Ugrás a tartalomhoz

Fermentációs biotechnológia

Dr. Kutasi József (2007)

Glia Kft.

A törzsek nemesítése, törzsfejlesztés, törzsfenntartás

A törzsek nemesítése, törzsfejlesztés, törzsfenntartás

Mikroorganizmusok izolálása talajból, screening és kinyerés sematikus ábrája.

Mikroorganizmusok izolálása talajból, screening és kinyerés sematikus ábrája.

A vadtípusú törzsek sohasem szintetizálnak nagy mennyiségben a kérdéses vegyületből, ezért célzottan nemesíteni szükséges őket. A fermentációs folyamatokban munkára fogott mikroorganizmusok szülőegyede, a vad törzs (wild-type strain) mindig a természetbol izolált. Ezeket a törzseket tovább vizsgálva szelekcióval, esetleg mutánsnyeréssel választják ki, meghatározott vizsgálati szűrő módszerekkel (screening) a keresett metabolitot, enzimet, stb. termelő mikroorganizmusokat Ez lehetséges tisztán szelekcióval csak a legjobban termelő altörzsek kiválasztásával vagy mutációs, illetve ha máshogy nem lehetséges, rekombinációs technikával. A mikroorganizmusok genetikailag könnyen manipulálható szervezetek. A mikrobiológiai gyakorlatban jól ismert klasszikus mutációs technikákkal (pl. nitrozo-guanidinnel, etil-metil-szulfonáttal mint mutagén anyaggal való kezelés vagy UV besugárzás) a DNS bázissorrendjének véletlenszerű átalakításával mutáns sejtvonalak állíthatók elő. Enzimatikusan emésztve a baktérium sejtfalat (pl. lizozimmal), olyan protoplaszt tenyészetet hozhatunk létre, amely érzékenyebb a mutációs kezelésekre, másrészt egymással vagy más tenyészet protoplasztsejtjeivel fuzionálva új un. hibrid sejtvonal állítható elő. Sőt, közvetlenül a genetikai állományba beavatkozva - vektorokkal géneket a sejtekbe juttatva, olyan transzformánsokat hozhatunk létre, amelyekben többszörös mennyiségben halmozódnak fel a keresett vegyületek. Továbbá ahhoz, hogy a fermentációs módszer gazdaságos legyen, sokszor olyan nemesített törzsek szükségesek, melyek tenyészthetőségi tulajdonságai jobbak, mint a vad típusú törzsé. A nemesített törzseket, sejtvonalakat legáltalánosabban liofilizálással (fagyasztva szárító), ahol ez nem lehetséges folyékony nitrogénben tartósítják.

Törzsfenntartás

Mikroorganizmusok élő és tiszta tenyészetek formájában történő fenntartására valamennyi mikrobiológusnak szüksége van. Mint ahogy a kémia vagy biokémia is megszünne vegyszerutánpótlás nélkül, úgy a mikrobiológia is erősen függ a tiszta és stabil tenyészetek elérhetőségétől. Legtöbb vegyszerrel ellentétben, melyek könnyen tárolhatók, a mikroba tenyészetek eléggé érzékenyek és fertőződhetnek, változhatnak vagy elpusztulhatnak kellő szakértelem hiányában. A megfelelő törzsfenntartási módszereknek így igen nagy jelentőségük van. A kutatók egy része már a múlt század végén javasolta olyan helyek létrehozását, ahol mikroorganizmusokat tárolnának nagy számban tudományos és egyéb célra. Az 1904- ben alapított Centraalbureau voor Schimmelcultures ( CBS, Baarn, Hollandia) lett az első kisebb centrum, amely élesztő- és fonalasgombákat élő állapotban megőrzött, fenntartott és mások számára is szolgáltatott. A korai gyűjtemények a mezőgazdaság, az erjesztési iparok és a gyógyászat kisebb igényeit elégítették ki. A penicillin felfedezése és iparosítása 1928-1945 között rendkívüli módon megnövelte az ilyen jellegű gyűjtemények jelentőségét. Az ezt követő évtizedekben a gyógyszeripar a biológiailag aktív vegyületek gazdag tárházát találta meg a mikroorganizmusokban. Ezzel párhuzamosan az orvostudomány, a mezőgazdaság, az élelmiszeripar, a környezetvédelem és más területek fejlődése is egyre nagyobb mikroba választékot igényelt. Az 1980-as években a törzsgyűjtemények fejlődésének újabb lökést adott a biotechnológia bázisú fermentációs iparágak azóta is tartó fellendülése. A gyűjteményekben tárolt mikroorganizmusok ugyanis gyakran képezik új termékek vagy új technológiák még ki nem aknázott erőforrásait.

Az elterjedtebb törzsfenntartási és konzerválási módszerek az alábbiak:

  • Időszakos átoltás tenyésztő tápközegekre (ferde agaros tenyészet kémcsőben aerob mikrobák esetében ill. szúrt kultúra anaeroboknál). Az átoltott tenyészeteket megfelelő hőmérsékleten inkubáljuk kellő ideig, majd a kifejlett tenyészeteket felhasználásig hűtőszekrényben tároljuk + 4 C-on. Az átoltások gyakorisága az adott mikrobától függ, ez a periódus néhány héttől (baktériumok zöme) 1/2-1 évig (fonalas- és élesztogombák) terjedhet.

    Agarferde baktériumtenyészettel.

    A Bacillus licheniformis tenyészete 24 óra 30 C-os inkubáció után nő ki ilyen szépen agarferdén.

    Agarferdék gombatenyészettel oltva.

    A Thermomyces lanuginosus xilanáz enzimet termelő gombák 10 nap 50 C-os inkubáció után nőnek ki az agar ferdéken és termelnek vörösesbarna színanyagot.

    Agarferdék élesztőgombatenyészettel oltva.

    A Saccharomyces cerevisiae élesztő tenyészet 48 óra után tejszerű felületet ad az agaron.

    Streptomyces agarferde tenyészetek.

    A ferdéken szépen kinőtt Streptomyces albus tenyészetek jellegzetes grízes felületűek.

  • Ásványolaj alatti tárolás: a ferde agaros tenyészet egészét vagy egy darabját steril ásványolaj alatt tartjuk. A ráöntött olaj gátolja a táptalaj kiszáradását, a beoldódó csekély mennyiségű levegő életben tartja az aerob mikrobákat relatíve hosszabb ideig (max. néhány évig).

  • Fenntartás steril homokban vagy talajban. Elsősorban spórás baktériumok (pl. Bacillus) és sugárgombák (pl. Streptomyces) fenntartásához előnyös. A talaj a mikroba természetes környezetét jelenti. Az alkalmazott talajnak vagy homoknak kellően száraznak kell lennie.

  • Vízmentes szilikagélen történo konzerválás. A kiszárításnak kíméletesnek kell lennie.

  • Liofilezés (fagyasztva-szárítás). A mikroorganizmusban és környezetében lévő víz eltávolítása kíméletes módon történik, alacsony hőmérsékleten (-30 -40 C), nagy vákuum mellett. A jégkristályok szublimálásán alapszik tulajdonképpen a módszer. Vivőanyagok (pl. szérum-fehérje) csökkentik a mikrobapusztulást a folyamat alatt. Az ampullában lévő vákuum erősen redukálja a kíméletesen megszárított tenyészet raktározás (tárolás) alatti hőpusztulását. Az eltarthatósági (visszanöveszthetőségi) idő - mikrobától függően - az 5 - 50 év tartományban van.

    Fáziskontraszt feltét közelről.

    A fáziskontraszt feltét tárcsája (középen )biztosítja a megfelelő élességet a különböző naygításokhoz, alul a baktériumokat átvilágító lámpa kimenő nyílása látható.

    Törzsek lióampullái a liofilizálón

    Egyszerre sok kópiában, sok ampullában érdemes törzseket liofilizálni, így akár 100 évre is elegendő tenyészet tartósítható.

    Fagyasztás -50 C-on vákuumban

    A tenyészetek liózása

  • Mélyhűtéses fagyasztás a -30 - -80 °Chőmérséklet tartományban, védőfolyadékok (pl. glicerin, dimetilszulfoxid, cukoralkoholok, fehérjék, stb.) jelenlétében. Jelenleg mechanikus működésű hűtőszekrényekkel már -80 °C is biztosítható. Minél alacsonyabb a tárolási hőmérséklet, annál kisebb a mikrobák hőpusztulása. Évekig tárolhatók így a mikrobák. A módszer sebezhetősége: hosszabb áramszünet

  • Tárolás folyékony nitrogénben (-196 C). Évtizedekig-évszázadokig tárolható így a mikroorganizmusok zöme. A párolgási veszteségek pótlásáról gondoskodni kell. Védőfolyadékok u.a. mint fentebb. Relatíve drága módszer. A tartós tárolási módszerek közül napjainkban leginkább a liofilezést és a folyékony nitrogénben történő tárolást alkalmazzák (sok esetben, biztonsági megfontolásból, ugyanazon törzsek esetében mindkét módszert is, ha a törzsek fenntartásának fontossága ezt megkívánja). Replika gyűjtemény szükséges a legnagyobb, legfontosabb gyűjtemények esetében: ugyanazon gyűjtemény kisebb kópia (lió ampulla, folyékony nitrogénes kapszula) formájában egy másik helyszínen (50-100 km-re) is el van helyezve a föld alatt. Erre azért van szükség, hogy elemi csapás esetén (földrengés, tűzvész) az igen nagyértéket képviselő eredeti gyűjtemény újra visszaállítható legyen. Szállításra, postázásra (ügyfelek kiszolgálására) elsősorban a liofilezett tenyészet (üvegampullában) vagy a friss leoltás (pl. ferde agaros tenyészet kémcsőben) alkalmazható. Némely esetben száraz jéggel hűtött formában történik az érzékeny tenyészetek postázása. A folyékony nitrogénben történő tárolással konzervált tenyészetek nem alkalmasak szállításra.

    Tözsek tartósítása folyékony nitrogénben.

A világon fellelhető mikrobiológiai törzsgyűjtemények száma 1000 körüli lehet. Ma már nem ritkák a több tízezer mikroorganizmust számláló gyűjtemények. Ezek az iparilag fejlett országokban találhatók. A világ talán legnagyobb, sokszor NRRL-nek rövidített gyűjteményében (US Department of Agriculture, Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois) mintegy 80.000 mikrobát tartanak fenn. Valamivel kisebb, de talán ismertebb gyűjtemény az American Type Culture Collection (ATCC), ahol a tárolt mikrobák száma megközelíti a 60.000-et. A nagy európai és japán gyűjtemények 10-30.000 közötti mikrobalétszámmal rendelkeznek.

Magyarországon a három legjelentősebb törzsgyűjteménynek az Országos Közegészségügyi Intézet (OKI) Bakteriológia Osztálya, a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem (KÉE) Mikrobiológia Tanszéke, valamint a Budapesti Műszaki Egyetem (BME) Mezőgazdasági Kémia Technológia Tanszéke ad otthont. Az OKI-ban a humán egészségügyet szolgáló Orvosi Baktériumok Magyar Nemzeti Gyűjteménye található. A fenntartott mikroorganizmusok (döntően baktériumok) száma mintegy 3500. A Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen működik a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteménye. Itt a szabadalmi letéti mikroorganizmusok tárolásán túlmenően elkezdték a mezőgazdasági és ipari felhasználású mikroszervezetek gyűjtését és raktározását is. Jelenleg mintegy 1600 törzset tartanak fenn, kétféle módszerrel: liofilezéssel (fagyasztva szárítással) és folyékony nitrogénben történő tárolással. Magyarországon ez az egyetlen hely ahol szabadalmi védelem alá (szabadalmi letét) helyezhetünk bármilyen a biotechnológiai iparban hasznosítható mikrobát. A BME-n (Budapesti Műszaki Egyetem) mintegy 2000 mikroorganizmust tárolnak, liofilezett tenyészetek formájában. A TUB rövidítéssel (Technical University of Budapest) jelölt gyűjtemény a mezőgazdasági, ipari és környezetvédelmi célú kutatásokat, valamint az oktatást szolgálja.