Ugrás a tartalomhoz

Fermentációs biotechnológia

Dr. Kutasi József (2007)

Glia Kft.

Szerves savak

Szerves savak

A trikarbonsav ciklus szinte minden sava előállítható mikrobiológiai úton. A trikarbonsavak biológiai előállításával kapcsolatban már mintegy 50 éve több laboratóriumi és ipari kísérletet folytattak már, de előállításuknak – a citromsav kivételével - erős konkurenciája a kémiai szintézis (tejsav, ecetsav, almasav, alfa-keto-glutársav). Ipari mennyiségben biológiai úton citromsavat és a speciális itakonsavat, kojisavat (Japán) állítanak elő. Biológiai úton többféle módon lehet előállítani ezeket a savakat, egyrészt lehet klasszikus fermentációs utakon szubmerz és felületi tenyésztéssel fonalasgombákból (Aspergillus fajok,) de immobilizált sejteket is felhasználnak, többek közt baktériumokat (Brevibacillus, Rhizopus, Propionibacterium, Leuconostoc, Acetobacter fajok) és élesztőgombákat.

Almasav

Almasav

Almasav

Az almasav a citrát kör egyik lépésekor fumársavból keletkezik. Eddigi kutatások során kétfelől próbálták megközelíteni az almasav termelését: egyrészt a citromsav-ciklus során létrejövő almasav termelődéséért felelős enzimet kódoló gént vizsgálták, ami a fumársavból hoz létre almasavat. A másik esetben pedig a reduktív citromsav ciklus során termelődött almasav termelődéséért felelős enzim génjét, ami az oxálacetátból állít elő almasavat. Az előbbi esetben a fumaráz génjét (fum1), az utóbbi esetben a malát-dehidrogenáz génjét (mdh2) vizsgálták (lásd a Rekombináns termékek fejezetben).

Citrát kör-alapú termeltetés

Egy Saccharomyces bayanus törzs képes ipari mennyiségű almasav termelésére, amennyiben a sejteket permeabilizálják.

Saccharomyces élesztőgomba telepek.

A sör, bor és bioalkohol gyártásnál valamint az állattakarmányozásban probiotikumként is alkalmas Saccharomyces cerevisiae élesztőgomba kompakt fehér telepei agarlemezen.

Először szuszpendálni kell pufferben 7,0 pH-on egy órán át, mosás desztillált vízzel, majd újra 0,1 M H2PO4/K2PO4-pufferrel. Ezután a mosott sejteket szuszpendálni kell különböző detergensekkel, majd centrifugálni. Ezután a szuszpenzióból 35 g/l töménységgel lehet enzimatikus vizsgálatot végezni. Az almasavat spektrofotometriásan vagy HPLC-vel lehet ezután vizsgálni.

A citrát kör

A citrát kör

Magyarázat: AC: ecetsav, Cit: citromsav, ICIT: izocitromsav, αKG: alfa-ketoglutársav, SOCCOA szukcinil oxalát, SUCC: szukcinilsav, FUM: fumársav, MAL: almasav, OAA: oxálacetát

Reduktív citrát kör-alapú termeltetés

A második megközelítési módon végeztek olyan kísérletet, amikor a malát-dehidrogenáz génjét (mdh2) többszörös kópiában vitték be a sejtbe. A malát-dehidrogenáz a citromsav-ciklus esetében az almasavból oxálacetátot alakít, míg a reduktív citrát kör esetében fordítva. Olyan kondíciót kell létrehozni, ami ez utóbbi anyagcsere-útnak kedvez. Ilyenkor a citoplazmában termelődik az almasav.

Reduktív citrát kör

Reduktív citrát kör

A reduktív citrát kör egy ősi anyagcsere út, ami a szén-dioxid asszimilációjához szolgál, és a citoplazmában megy végbe. Ez az anyagcsere-út nem megy végbe minden szervezetben, a bíbor-kén baktériumok esetében tanulmányozták ezt az anyagcsere utat és élesztőkben is működik.

Ha a közegben a C:N arány nagy, vagyis alacsony a nitrogéntartalom, valamint magas a karbonát, az élesztőben végbemegy a reduktív citrát ciklus. A citromsav ciklus esetén az almasavból a malát–dehidrogenáz enzim oxálacetátot hoz létre. Ez a reakció reverzibilis. Ilyenkor az almasav a fumársavból jön létre fumaráz enzim segítségével. Ez a reakció viszont irreverzibilis, vagyis a fumaráznak jóval nagyobb az affinitása az enzimhez, mint az almasavnak, így inkább az almasav képződés irányába megy a reakció. Tehát a reduktív citrát kör esetében az almasav jobban halmozódik fel, mint a citrát kör esetében. Mivel így nincs szükség az almasav továbbalakulásáért felelős enzim génjének inaktíválására, kiütésére, kevesebb molekuláris beavatkozást igényel.

Immobilizált élesztősejtek fermentációja

Az eddigi kísérletek során immobilizált élesztősejteket tartalmazó bioreaktor segítségével végezték a leghatékonyabb almasav-termeltetést. Ez egy olyan kamra, ami három részből áll, és az egyes részek speciális folyadékmembránnal (SLMs) vannak elválasztva. Az első rész a tápláló rész, ahol a prekurzort adagoljuk, ami a citrát kör alapú termeltetés esetén a fumársav, reduktív citrát kör esetében pedig az oxálecetsav. A második rész a reakciótér, ami összeköttetésben áll az immobilizált élesztősejteket tartalmazó oszloppal. A reakciófolyadék folyamatosan áramlik reakciótér és az oszlop közt. A harmadik rész pedig a terméktér, innen kell elvezetni az almasavat. A membrán szeletíven engedi át az anyagokat. Az első a prekurzor anyagot engedi át, a második pedig a terméket. A reakciótér és a terméktér közti membrán már kizárólag az almasavat engedi át. Az anyag antiport-elven áramlik úgy, hogy a szervetlen komponensek vándorolnának az ellentétes irányba. A terméket HPLC segítségével analizálták, vizsgálva hogy a prekurzor hány százaléka alakult át almasavvá.

A bioreaktor sematikus ábrája

A bioreaktor sematikus ábrája

Citromsav

Citromsav

Citromsav

Immáron több mint 100 éve ismert, hogy a penészgombák citromsavat termelnek. Az 1920-as évektől felületi tenyésztéssel megkezdték fermentációs gyártását, ma elsősorban szubmerz rendszerben fermentálnak. A citromsavat óriási mennyiségben az élelmiszeripar és gyógyszeripar használja ízesítésre, konzerválásra.

Citromsav gyártás

Citromsav gyártás

Eljárások

Elsősorban Aspergillus niger fonalas gombával állítják elő felületi és szubmerz tenyésztéssel egyaránt.

Aspergillus penészgomba telepek.

Az enzimtermelő fonalas gomba Aspergillus niger fehér szálas telepei jól látszódnak fekete háttérrel.

Aspergillus niger gombafonalak.

Aspergillus niger gombafonalak.

citromsavnak mint primer anyagcsereterméknek a legfontosabb prekurzora, szénforrása a glükóz. A piruvát acetil-CoA képződés közben dekarboxileződik és az acetátmaradék belép a trikarbonsavciklusba (lásd citrát-kör ábrája). Kulcsenzim a citrát szintetáz, de mivel a sejtek növekedése a trikarbonsav ciklusból köztes termékeket von el, az így keletkezett hiányokat anaplerotikus reakciók pótolják. Ezek az acetil-CoA akceptorát az oxálacetátot pótolják, ilyenek pl.: piruvát – karboxiláz, foszfo-enol-piruvát-karboxi-kináz, izocitrát-liáz. A felületi(SSF) eljárást A. niger spórák tenyésztésével búzakorpán végzik, csökkentett pH-án sterilezve, majd 28 °C-on 5-8 napig tálcákon inkubálva. A kész penészes búzakorpából forró vizes extrakcióval vonják ki a citromsavat.

Folyékony tápoldatokkal is végeznek felületi tenyésztést. Hátránya a nagy befertőződési veszély, viszont túlmelegedésre kevésbé képes a rendszer, így egyszerűbb technika elegendő.

A szubmerz eljárások 10-15%-os cukor konverzióját elsősorban melasz alapanyagokból biztosítják, de burgonyakeményítőt és izocukrot is alkalmaznak. A citromsavképzés érzékeny az egyes nyomelemek jelenlétére, ezeket a melaszok megfelelő mennyiségben tartalmazzák, ugyanakkor a ppm (mg/kg) mennyiség túllépése már káros. A melaszokat, ezért a fémek kicsapására, kálium-hexaciano–ferráttal kezelik. A túlzott elsavanyosodás ellen kálcium-karbonát adagolással helyesbítik a pH-át.

Az A. niger oltóanyagot u.n blake üvegekben szaporítják el és spóráztatják szilárd agar táptalajon, majd ezeket a spórákat oltják szubmerz kultúrába, ahol 32 C- on csíráznak, és 24 óra alatt a fonalak pelleteket képezve elszaporodnak. Ezekkel a pelletekkel közvetlenül olthatók a nagyobb térfogatok. A termelő fermentációt alacsony pH-án (2,0-3,0) folytatják, ezért a savak elleni védelem miatt a rozsdamentes acél fermentorokat műanyagokkal kell borítani. (Magas vastartalom kioldódása esetén oxálsav képződik, és sárga pigment jelzi a fermentáció rossz irányát.) A tenyészetek bár kis oxigénigényűek, a szén-dioxid tartalom növekedésével a citromsavképzési ráta csökken. A feldolgozás során a melléktermékként keletkező kis mennyiségű oxálsavat kálium-oxalátként kicsapatják, miközben a citromsav monokalcium-citrátot képez. Végül a citromsavat a micéliumtól leválasztva forró (70-90 C) vízben kicsapatják és megszárítják.

Itakonsav

Itakonsav szerkezeti képlet

Itakonsav szerkezeti képlet

Az itakonsav előállítására az Aspergillus itaconicus és A. terreus törzsek képesek. Az itakonsav saját észtereivel és más monomerekkel kopolimereket képez, melyeket a tapéta, papír és ragasztóanyag gyártás egyaránt felhasznál. Szintén a trikarbonsav ciklusban a cisz–akonitsavból dekarboxilálással keletkezik. Az itakonsav szintéziséhez a citromsavhoz hasonlóan fontos egyes nyomelemek jelenléte (réz, cink ppm. koncentrációban), valamint érzékeny vas jelenlétére, amennyiben a ppm mennyiséget a vas koncentrációja meghaladja, a termelés lecsökken.

Ecetsav

Az ecetsav baktériumok. Acetobacter aceti (A. peroxidans, A. pasteurianus) befejezetlen oxidáció során az etanolt ecetsavvá oxidálják. Egyes fajok teljesen vízzé és szén-dioxiddá is képesek túloxidálni az etanolt, ez a termelés során káros. A Gluconobacter csoportjai az ecetet nem képesek tovább bontani.

Etanol oxidációja ecetsavvá

Etanol oxidációja ecetsavvá

A törzsek az oxidációhoz nagy mennyiségű oxigént igényelnek. Ez azért is fontos, mert levegőztetés hiányában az 5-12% etanol koncentráción a sejtek gyorsan elpusztulnak, míg megfelelő oxigénellátás mellett 12% etanolból 12,4% ecetsavat képesek előállítani.

A legősibb eljárás szerint felszíni fermentáció során a bor felületén növesztették a tenyészeteket, kis hatásfokkal. Továbblépés volt a szilárd felületi tenyésztés ahol bükkfaforgácsra permetezték a cefrét, ez volt az u.n ecetgenerátor. A forgács felületén szaporodtak el az ecetbaktériumok és alulról levegőztetve a rendszert, értek el a szubmerz tenyésztéshez hasonló hatásfokot. A szubmerz eljárások óriási 3-4 vvm levegőt igényelnek, ezért ezeket elsősorban kis etanolkoncentrációjú cefrékre dolgozták ki, itt nem kritikus a levegőztetés megszakadása. Az elkészült ecetes tenyészet a baktériumoktól zavaros, ezért steril szűrést hajtanak végre.

Tejsav

Tejsavképzés glükózból

Tejsavképzés glükózból

A tejsav neve az állni hagyott tejsavbaktériumok hatására megsavanyodott tejből ered. Tejsavas erjedés játszódik le káposzta és uborkasavanyításnál, takarmányok silózásánál.

Lactobacillusok (L. delbrückii, L. bulgaricus, L. pentosus) képesek homofermentatív - melléktermék nélküli - tejsavas erjesztésre. Itt a lehető legtöbb glükóz metabolizálódik tejsavvá. A fementációt 12-13% glükózkoncentráción 45-50 °C-on anaerob végzik 48-72 órán át B vitaminok adagolása mellett. Erős konkurenciája a kémiai szintézis.

Élelmiszeripari fermentációval előállított tejsavas erjesztésű termékek

A termékek előállításában résztvevő mikroorganizmusok döntően meghatározzák a termékek külső megjelenését, texturáját, ízét, illatát, biológiai értékét. Ha a tejipari termékeket az alkalmazott fermentációs műveletek alapján osztályozzuk, akkor a következő termékcsoportokat különböztetjük meg:

  • savanyító kultúra: túrók, fehér sajt, savanyú krém és aludttej

  • savanyító és aromaképző szintenyészet kultúra: kefir,(kumisz), joghurt, tejföl

  • savanyító, oltóenzimes, érlelő szintenyészet kultúrák: sajtféleségek (700-nál több féleség)

A fermentációk során: tejsav, citromsav, illó aldehidek és ketonok, acetil-metilkarbinol, diacetil adják a termékek jellegét. A sajtok esetében fehérjebontó (proteázok, peptidázok) zsírbontó (lipázok), aminosavak katabolizis (dekarboxiláz, deamináz) tevékenység is zajlik az érlelés hosszú fázisa alatt. Ezeknek az ízanyagoknak a forrásai maguk a baktérium vagy penész kultúrák és az egyes organizmus törzsek tulajdonságai meghatározzák sajtok ízét, zamatát.

A biológiailag tartósított zöldségfélék esetében 2,5 – 6,0%-os sóoldatban tenyésző tejsavtermelő mikroorganizmusok (pl. Lactobacillus plantarum) és néha Saccharomyces cerevisiae-vel keverten végzik a savanyítást. Kovászos uborka, savanyú káposzta, és más spontán vagy színtenyészettel előállított termékek készülnek ezzel a művelettel.

Kukorica és cassava savanyú készítmények: Európában kevéssé ismert, de trópusi országokban elterjedt savanyított készítmények. Afrikai országokban 1-3 napig vízben áztatott kukorizát aprítanak, majd tésztaszerű képződménnyé gyúrják. Induláskor Corynebacterium oltótörzs hidrolizálja a keményítőt és bizonyos mennyiségű tejsavat is képeznek. Ezután Aerobacter fajták fokozzák a tejsavtermelést. Saccharomyces cerevisiae hozzáadásával az íz- és aroma anyagok mennyisége nő. Végül Candida mycoderma és a S. cerevisiae-vel kialakítják a végső íz és aroma tartalmat. Ezután főzéssel adják meg a végső jelleget. A cassavából reszeléssel puplpot készítenek és fermentálják Corynebacterium törzsekkel. A megnőtt tejsav mennyiség okozta savanyú közegben beindul a Geotrichum fajták szaporodása is, amely törzs a HCN -glükozidok hidrolízisét végzi, ezenkívül aldehidek és észterek képzésével jellegzetes íz- és aroma anyag kialakulás is bekövetkezik. Szárítás és aprítás után néhány hónapig felhasználható önállóan, vagy egyéb lisztekkel keverve.