Ugrás a tartalomhoz

Fermentációs biotechnológia

Dr. Kutasi József (2007)

Glia Kft.

Vitaminok

Vitaminok

A mikroorganizmusok felhasználhatók vitaminok, pl. tiamin, riboflavin, folsav, pantoténsav, piridoxal, B12 vitamin előállítására. A baktériumok és élesztőgombák a legtöbb vitamin előállítására, vagy azok előanyagainak, u.n. prekurzorok szintézisére egyaránt képesek. Ipari méretekben a B12 vitamin és a riboflavin, valamint az A-provitamin béta – karotin mikrobiális előállítása lehetséges. Az astaxanthin bár nem vitamin, mint új antioxidáns hatású karotinoid szintén ebben a fejezetben kerül taglalásra.

B12 vitamin (ciano-kobalamin)

B12 vitamin (ciano-kobalamin)

B12 vitamin (ciano-kobalamin)

Ezt a vitamint kizárólag mikroorganizmusok szintetizálnak és az emberi szervezet a táplálékból vagy a bélflóra által termeltből fedezi szükségletét. Legegyszerűbb előállítása is ez utóbbin alapul, mivel a szennyvíziszap kg-onként 4-10 mg-ot tartalmaz, azonban a különböző szennyező anyagoktól való elválasztása miatt mégis költséges. Külön fermentációs eljárásokat dolgoztak ki szennyvíziszapból származó baktériumpopulációkkal illetve Bacillus, Streptomyces, Kleibsella, Propionibacterium, és Pseudomonas törzsekre.

Bacillus tenyészet oltókaccsal szélesztve.

A Bacillus cereus tenyészetbe mártott oltókaccsal a baktériumtenyészet kiszéleszthető, 24 óra 35 C-os inkubálás után önálló baktériumtelepek is nyerhetők. Érdekes formák is rajzolhatók,akár színes baktériumtenyészetekkel is, melyek 24 óra múltán válnak láthatóva. Ezzel a technikával maga Fleming az antibiotikum feltalálója is szórakoztatta magát üres óráiban.

Liofilizált tenyészetek ampullákban

A törzseket ampullákba zárva "liózzák" is a képen látható módon évtizedekig tárolhatják.

Előállítása

Minden eljárásban közös, hogy kobaltsók hozzáadásával (10-100 mg) tenyésztenek metanol, izopropanol, etanol alkoholos, illetve propándiol, dekánok vagy paraffin szénforrásokon. Szénhidrogéneken nem lehet elérni megfelelő hozamokat. A szennyvíziszapból kitenyészthető kevert baktériumpopulációk lehetnek a leghatékonyabbak, ahol anaerob eljárásban (levegőtől elzárt) metanolos tenyésztéssel 30-35 mg/l koncentráció érhető el.

Szintén anaerob eljárásban Propionibacterium 2-4 napos tenyészeteiben a dezoxiadenozil-kobinamid képződik, míg egy második 3-4 napos aerob fázisban dezoxiadenozil-kobalamin képződhet.

Egylépcsős aerob folyamat a Pseudomonas tenyészetek B12 vitamin előállítása azzal a megkötéssel, hogy a kobalt mellett 5,6-dimetil-benzimidazolt is adagolni kell. A hozamot javíthatja még a betain is, ezért a jó betainforrás melaszt is adagolnak a fermentáció során a táplevesbe.

B12 vitamin előállítása

B12 vitamin előállítása

A kobalamin teljes mennyiségben intracellulárisan a baktériumsejtekben halmozódik fel, ezért a tenyészeteket hőkezelésnek vetik alá (pl. sterilezés 12125-30 perc), így az élő baktériumok szétesnek és elpusztulnak. Az oldatba vitt kobalamint cianokobalaminná alakítják és a 80%-os Cnyersterméket állattakarmányként vagy további tisztítás után gyógyszerként használják fel.

B2 vitamin (Riboflavin)

A rivboflavint sok gomba és baktérium szintetizálja. Kémiai szintézise is lehetséges, ezért erős versenyben áll a mikrobiológiai előállítással.

Riboflavin

Riboflavin

Ismert, hogy Clostridium, Mycobacterium, Candida, Pichia törzsek egyaránt képesek riboflavin előállításra. Két tömlősgomba törzset vontak termelésbe az Eremothecium ashbyii és az Ashbya gossypii-t. Mindkét törzs 2000-6400 mg riboflavint képes szintetizálni micéliumhoz kötve és fermentlébe kiválasztva. A fermentáció kukoricalekvár és glükóz alapú, amelyet energiaforrásként szolgáló lipidekkel (pl. szójaolaj) egészítenek ki. A versenyképes fermentációs eljárást hátráltatja, hogy viszonylag hosszú, 7 napos steril tenyésztést igényel 29 °C hőmérsékleten. Több száz köbméterben nyilvánvalóan ilyen fermentációt folytatni költséges eljárás. Továbbá a riboflavint hőkezeléssel kell a micéliumoktól szabaddá tenni.

Bioszintézis

Bioszintézis

Karotinoidok

A karotinoidok kizárólag növényi vagy mikrobiális eredetűek. 40 szénatomos poliizoprének, melyek konjugált kettős kötéseket tartalmaznak. Többségükben alfa- vagy béta-ionon gyűrűket találhatunk a molekula két végén. Két nagy csoportjuk van: az egyik a karotinok: alfa, béta- karotin és likopin, a másik a xantofilliok csoportja: lutein, violaxanthin, neoxanthin, zeaxanthin, flavoxanthin, luteinepoxid, astaxanthin és antheraxanthin a leggyakoribbak. Mindegyik karotinoid az aciklusos poliénből, a likopinból vezethető le, amely 11 konjugált kettőskötést tartalmaz. A karotinoidok szénhidrogénláncot, a xantofillok oxigenált szénláncot tartalmaznak. A karotinoidok sokszor zsírsavésztetek formájában növények és algák olajtartalmában, illetve karotinoid-protein komplexek formájában a fotoszintetikus membránokban.

A karotinoidok közül a béta-karotin a legismertebb, mint A-provitamin. Az élelmiszeripar festékanyagként használja nagy mennyiségben. A likopint és xantofillokat szintén az élelmiszeripar használja, margarinok sajtok színezésére. Baromfi takarmányokba is belekeverik a hús és a tojás színezésére. A kozmetikai ipar orális barnulássegítőként és barnítókrémek hatóanyagaként alkalmazza a xantofillokat.

Karotinoidok szerkezete

Karotinoidok szerkezete

Karotinoidokat kizárólag kémiai szintézissel állítják elő, bár a xantofillokat néha növényi anyagokból is kivonják. A mikroorganizmusok fermentatív karotinoid előállítása nem gazdaságos, bár nagyon sokféle képes karotinoidok, béta- karotin, likopin és zexantin és astaxanthin szintézisre. Karotinoidokat különböző élesztő törzsek (pl. Rhodotorula) és Streptomycesek, Mycobacteriumok képesek szintetizálni. Xantofillokat a baktériumok közül a Pseudomonasok, Micrococcusok, Mycobacteriumok, Chlorhobacteriumok, az algák közül pedig a Bacillariophyta, Chlorophyta és Cyanophyta fajok termelnek.

A legismertebb a Blakeslea trispora fonalas gomba, amelynek megfelelő zigospórás ivaros (+ és -) keverékkultúrája 3 g/l béta-karotin termelésére képes. Stimulálni triszporsavakkal, mint karotin előanyagokkal, valamint szerves zsíroldóanyagok és kerozin adagolásával lehetséges a törzsek béta- karotin termelését. A termelés aktivátora lehet az izoniazid béta-iononnal kombinálva. A-provitaminként csak a béta-ionon gyűrűt tartalmazó béta-karotin hatásos, az alfa és gamma karotin nem. A béta –ionon önmagában toxikus, a karotinképzést növényi olajok jelenlétében serkenti.

Triszporsavak

Triszporsavak

A béta-karotin tartalmú micélium közvetlenül az állatok takarmányába keverhető.

Folyamatábra

Folyamatábra

A C-vitamin (L-aszkorbinsav) és az E-vitamin (alfa-tokoferol) bioszintetikus előállítása

A klasszikus C-vitamin előállítás glükózból indult ki, ahol katalitikus redukcióval D-szorbittá alakították. Az Acetobacter suboxidans törzsei a D –szorbitot képesek régioszelektív oxidációval L-Szorbózzá alakítani.

C-vitamin

C-vitamin

Az L-szorbóz acetálással 2-keto-L-glükonsavvá alakítható, amely az L-aszkorbinsav kémiai szintézisének prekurzora. Ma már kizárólag tisztán kémiai szintézissel gyártanak C-vitamint.

Az E-vitamint szintén szintetikusan gyártják, de az alfa-tokoferol molekula egyes struktúráit lehetséges többlépcsős biotranszformációval is előállítani Saccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast), Pseudomonas, Geotrichum és Clostridium baktériumok közreműködésével.

Az új szuper E-vitamin: az astaxanthin

Egy 1967-es kutató expedíció során Phaff és munkatársai egy különös élesztőgombát izoláltak japánban, fák gyantájából.

Phaffia rózaszín élesztőgomba telepek.

Az astaxanthin karotinoid termelő Phaffia rhodosyma fiatal 24 órás rózsaszínű telepei agarlemezen.

élesztő astaxanthint termelt és számos cukrot képes volt fermentálni, szemben a többi hasonló karotinoid termelővel. Szokatlanul alacsony fehérje, viszont magas lipid és szénhidráttartalma volt. Az élesztőgomba először a Rhodozyma montanae, majd később felfedezőjéről a nemzetség a Phaffia, az egyetlen ide tartozó faj a Phaffia rhodozyma nevet kapta. Az astaxanthin a fő komponensnek bizonyult az élesztő által termelt karotinoidok közül, a festékanyag mintegy 85%-át téve ki. Astaxanthint természetes úton tengeri rákokból és kagylókból lehet kinyerni, sőt szintetikus úton is elő lehet állítani.

2 nap tenyésztés után a Phaffia törzs grammonként 300-400 mikrogramm astaxanthint termel, amely literenként 6-8 mg-ot jelent. A termelés irodalmi adatok szerint kb. duplájára növelhető (4).

A Haematococcus pluvialis spórás sejtjeinek karotinoid tartalmának fő komponenense szintén az astaxanthin, amely a festékanyagainak mintegy 95%-át teszi ki. Ez az organizmus a legnagyobb mennyiségben termeli az astaxanthint a természetben. Az alga sikeresen alkalmazható, mint hús és tojás színjavító, illetve gyökfogó. Haematococcus algatörzs egy hét tenyésztés után grammonként 20-30 mg astaxanthint termel, amely literenként 10-15 mg-ot jelent. Az alacsony nitrogén és foszfátkoncentráció, a levegőztetés és az intenzív megvilágítás az astaxanthin termelő algaspórák elszaporodását stimulálja.

Asztaxantin szerkezeti kép

Asztaxantin szerkezeti kép

Felhasználása a takarmányozásban

A Phaffia rhodozyma 1990-es években került előtérbe került, mint lehetséges ideális takarmány-kiegészítő és természetes astaxanthin forrás, mint hús és tojás színjavító, illetve gyökfogó. Alkalmazási területe elsősorban pisztrángokra és egzotikus madarakra terjedt ki, mivel ezek nem képesek pigmentanyaguk szintézisére és szervezetükben az élesztő-astaxanthin könnyen abszorbeálódott. A vad törzs hozzávetőleg 100-200 ppm / szárazanyag mennyiségű pigmentet tartalmaz, 6 nap tenyésztés után, ezért nagy mennyiségben kellett alkalmazni, mely nem volt gazdaságos. Elkezdődtek a kutatások, az optimalizálási kísérletek a biomassza és a pigmentmennyiség növelését célozva meg. Az elmúlt évek során nagy mennyiségű adat halmozódott fel a szaporítás optimalizálásával, a lehetséges szénforrások alkalmazásával, mutáció lehetőségével kapcsolatban és fokozottan astaxanthin termelő Phaffia törzseket hoztak létre.

Elsősorban csirke tojókon végeztek etetési kísérleteket, ahol 1-4 milligramm astaxanthin/kg takarmány alkalmaztak. A tojások színének változása 2 mg/kg takarmány esetén már megfelelő volt, míg 4mg/kg esetén a csirkék szöveteinek karotintartalma a kísérlet két hete alatt egyenletesen emelkedett. Ez a mennyiség a tojások keltethetőségére is pozitív hatást gyakorol, és mintegy 5,0 százalékponttal több tojás kikelése várható astaxanthinnal etetett tojóknál. In vitro kísérletekben csirke embrió fibroblasztokban 0,1-10 nM astaxanthin koncentráció esetén az oxidativ stressz alá helyezett szövet antioxidáns enzim aktivitása a normál szintre esik vissza, így a szuper-oxid-dizmutáz és a kataláz aktivitása lecsökken, míg a glutation-peroxidáz aktivitása a normál értékre tér vissza. Kérődző állatokon - elsősorban teheneken - nagy számú béta- karotin etetési kísérleteket végezetek, ezek analógiájára astaxanthin etetése is végrehajtható, mérve a vér öszkarotin koncentrációját és az antioxidativ enzimek aktivitását. Sertéseket E-vitaminnal, mint potenciális antioxidánssal már régóta etetnek. Az astaxanthin, mint "szuper E-vitamin" versenytársa lehet az E-vitaminnak, mivel antioxidativ aktivitása in vitro kísérletekben mintegy százszorosa az E-vitaminnak.

Humán felhasználása

Az utóbbi évek kutatási eredménye szerint nemcsak az előzőekben vázolt marginális felhasználása lehetséges az astaxanthinnak, hanem antioxidánsként, gyökfogóként a humán gyógyászatban is alkalmazható. Antioxidáns aktivitása mintegy tízszerese a béta-karotinénak és mintegy százszorosa az E-vitaminnak. Glutation-peroxidáz, kataláz és super-oxid-dizmutáz enzim aktivitás mérések ezt megerősítik. Hatékonyan gátolja a lipid-peroxidációt. Magas oxigéntenziójú vérben is kifejti antioxidáns hatását, szemben a béta-karotinnal amely ilyen körülmények között mint oxidációs gyök viselkedik. Immunstimuláns hatása is meghaladja a béta-karotinét. Bár A-provitamin hatása nincs, egér lépsejteken végzett in vitro kísérletek szerint kisebb koncentrációban (2 x 10-8 M) képes stimulálni a thymociták sejtproliferációját, az interleukin-2 és a poliklonális antitestek termelődését, mint a béta-karotin (2 x 10-7 M). A stressz okozta káros mellékhatások kivédésére az astaxanthint japán kutatók, mint táplálék-kiegészítőt ajánlják. Amerikai szabadalom szerint központi idegrendszeri betegségeknél és szemsérüléseknél az astaxanthin sikerrel alkalmazható. Továbbá számos retinoid tartalmú gyógyszernek fontos alapanyaga (5), valamint a szem retina fotoreceptorainak domináns pigmentanyaga (3). Kozmetikumként is alkalmazható. Francia szabadalmi eljárás szerint Rhizobium meliloti tenyészet exopoliszacharidjának és Haematococcus tenyészet biomasszájának keverékét használják fel, mint gyógyhatású krém hatóanyagot. A gyomorfekélyt okozó Helicobacter pylori baktérium fertőzés megelőzésére és kezelésére svéd szabadalmi eljárás szerint az alga-astaxanthin alkalmazható. A stressz okozta káros mellékhatások kivédésére az astaxanthint japán kutatók, mint táplálék-kiegészítőt ajánlják.