmazó tengeri halak (makréla, hering, lazac) olaját (spray formában) juttatják a tojótápokba átlagosan 1,0% EPA és DHA-t tartalommal. Ugyanakkor a megfigyelések azt mutatják, hogy az ilyen táppal való folyamatos etetés a tojók kiegyensúlyozatlan zsírsavellátását és a tojáshozam csökkenését okozza. További probléma a folyékony formában kijuttatott EPA és DHA gyors oxidációja, valamint hogy a túlzott mennyiségben etetett - több más zsírsavat is tartalmazó - halolaj kellemetlen mellékízt ad a tojásnak. A mellékhatások és az oxidáció kivédésére a halolajat szárított formában és csökkentett mennyiségben (0,2% EPA és DHA tartalomig) próbálják adagolni.

Ez utóbbi eljárásnak megfelelő versenytársa lehet a biotechnológiai úton - fonalasgombák vagy algák (köztük fényt nem igénylő Dinoflagelláták) fermentációjával - előállított EPA és/vagy DHA tartalmú biomassza. A fényt nem igénylő heterotróf algatörzsek a gombáknál és a fofototróf algáknál négyszer-ötször nagyobb DHA tartalmú (20% DHA az algaszárazanyagban lásd fent), és egy nagyságrenddel nagyobb mennyiségű biomasszát állítanak elő (20-25 g/liter).