Ugrás a tartalomhoz

ATOMABSZORPCIÓS SPEKTROMETRIA

Dr. Posta József

Hallgatói Információs Központ

Speciációs analitika

Speciációs analitika

A speciáció fogalma és szükségessége

Az elemanalitika, a nyomelemek vizsgálata terén a 21. század nagy kihívásának számít az a törekvés, hogy az elemnek, nyomelemnek a mintában ne csak az összes koncentrációját határozzuk meg, hanem a különböző vegyérték- és kötésállapotú kémiai formáit külön-külön is. Az elemanalitikának ezt az új irányát összefoglaló néven speciációs analitikának nevezik. Az elmúlt 20 év során az e területen megjelent közlemények száma óriásira nőtt, ami jelzi a téma kiemelkedő fontosságát az élet legkülönbözőbb területein.

Az analitikai atomspektroszkópiában hosszú időn keresztül a feladatot az elemek fokozatosan egyre kisebb koncentrációinak minél pontosabb meghatározása jelentette a legkülönbözőbb mintatípusokban. Így az olyan kérdések megoldása, mint a platina háttérkoncentrációja a vérben, az óceán vizének aranytartalma vagy a Római Birodalom idején a légtérbe kerülő ólom femtogrammnyi mennyiségű nyomainak meghatározása az Északi Sark kétezer éves hó és jégrétegében az analitikusoknak mára már nemcsak vágyálma, hanem elérhető valóság. A szervetlen nyomelem-analitika úgy lépett át a 21. századba, mint az analitikai kémia jól megalapozott területe.

A toxikus vagy esszenciális hatást a biológiában, a humánbiológiában és az orvoslásban gyakorlatilag sohasem magához az elemhez köthetjük, hanem annak egyszerű akva- komplexeitől bonyolultabb komplexeken keresztül a változó összetételű elemorganikus vegyületeiig, amelyeknek egymástól jól elkülönülő fizikai, kémiai és biológiai sajátságai vannak. Egyre több adat igazolja, hogy a toxikus nyomelemeknek kémiai formájuktól függően igen eltérő élettani hatásuk lehet [99-102]. Esetenként az azonos elem két formája között a toxicitásbeli különbség nagyságrendekkel eltérő is lehet.

A természetes mintákban előforduló arzénformák közül a szervetlen As(III) és As(V) tekinthető a legtoxikusabbnak. Az alkilezett formák: monometil-arzonsav (MMA), dimetil-arzinsav (DMA), arzenobetain (AsBet), arzenocholin (AsCo) az élő szervezetbe jutó szervetlen arzénformák detoxifikálódási termékei, amelyek ennek megfelelően kevésbé toxikusak. Az arzenocholin és arzenobetain arányának meghatározásával például becsülni lehet, hogy a biológiai rendszert mikor érte az arzénszennyeződés.

Előbbiekhez hasonlóan igen eltérő a szervetlen higanysók és az alkilezett higanyszármazékok toxicitása. Utóbbiaké mintegy 100-szorosa a szervetlen higany-vegyületekének. Ez azt jelenti, hogy ha az alkilezett származék a szervetlen higanynak csupán 1-2%-a, már akkor is többszörösére nő a minta toxicitása. Az alkilezett higanyszármazékok azért is jelentenek veszélyt az emberre, mert zsíroldhatók lévén át tudnak jutni az vér-agy-gáton és az agyban komoly idegrendszeri károsodások léphetnek fel. Ma már az is ismert, hogy például az ónnak mintegy 15-20 különböző toxicitású kémiai formája létezik a természetben és arra is fény derült, hogy ezek nemcsak az ember által okozott környezetszennyezés termékei, hanem egy részük a környezetben természetes úton is keletkezhet.

Előbbiekből következően, ha a mintában egy fémnek csak a teljes koncentrációját adjuk meg, ahogy azt eddig a nyomelem-analitikában tettük, az nemcsak hogy hiányos, de gyakran még félrevezető információval is szolgálhat a minta tulajdonságairól. Hogy miként jutunk hozzá a fentebb említett molekuláris információkhoz, jelenleg az egyik legnagyobb kihívásnak számít az analitikai kémiában.

Míg a nyomelemek gyakran közvetlenül meghatározhatók az ismert műszeres optikai, elektroanalitikai, radioanalitikai módszerekkel, addig a speciációs analízisnél a detektálást mindig meg kell előznie egy elválasztási lépésnek. Adott esetekben a klasszikus nyomelem-analitika is alkalmaz elválasztást, például nyomelem dúsítás vagy a zavaró matrixanyag eltávolítása végett. Korábban azonban minden esetben a nyomelem összes formája együtt és egyidejűleg kerül detektálásra. A speciációs analízis során azonban az elemezni kívánt nyomelem minden eltérő vegyérték- és kötésformáját egymástól is elválasztjuk, és külön-külön detektáljuk. Utóbbi feladat sikeres megoldása különböző háttérrel rendelkező kutatókat követel meg: kémikust, biológust, talaj és üledékkutatót, fizikust és az élelmiszerek, gyógyszerek különböző szempontjait vizsgáló specialistát, akik tapasztalatának együttes, komplex alkalmazásával lehet eredményt elérni.

A speciációs analitikában vizsgált elemek köre

A 122. ábrán jelzett elemek az átmeneti, másodfajú és a félfémek csoportjába tartoznak. A speciációs analitika érdeklődése azért fordult elsősorban ezen elemek felé, mert fontos élettani hatással rendelkeznek, és toxicitásuk nagyban függ attól, hogy milyen vegyértékűek és milyen kötésállapotban fordulnak elő a természetben és a biológiai, humánbiológiai mintákban.

122. ábra A speciációs analitikában leggyakrabban vizsgált elemek köre

Mintatípusok a speciációs analitikában

A 6. táblázatban ugyancsak a teljesség igénye nélkül foglaltuk össze azokat a különböző vegyértékállapotú és különböző kötésben levő elemformákat (többnyire elemorganikus vegyületeket), amelyek ma a speciációs analitika fókuszában állnak.

(6). táblázat - Az eddig leggyakrabban vizsgált elemformák a speciációs analitikában [103]

Redoxi FormákAlkilezett elemformákEgyéb C-hetero- atomos formaMetallo peptidekMetallo gyógyszerekEgyebek

Se(IV)/Se(VI)

As(III)/As(V)

Cr(III)/Cr(VI)

Co(II)/Cr(III)

MenEtmPb4-m-n

MenSn(3-n)+

BunSn(3-n)+

PhnSn(3-n)+

Me2Hg

Et2Hg

MeHg+

MeCd+

Me2Cd

MenGe4-nPb(4-n)+

Metilarzénsav

Cymantren- származékok

Szelén-aminosavak

Szerves arzén-vegyületek

Arzenocukrok

Fitokeratinok

Cadystinek

Metallothioninok

Ceruloplazmin

Transzferrin

Metalloenzimek

Hem-proteinek

Fém-kötő Membrán- proteinek

Ciszplatin

Karboplatin

Aurotiomalat

Aurotioglükóz

Auranofin

Tc-nyomjelző reagensek

Aminosav-fémkomplexek

Metallo-porfirinek

Ferrocén-származékok

Kobalaminok


A speciációs analízis kapcsolt módszerei

A mintegy két évtizede megindult speciációs analitikát az első időszakban olyan munka- és időigényes módszerek jellemezték, mint a folyadék-folyadék extrakció, ioncsere, együttlecsapás, elektrokémiai eljárások stb., amelyek nyomelemekre alkalmazva számos hibalehetőséget is magukban hordoztak. A 80-as évek végén jelentek meg azok a kombinált eljárások, amelyek esetén valamilyen kromatográfiás elválasztó módszert atomspektrometriával, mint elemszelektív detektorral kapcsoltak össze. Utóbbi módszereknek egyebek mellett az a közös előnyük is megvan, hogy a korábbi eljárások legtöbbjétől eltérően megvalósult az on-line elemzés lehetősége. Egy kombinált módszer on-line elrendezése azt jelenti, hogy az elválasztó egység folyadékáramába juttatott minta a komponensek szétválása után e folyadékárammal (vivőfolyadékkal vagy eluenssel) együtt közvetlenül bejut a detektorba. Így néhány másodperccel az elválasztás után megtörténik e komponensek detektálása, meghatározása is.

Az utóbbi években az on-line kapcsolt technikák igen változatos típusait fejlesztették ki. Ezek között mindmáig központi helyet foglal el a kromatográfia és a spektrometria kombinációja. Az e kombinációban eddig kipróbált főbb módszereket a 123. ábrán foglaltuk össze.

123. ábra A speciációs analitikában használt főbb kapcsolt technikák

Egy folyadékkromatográf hagymányosan többek között UV detektorral működik. Az elválasztó oszlopot követően a spektrofotométer fényútjában elhaladó mintafrakciók (főleg szerves molekulák) fényelnyelése jól érzékelhető, de az ilyenkor regisztrált kromatogramból nem kaphatunk választ arra, hogy az adott szerves molekula milyen toxikus vagy esszenciális elemet tart éppen kötésben. Ez az, amiért a kromatográfiás technikák összekapcsolása az atomspektrometriával (FES, AAS, ICP-AES, ICP-MS módszerekkel) az analitikai lehetőségek új dimenzióját nyitotta meg.

Krómspeciációs módszerek

A toxicitásban mutatkozó nagyfokú eltérésekre tipikus példa a króm. A króm a természetben két viszonylag stabil vegyértékállapotú formában, króm(III) és króm(VI) alakban található. E két forma környezetre, biológiai rendszerekre gyakorolt élettani hatása teljesen ellentétes. Míg az egyéb, tipikusan toxikus elemnek számító arzén, higany, kadmium, ólom esetén a különböző vegyérték- és kötésállapotú formák toxicitásában inkább csak fokozati különbségek jelentkeznek, addig a króm esetén a két forma közül a króm(III) az élő szervezet számára létfontosságú, a króm(VI) viszont kifejezetten toxikus, rákkeltő hatású. A króm(III) fontos szerepet játszik az élő szervezet anyagcsere-folyamataiban, fokozza számos enzim aktivitását, és stimuláló hatással van a koleszterin- és zsírsavszintézisre [104, 105]. Ebből adódóan a króm(III) különböző komplex vegyületek formájában gyógyszerek, gyógyhatású készítmények alkotójaként kereskedelmi forgalomban is kapható (pl. króm-pikolinát tabletta, Centrum multivitamin és ásványi anyag tabletta, Béres-csepp, stb.)

A króm(III) és króm(VI) ellentétes élettani hatása miatt különösen fontossá vált olyan analitikai módszerek kidolgozása, amelyek segítségével a természetes mintákban (pl. ivóvíz, felszíni víz, tengervíz, vérszérum, vizelet, élelmiszer, gyógyhatású készítmények, stb.) e két vegyértékformát külön-külön meg tudjuk határozni.

A króm(III) és króm(VI) elválasztására és meghatározására a 70-es évektől kezdve számos módszer látott napvilágot, ezek azonban eléggé munka- és időigényesek, valamint számos hibával terheltek voltak [106-112]. A 80-as évek végére már olyan közlemények is megjelentek, amelyek valamilyen kromatográfiás elválasztó eljárás és elemszelektív detektor (atomspektrometriás módszer) kombinációját mutatják be [113-117]. E módszereknek egyebek mellett közös előnyük a korábbi eljárásokkal szemben, hogy megvalósult az on-line elemzés lehetősége. Ez azt jelenti, hogy az elválasztó egység folyadékáramába juttatott minta a komponensek elválása után e folyadékárammal együtt közvetlenül bejut a detektorba, így néhány másodperccel az elválasztás után megtörténhet az elválasztott komponensek atomspektrometriás meghatározása is.

Cr(III)/Cr(VI) elválasztása és dúsítása [118, 119] Az elválasztás azon alapszik, hogy a nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) pumpával továbbított metanoltartalmú eluenshez és a mintahurokba töltött mintához adott tetrabutil-ammóniumsó (TBA-só) a Cr(VI)-tal ionpár-komplexet képez. A rendszerbe iktatott C18-as kolonnán a minta Cr(III)-tartalma (az egyéb szervetlen kationokkal, anionokkal együtt) akadálytalanul áthalad. A Cr(VI)-ionpár-komplex a C18-al való kölcsönhatás miatt viszont határozott késéssel jut keresztül az oszlopon. Ezért a Cr(III) és Cr(VI) egymástól eltérő időszakaszban jut be a detektorba. Következésképpen a két vegyértékformára időben jól elkülönülő két csúcsot kapunk, melynek görbe alatti területe illetve csúcsmagassága arányos a Cr(III) és a Cr(VI) koncentrációjával. Az előbbi elven működő automatizált on-line krómspeciációs rendszer vázlatát az 124. ábrán, a kapott kromatogramot pedig a 125. ábrán mutatjuk be.

124. ábra Cr(III)/Cr(VI) on-line elválasztására kidolgozott automatikus elemző rendszer

125. ábra 2-2 µg/ml Cr(III)/Cr(VI) FAAS detektálással kapott kromatogramja

Cr(VI) on-line kromatográfiás dúsítását az on-line elválasztó rendszer módosításával alakítottuk ki. A dúsításnál, a szeparációhoz hasonlóan azt használtuk ki, hogy a Cr(VI) tetrabutil-ammónium (TBA)-sókkal olyan ionpár-komplexet képez, amely C18 oszlopon megköthető. Eszerint a HPLC pumpa után elhelyezett nagyobb (2-5 ml-es) mintahurokból a Cr(VI)-TBA komplex az oszlopra jutva ott teljes mennyiségében megkötődik, ha a vivőfolyadék ecetsavval pH=3-ra beállított desztillált víz. A megkötődés után egy másik bemérőcsapon keresztül az oszlopról a Cr(VI)-ot 1 ml 60%-os metanollal eluálva a spektrométer atomizáló/gerjesztő terébe jut. A módszer kísérleti elrendezését az 126. ábrán mutatjuk be.

126. ábra Cr(VI) on-line dúsító és atomspektrometriás meghatározó módszer kísérleti elrendezése

Cr(III) dúsítása KH-ftaláttal [120, 121] A Cr(III) dúsítási módszerhez ugyancsak C18-as fordított fázisú kolonna használható. A vizsgálatok szerint, ha C18 oszlopra 0.075 mol/L KH-ftalát tartalmú minta (pH=3.8) vizes oldatát visszük, az oszlopon kialakuló ftalátréteg sajátos szorpciós kölcsönhatás folytán kvantitatívan képes megkötni az oszlopon áthaladó Cr(III) ionokat. Ezt a kromatográfiás szempontból is újszerűnek számító hatás használható ki a dúsítási művelethez. 2-5 ml mintaoldatból megkötött Cr(III)-at 1 ml 80 %-os metanol-víz eleggyel eluálva jut a detektorba. E műveletekhez is az 123. ábrán látható kísérleti elrendezést használtuk.

Cr(VI) szorpciós dúsítása [122, 123] Ez a dúsítási módszer azon az elven alapszik, hogy oldatfázisban előállított bizonyos fémkomplexek adott pH értéken (például a Cr-PDC, pH=1.9-nél) molekuláris szorpcióval kvantitatívan megkötődhetnek hidrofób sajátságú felületeken, ilyen anyagból (teflon, polietilén, PEEK) készült csövek belső falán (szorpciós hurokban). A Cr(VI)-ra szorpciós dúsítással elérhető kimutatási határ javítása érdekében a dúsításhoz használt szorpciós hurkot bemérőcsap segítségével nagynyomású porlasztó folyadékáramába iktattuk. Így a szorpciós dúsítást követő elúciós lépés során a detektáláshoz a pneumatikusnál nagyobb hatékonyságú, nagynyomású (HHPN) mintabevitelt alkalmaztunk. A módszer kísérleti elrendezését a 127. ábrán mutatjuk be.

127. ábra Cr(VI) szorpciós dúsításának és nagynyomású mintabevitellel történő lángatomabszorpciós spektrometriás detektálásának kísérleti elrendezése

(7). táblázat - 7. táblázat. A Cr(VI) különböző on-line elválasztási/dúsítási/atomspektrometriás detektálási módszerrel kapott kimutatási határai

Szeparáló/dúsító eljárásMintabevitelDetektálási módszerKimutatási határ (3σ) ng/ml

Cr(III)/Cr(VI)

PN

FAAS

80.0

szeparálás

HHPN

FAAS

20.0

(TBA-sóval)

HHPN-DES

ICP/AES

4.0

Szorpciós dúsítás

PN

FAAS

2.00

Szorpciós dúsítás

HHPN

FAAS

0.70

Dúsítás C18-on

HHPN

FAAS

0.53

Dúsítás C18-on

PN

ICP-AES

0.36

Dúsítás C18-on

PN

ICP-MS

0.12

Dúsítás C18-on

HHPN

FES (Ac/N2O)

0.020

Dúsítás C18-on

HHPN

FES (Ac/N2O)

0.025*


* Cr(III)-ra vonatkozó kimutatási határ

PN= pneumatikus porlasztás, HHPN= nagynyomású porlasztás, DES= deszolvatálás (A nagynyomású porlasztás során keletkező nagymennyiségű nedves aeroszol kioltja a plazmát. Ezért az analízishez az aeroszolt előzetesen deszolvatálással oldószermentesíteni kell.) FES (Ac/N2O)= acetilén/dinitrogén-oxid lánggal működő lángemissziós spektrométer.

Cornelis és mts.-i vérplazmában végeztek krómspeciációs elemzéseket [124]. Azt vizsgálták, hogy a króm melyik véralkotókhoz, kötődik, melyek felelősek a króm szállításáért a szervezetben. E vizsgálatoknál a véralkotók elválasztásához gyors protein folyadékkromatográfiát (FPLC) alkalmaztak. A fehérje frakciók UV spektrofotometriás detektálása és a króm 51Cr izotóppal végzett radioaktív nyomjelzése segítségével megállapították, hogy a króm 85%-a transzferrinhez, 8%-a albuminhoz és 6-7%-a egyéb véralkotókhoz kötődik.