Ugrás a tartalomhoz

Fermentációs biotechnológia

Dr. Kutasi József (2007)

Glia Kft.

Ipari fermentációs tápanyagok, fokozatok, eljárások

Ipari fermentációs tápanyagok, fokozatok, eljárások

Fermentációs eljárások

Módszer tekintetében alapvetően két fő lehetőség jöhet szóba: a szubmerz (folyadék kultúrás) és szilárd (solid state fermentation, SSF) közegű fermentáció. A szubmerz tenyésztés jóval elterjedtebb, ez a jelenlegi ipari fermentációk túlnyomó többségére igaz, továbbá a felületi, szilárd tenyésztés starter, inokulum (oltó) kultúráit is folyadék tenyészetekkel biztosítják. A szubmerz fermentációt a jobb mérhetőség, szabályozhatóság jellemzi.

A batch- fermentáció a folyadék fermentációk szakaszos üzemmódja. A batch tenyészetekben a mikrobák szaporodásában négy fázist lehet megkülönböztetni (grafikon):

  • Lag fázis: Ha sejteket az egyik táptalajból egy másikba oltunk át a sejtszám az első néhány órában nem változik, ekkor adaptálódnak organizmusaink a környezetükhöz.

  • Log fázis: A lag fázis végére az adaptálódott sejtek szaporodásnak indulnak és a sejtszám megtöbbszöröződik a növekedés exponenciálissá válik.

  • Stacioner fázis: A növekedés gyengül az elfogyó szénforrás, nitrogénforrás vagy a felhalmozódó az anyagcserében termelődő toxikus anyagok miatt.

  • Stacioner fázis: A növekedés gyengül az elfogyó szénforrás, nitrogénforrás vagy a felhalmozódó az anyagcserében termelődő toxikus anyagok miatt.

  • Pusztuló fázis: Erre a fázisra a biomassza energiatartalékának elfogyása és a sejtek elhalása jellemző.

Grafikon Baktérium tenyészet növekedési görbéje.

Grafikon Baktérium tenyészet növekedési görbéje

A batch fermentációk továbbfejlesztett változatai a feeding fermentációk, ahol a fermentáció kezdetén a tápoldat fontosabb összetevőit kisebb koncentrációban alkalmazzák, majd a fermentáció előrehaladtával folyamatosan kis adagokban a fermentléhez adagolják. A mikroorganizmus által előállított termék maximális bioszintézisét gyakran feed-back gátlás akadályozza, ez - amennyiben deregurált mutánsok nem alkalmazhatók – megfelelő fermentációs időben táptalajkomponensek adagolásával (feeding) kivédhető.

A szubmerz fermentációk speciális változata a folyamatos fermentáció, ahol a bioreaktorba folyamatosan vezetik be a steril tápoldatot és egyidejűleg ugyanolyan mennyiségű átalakított fermentlevet visznek ki a rendszerből (kemosztát és plug-flow reaktor).

Fermentor

Fermentor

Levegőliftes fermentor

Levegőliftes fermentor

Folyadék sugaras fermentor

Folyadék sugaras fermentor

A szilárd, felületi (SSF) tenyésztést elsősorban penészgombák szaporítására használják. Ilyen körülmények között a levegőztetés egyszerűbb, mivel a nagy felületen elhelyezkedő mikrobák könnyen érintkeznek a levegővel. Az alacsony nedvesség tartalomból (20-50%) következően a helyigénye kisebb, mint a süllyesztett fermentációé, és így a hatóanyagok kinyerése is egyszerűbb. Táptalajuk, szubsztrátumaik egyszerűek akár lehet csak búza vagy rizskorpa (penészkorpás eljárás). Nagy hátránya, hogy a folyamat szabályozása, mérése a tápközeg inhomogenitása miatt nem megoldható.

Tözsek tartósítása folyékony nitrogénben.

A felületi tenyésztés tálcás eljárása során pl. a búzakorpát 50% nedvességűre nedvesítve sterilezik, majd lyuggatott fenekű fémtálcákra helyezik.

Ipari szilárd felületi tenyészet.

A felületi tenyésztés tálcás eljárása során pl. a búzakorpát 50% nedvességűre nedvesítve sterilezik, majd lyuggatott fenekű fémtálcákra helyezik.(Kép) A tálcákat kamrákba helyezik és megadott hőmérsékleten 1-5 napig inkubálják.

SSF tenyésztő üzem kamrái.

A tálcákat kamrákba helyezik és megadott hőmérsékleten 1-5 napig inkubálják

Tálcás tenyésztés - Üzemi felületi tenyésztés kép

tálcás tenyésztés - Üzemi felületi tenyésztés kép

Forgodobos fermentor

Forgodobos fermentor

A jelenlegi fermentációs biotechnológiai ipar túlnyomó többsége szubmerz aerob (levegőztetett) fermentáció, ezért a következő fejezetekben ezeket tárgyaljuk

Nyersanyagok

A mikroorganizmus táptalajoknak mindazokat az elemeket tartalmazni kell, amelyek a sejt saját anyagainak felépítéséhez és anyagcseretermékek előállításához szükséges. A kívánt biotechnológiai termékek termeléséhez elengedhetetlen az optimális fermentációs táptalaj összetétele. Ez a táptalaj-optimalizálás. Meg kell választani a helyes táptalajt (összetétel, adagolások), és az ezen a táptalajon előnyösen alkalmas tenyésztési körülményeket (oxigénellátás, hőmérséklet). A termelés céljára szolgáló tápoldatokat előállítási módukban is optimalizálni kell, mivel az előkészítés során minden esetben csíramentesíteni, sterilezni kell. Fontos tehát a komponensek összetétele, minősége, az oldás vagy szuszpendálás sorrendje, kicsapódások megakadályozása, a sterilezett tápoldat változásai, pH értékek előtte és utána, sőt szükség lehet egyes összetevők külön sterilezésére és adagolására.

A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak. A világon jó néhány gyártó van, amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb. Ezekből az anyagokból elsősorban u.n. inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést.

Nutrient agar - lemezekhez, ferdékhez - és Nutrient Broth - lombikokhoz - Oxoid kész táptalajok

A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak. A világon jó néhány gyártó van, amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb.. Ezekből az anyagokból elsősorban u.n. inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést. A képen baktériumok általános tenyésztésére alkalmas speciális több összetevőből álló Nurient agar és Nutrient tápleves(broth)táptalajokat látunk.

Élesztőkivonat(yeast extract) és burgonya-dextróz (potato-dextróz) Becton Dickinson tápanyagok.

A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak. A világon jó néhány gyártó van, amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb.. Ezekből az anyagokból elsősorban u.n. inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést. A képen baktériumok, gombák tenyésztéséhez használható egyszerű táptalajösszetevők láthatók.

Gazdaságossági okokból az ipari termelést olyan u.n főtáptalajokon kell biztosítani, amelyek gyakran komplex, alig meghatározható összetételűek, sok esetben élelmiszeripari melléktermékek, hulladékok. A szénhidrátok – pl. glükóz, szacharóz - a mikroorganizmusok általános energiaforrásai, azonban tisztán a költségtényezők miatt nem alkalmazhatók. A melasz a cukorgyártás során a cukorrépa feldolgozásakor keletkező anyalúg a legolcsóbb kb. 50%-ban szacharóz tartalmú szénforrás. E mellett vitaminokat, nyomelemeket, sőt nitrogént is tartalmaz. A glükózszörp (izoszörp) a kukoricakeményítőből nyert glükóz enzimatikus átalakítás során nyert köztitermék, amely mintegy fele-fele arányban tartalmaz glükózt és fruktózt a melaszhoz hasonló koncentrációban. A malátakivonat a sörgyártás során malátásított árpa vizes, nedves kivonata. Összetettebb szénforrás, mint az előzőekben felsoroltak, mivel nemcsak hexózokat, hanem diszacharidokat, triszacharidokat egyaránt tartalmaz fehérjék, aminosavak és vitaminok mellett. Itt érdemes megemlíteni, hogy mind a malátakivonat, de más %-os mennyiségben egyszerű redukáló cukrokat (glükóz, fruktóz) és mellette aminosavakat, fehérjéket tartalmazó táptalajokat kíméletesen kell sterilezni. A Maillard-reakció során a fehérjék aminocsoportjai vagy maguk az aminosavak reagálnak a cukrok karbonil csoportjával és ezeket a mikrobák nem képesek hasznosítani. Sok esetben a megoldás a monoszacharid tartalmú szénhidrátok külön sterilezése és adagolása. A kukoricaliszt vagy maga a kukoricakeményítő és dextrin is alkalmas szénforrás lehet. A cellulóz, növényi olajok és metanol csak speciális esetben alkalmazhatók.

Nitrogén-forrásként a leggyakrabban élesztőkivonatot, különböző hús, kazein, zselatin és szójaliszt hidrolizátumokat, peptonokat, és húskivonatokat (beef-extract) alkalmaznak, elsődlegese a laboratóriumi munkában. Üzemi körülmények között a penicillin gyártásnál is áttörést és nagy termelékenységet értek el a kukoricakeményítő előállítás közben keletkező kukoricapréslé, a kukoricalekvár használatával

Ez az anyag ma már a biotechnológiai ipar fő nitrogén és vitamin forrása. Fő komponense elsősorban az aminosavak, míg cukortartalma a tejsavbaktériumok révén tejsavvá alakul. Legújabb kísérletek szerint a lekvár szárítását is megoldották, így állandó minőségű kukoricalekvár-por felhasználása is lehetségessé vált. A kukoricalekvár fő jellemzője az élő tejsavbaktériumok jelenléte, amely nem megfelelő sterilezés esetén a fermentáció és a kezdő biotechnológus réme lehet. Használatuknak azonban nincsen akadálya, mivel a tejsavbaktériumok nem spórás szervezetek, így sterilezéssel könnyen elpusztíthatók. Ezeknél kevésbé alkalmas, de költségtényezők miatt sok helyen használt a szójaliszt, amely a szójaolaj kivonási gyártás után visszamaradt komplex tápanyag. A szójaliszt fehérjéi csak lassan metabolizálódnak, ezért csak hosszabb idejű fermentációk esetén alkalmazzák.

Minden előkészített tápoldatot, oldatot, kémcsöveket és lombikokat, valamint a fermentorokat és a hozzá tartozó oltócsöveket sterileznünk kell. Az általános gyakorlat a hősterilezés, ez a legfontosabb módszer, ekkor a legtöbb tápoldatot, hacsak nem túl érzékeny, 5-10 perces előfőzéssel kell előkészíteni. Csíramentes anyagokat 121 C-on 1,2 atm telített gőznyomáson 25 perc időtartam alatt lehetséges előállítani. A kisebb csöveket, lombikokat certoklávban,

Lombikok sterilezése certoklávban.

a fermentorokat autoklávokban

Sterilezett 5 literes fermentor autoklávban.

míg a több 100-1000 literes fermentorokat helyben direkt gőzbevezetéssel sterilezzük. Az elv minden esetben ugyanaz, bár nagyobb térfogatban (5-10 liter) hosszabb sterilezési időre lehet szükség (45-60 perc) hasonlóan a nagyobb fermentorokhoz. A vitaminokat, hormonokat sterilezett kerámia vagy membrán szűrőn (0,45 mikométeres pórusú) átbocsátva szűrjük csíramentesre és a már sterilezett tápoldatokhoz adagoljuk steril fülkében, vagy szobában.

Szubmerz baktérium tenyészet rázógépen.

Szubmerz gombatenyészet rázógépen.

Fermentációs fokozatok (Scale-up)

A fermentációs eljárás első lépéseként lombiktenyészetekben rázógépeken optimalizáljuk a gombák és baktériumok tenyésztését.

Rázógép baktérium temosztátban, gombatenyészetekkel

Rézköpenyes általános fűtő bakterológiai termosztát analóg kijelzővel, rázógéppel

Termosztálható rázógép, baktériumtenyészetekkel.

Hűtő, fűtő temosztát Certomat 12 férőhelyes rázógéppel.

A biotechnológiai gyakorlat a következő: az agar ferdéken tenyésztett nemesített organizmusokat 100 ml steril tápanyagokat (tápleves) tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombikba mosva (oltva), majd azokat rázógépre helyezve szaporodástól függően meghatározott hőmérsékleten 1-10 napig fermentáljuk. Ez a tenyésztés a nagyipari fermentáció laboratóriumi modellezése. A rázatott lombikok falán a percenkénti 300-450-es rázatási fordulat miatt (r.p.m. rotary per minute) folyadékfilm alakul ki, amelyben a gyors gázcsere lehetővé teszi a mikroszervezetek intenzív légzését. A fermentáció során igen fontos a jó oxigénellátás biztosítása. A mikrobák szaporodása energiát igénylő folyamat (pl. fehérje-, zsírsav-szintézis), s csak a légzés biokémiai mechanizmusával keletezik jó hatásfokkal ez az energiamennyiség.

A második fermentációs lépcső a már keverőkészülékkel és levegőztető berendezéssel ellátott üvegfermentorok.

5 literes fermentor pH, oxigén és hőmérséklet szenzora

Lecsomagolt 5 literes fementor sterilezés előtt.

Ezek már hasonlítanak az üzemi termelőkészülékekhez, hasznos térfogatuk 5-20 liter. Ezekben az edényekben a táptalaj bár eltér az inokulumok összetételétől, de még nem a termelő táptalajt tartalmazza. Ebben a térfogatban fő cél - hasonlóan az inokulum tenyészetekhez – hogy a mikroorganizmusok maximális mennyiségben szaporodjanak el. A fermentorok oltásánál fő szempont az oltási százalék meghatározása, azaz hogy milyen mennyiségű pl. baktérium lét mossunk adott térfogatú fermentorhoz. Általában baktériumoknál ez 0,1-1,0 %, gombáknál és növényi sejteknél 3-10 % inokulum fermentlevet (pl. a lombikban szaporított baktériumok tenyészetét) adagolunk.

5 literes Biostat B DCU típusú automatizált üvegfermentor élesztő tenyészettel

Csővezetékek hálózata köti össze a steril fementorteret a külvilággal. Jobbra az adagoló üvegek láthatók, amelyekből steril szilikoncsöveken áramlik a folyadék. A készülék hűtővizzel és fűtéssel szabályozza hőmérsékletét, ez rendszer a piros gumicsöveken keresztül működőképes. A sárga vízálló vezetékek látják el árammal a keverőmotort és a fermentor szabályozó tornyát (a kép jobb oldalán).

5 literes fermentor sterilezésre lecsomagolva

A sterilezéshez a csövek végeit és a pH, oxigén szenzor csatlakozóit nátronpapírba és alufóliába csomagoljuk, ez utóbbit a papír nedvesedésének elkerülésére.A fehér, kerek 0,2 mikrométer pórusátmérőjű steril levegőszűrő még csomagolatlanul lóg a fermentor oldalán.

Sok esetben félüzemi, kísérleti üzemi léptéket is beiktatnak (pilot-plant), 100 – 3000 liter térfogatban. Ebben a térfogatban már termelő léptékről beszélhetünk és a fermentáció során már főfermentációs optimalizált táptalajokra oltunk és tenyésztünk. Az üzemesíthetőség megítélésekor ez a félüzemi lépték fontos a következő befejező lépték megvalósításához.

10 literes beépített fementorok kettes egységekben.

Rozsdamentes acél helyben sterilezhető 10 liter hasznos térfogatú párosával elrendezett félüzem.

10 literes fermentor közelről.

A félüzemi fermentor fején helyezkednek el a szondák. Biztonsági hőálló üvegablak biztosítja a belátást.

100 literes fermentor kiszolgáló csővezetékekel.

A fermentorüzem oltófermentorai 100 literes térfogatúak. Rozsdamentes acél megfelelő fejmotorral és műszerekkel(pH és hőmérséklet, nyomás mérése).

100 literes fermentor hőmérő, pH mérő, oxigénmérő szonda oldalsó bevezetése.

Az üzemi femenotorokon már nem a fejen, hanem a test oldalsó részén vezetik be az érzékelőket.

1 köbméteres fermentor üzem (4 db fermentor).

A modern főüzem 4 köbméteres fermentort működtet. A bonyolult csövezés és számítógép vezérlés lehetővé teszi a tápanyagok csővezetéken történő betöltését, ezekben a fermentorokban már nincs bebújónyílás, szükségtelen.

1 köbméteres fermentor közelről.

A modern jól szigetelt köbméteres fermentor két emelet között fér el. A kép tetején a fermentor tengely nagyteljesítményű motorja látható(zöld). a csővezetékeken mágnesszelepek láthatók (piros és fekete), melyek a számítógépes vezérlést biztosítják.

Végül a termelő fermentáció a termék szükséges mennyiségének megfelelően 1-450 köbméter térfogatban főfermentációs táptalajon folyik. A fermentorokban optimális oltási százalékkal inokulálunk és az előző léptékekben kidolgozott paraméterek szerint tenyésztünk.

10 literes fermentor sterilezése.

100 literes fermentorüzem bemutása.

1 köbméteres fermentorüzem bemutatása.

Fermentorüzem mikroprocesszoros programvezérelheto adagoló automatikája.

A laboratóriumi eljárások ipari méretben való kifejlesztése (Scale-up) során nagy fontosságú a levegőztetés, hőmérséklet és keverés értékeinek pontos meghatározása. Amint a fermentorban a sterilezett tápoldatot mikroorganizmusokkal beoltják, a levegő formájában adott oxigénen és a pH szabályozásra adagolt savon vagy lúgon kívül az egész folyamat ideje alatt a rendszer összetétele, a biomassza és a metabolitok koncentrációja állandóan változik. Ezért igen fontos a szaporítás alatti pH-beállítás és hőmérséklet megválasztása. A tenyészetek hőmérséklete befolyásolja a szaporodást, ugyanakkor az egyes metabolitok képződését serkentik vagy gátolják, ezért ezeket nehéz összeegyeztetni. Hasonló a helyzet a pH optimummal is. A hőmérsékletet a növekedés, de a termékképződés szempontjából is optimalizálni kell. Nagy tömegű (5 köbmétertől) számolni kell a szaporodási folyamatok hőtermelésével és az esetleges hűtési kapacitás növelésével.

A levegőztetés steril szűrőkön keresztül történik szűrőmembránok, vagy szűrőgyertyák alkalmazásával.

5 literes fermentor sterilezésre lecsomagolva

A sterilezéshez a csövek végeit és a pH, oxigén szenzor csatlakozóit nátronpapírba és alufóliába csomagoljuk, ez utóbbit a papír nedvesedésének elkerülésére.A fehér, kerek 0,2 mikrométer pórusátmérőjű steril levegőszűrő még csomagolatlanul lóg a fermentor oldalán.

A fermentorokba a levegőadagolás mérése rotaméterrel történik 0,1-1,0 vvm (levegő térfogat/tápoldat térfogat percenként) mennyiségben. A levegőztetés a fermentáció közben felhasznált oxigén mennyiségétől függ, így pl. intenzív szaporodási időszakban - log fázis - nagyobb mennyiségben szükséges. Stacioner vagy lag fázisban jóval kevesebb, pl. 1 köbméteres fermentorba 30 köbméter óránkénti levegőadagolás is elegendő lehet ( 0,5 vvm). A kívülről behatoló szennyeződések veszélyének csökkentésére a beáramló levegő visszatartásával a fermentorokban 0,1-0,6 bar túlnyomást hoznak létre, és ez természetesen befolyásolja az oxigén és szén-dioxid oldhatóságát.

Az oxigén beoldódása az egyik legfontosabb paraméter, ezért megfelelő levegőátbuborékoltatással (levegő lant) és keveréssel kell gondoskodni a teljes fermentlé minden részletének oxigénellátásáról. A keverést többféle kiképzésű keverővel (pl. turbina keverőlapátok), vagy levegőlift (air-lift) alkalmazásával oldják meg. A folyadéksugaras (jet) fermentorokban a fermentlé folyamatos keringetésével biztosítják a levegőellátást.

Bacillus subtilis baktériumok.

Kisméretű (2-4 mikrométer) bacillusok.