Ugrás a tartalomhoz

Növényi biotechnológia és géntechnológia

Dudits Dénes, Heszky László

Agroinform Kiadó

3. Növény-sejt-növény rendszer in vitro (Heszky L. és Dudits D.)

3. Növény-sejt-növény rendszer in vitro (Heszky L. és Dudits D.)

A növényi biotechnológia talán legnagyobb előnyét és lehetőségét – az állati és humán kutatásokkal szemben – napjainkban a kifejlett növényi szervezet regenerálásának lehetősége jelenti tenyésztett szomatikus sejtekből. A bevezetésben (1. fejezet) már utaltunk rá, hogy a biotechnológia központjában a sejt áll, függetlenül attól, hogy a genetikai manipulációt molekuláris vagy sejtszintű megközelítéssel végezzük. Ennek oka, hogy a sejt tekinthető a földi élet azon legkisebb egységének, amely genetikailag totipotens és amelyből egy intakt szervezet (növény, állat, ember) reprodukálható. Ennek a folyamatnak az indukciója napjainkig csak a növények és néhány alacsonyabbrendű állat esetében sikerült laboratóriumi körülmények között.

3.1. Dedifferenciálódás és redifferenciálódás

A tenyésztett növényi sejtekből való növényregenerálás az in vitro ontogenezist jelenti, amely folyamat egyik végén a tenyésztett, dedifferenciálódott szomatikus sejt, a másik végén pedig a hajtás vagy gyökér, illetve intakt növény van. E folyamat magába foglalja a tenyésztett sejtek determinációját, ami azok bizonyos fejlődési útra, differenciálódási folyamatokra való programozódását jelenti, továbbá differenciálódásukat, amelynek során az eltérő gének működése következtében különbségek alakulnak ki a sejtek között. A differenciálódás további lépéseiben a sejtek szövetekbe és szervekbe tömörülnek, mely utóbbi folyamatot – szupracelluláris jellege miatt – morfogenezisnek nevezzük.

A többsejtű (esetenként trillió sejtből is álló), magasabbrendű növények minden egyes szerve adott feladatokat lát el, a feladatra specializálódott szövetei, illetve sejtjei révén. A differenciálódott sejtekben a teljes genetikai információnak csak a töredéke működik. Az, hogy egy adott pillanatban éppen melyik részét realizálja – tehát mely génjei vannak bekapcsolt vagy kikapcsolt állapotban –, attól függ, hogy a sejt milyen feladatra specializálódott. Ebből következik, hogy amikor a növényből sejttenyészetet létesítünk, osztódó, még nem differenciálódott merisztéma szöveteket tartalmazó izolátumokat célszerű a táptalajra helyezni. Ilyen sejtek nagy számban találhatók a kambiális és a merisztéma szövetekben, illetve a fejlődő proembriókban. Abban az esetben, ha már differenciálódott sejteket tartalmazó szövetet izolálunk táptalajra, először annak sejtosztódásokon keresztüli dedifferenciálódását kell indukálnunk és fenntartanunk. Erre a célra általánosan használt vegyület a 2,4-D (2,4-diklórfenoxi-ecetsav).

A dedifferenciálódás sikeres indukcióját követően a táptalajra helyezett szövet sejtjeinek intenzív osztódása során kapjuk a kalluszt, amely differenciálatlan, osztódó sejtek tömege. A kalluszosodás természetes és szintetikus citokininekkel, auxinokkal indukálható. A szilárd táptalajra izolált inokulumból fejlődő elsődleges kallusz többszöri átoltással – passzálással – folyamatosan fenntartható és szaporítható. A kallusz folyékony táptalajban való rázatásával elérhető a sejtek leválása, elkülönülése, majd sejtszuszpenzió kialakulása. Növényi sejttenyészeteken általában a rázatott szuszpenziós kultúrákat értjük, de sejttenyészet létesíthető sejt- vagy protoplaszt szuszpenzió táptalajra való szélesztésével, illetve a növényi sejtek fermentálásával is.

A sejtek differenciálódásának indukciója szintén lehetséges in vitro. Ezt nevezzük redifferenciálódásnak, mely folyamat eredménye a növényregeneráció.

3.2. Az in vitro morfogenezis alternatív útjai

A növényregeneráció folyamán az a cél, hogy a differenciálatlan sejtekből növényt kapjunk, tehát az egyedfejlődést (ontogenezist) kívánjuk indukálni. Ez a folyamat a természetben a megtermékenyített petesejtre jellemző, a szomatikus sejtekre – amiből a sejttenyészet is áll – nem.

Az in vitro növényi rendszerben az ontogenezis két fő, alternatív módját sikerült indukálni és fenntartani, a szomatikus embriógenezist és az organogenezist (3/1. ábra).

Kép

3/1. ábra: A morfogenezis alternatív útjai a magasabbrendű növények sejt- és szövettenyészeteiben

A szomatikus embriógenezis, amely mindig egyetlen sejtből indul, morfológiailag eltér a zigotikus embriógenezistől. Nincs, vagy rövidebb a szuszpenzor, nincs vagy kisebb, esetleg több a sziklevél stb.

A merisztéma differenciálódás (organogenezis I.) általában egyszerre több kalluszsejt egyidejű differenciálódásának eredménye (tracheida, merisztéma). A hajtás- vagy gyökérmerisztéma determinációja az auxinok és citokininek arányának változtatásával szabályozható.

A szervdifferenciálódás (organogenezis II.) általában nem közvetlenül a kalluszsejtek, hanem a tenyészetben már differenciálódott merisztéma-, szár-, illetve gyökérsejtek további morfogenezisének az eredménye.

A morfogenezis alternatív útjai nagy előnyt jelentenek a növénybiotechnológusok számára az állati sejtek lehetőségeihez képest, ahol a jelen pillanatban úgyszólván csak az ivarsejt vagy csírasejt az, amely totipotensnek tekinthető. A növények esetében viszont az ivarsejteken kívül a szomatikus sejtek is manipulálhatók, és ezek a sejtek az in vitro tenyészetekben százezres, sőt milliós nagyságrendben állnak rendelkezésre.

3.3. Növények felnevelése tenyésztett sejtekBŐl

A növényi sejtek totipotenciája és annak in vitro realizálhatósága eddigi szemléletünk módosítását igényli. Ennek lényege, hogy biotechnológiai nézőpontból elméletileg egyenlőségjelet kell tennünk a sejt és a növény közé.

A sejtszintű manipulációt követően a növény – a morfogenezis különböző útjainak indukálásával – regenerálható. A kérdés csak az, hogy a növény-sejt-növény rendszer funkcionál-e az adott faj esetében. A növényi biotechnológia történetének tárgyalásakor már utaltunk az első sikeres növényregenerációra.

Több mint harminc évvel ezelőtt számolt be SKOOG a ma már klasszikussá vált kísérletéről dohánykalluszban. A legtöbb tankönyvben megtalálható szemléletes kísérletével bebizonyította a dohány hormonfüggő organogenezisét. Lényege az, hogy a 2,0 mg/l indolecetsavhoz adott 1,0 mg/l kinetin hajtásfejlődést, a 0,02 mg/l kinetin gyökérfejlődést eredményez a kalluszban. Kísérlete annyira hatásos volt, hogy az azt követő évtizedben a kutatók a növényregenerálásnak csak egyetlen útját tartották lehetségesnek, az organogenezist. Ezt az elméletet vallók még az 1965-ös wageningeni kongresszuson is elvetették egyéb alternatív utak, pl. a szomatikus embriógenezis lehetőségét.

Természetesen állításuk tévesnek bizonyult, és visszamenőleg igaznak tekinthetők a New York-i STEWARD és a berlini REINERT professzor 1958–59-es eredményei, amelyek a sárgarépa in vitro embriófejlődését bizonyították. Végeredményben az ötvenes évek második felétől elvileg adott volt a növény–sejt–növény rendszer in vitro kidolgozásának lehetősége a különböző fajoknál.

Az azóta eltelt időben több száz fajnál számoltak be embriógenezissel, illetve organogenezissel kiváltott sikeres növényregenerációról. Az adatok szerint organogenezissel több növényt (200 faj) regeneráltak, mint szomatikus embriógenezissel (70 faj).

Az organogenezis különösen a Cruciferae és a Compositae családokra jellemző. A szomatikus embriógenezis az Umbelliferae család speciális ontogenetikai útjának tekinthető. A legjobban regeneráló családok közül a Solanaceae, a Fabaceae és a Gramineae (3/2. ábra) azok, melyekben mind a két fejlődési változat egyaránt előfordul.

Miután röviden áttekintettük a növényregenerálás lényegét és eredményeit, nézzük meg közelebbről azokat az eseményeket, amelyek az ontogenezis sikeres indukcióját követően a tenyészetekben lejátszódnak.

3.4. Organogenezis

Az organogenezis vagy szervdifferenciálódás két fő csoportra osztható, az ún. járulékos merisztémák (hajtás- és gyökér tenyészőkúpok), illetve a járulékos szervek kialakulására (3/1. ábra). Az utóbbiak még további két csoportot alkothatnak, lehetnek vegetatív (gumó, hagyma) és generatív (virág) szervek.

A járulékos (adventív) merisztémák differenciálódása a morfogenezis leggyakoribb útja. A táptalajra helyezett növényi rész sejtjei az indukciót követően intenzíven osztódnak, aminek során a dedifferenciálódott sejtek tömege, a kallusz alakul ki.

Kép

3/2. ábra: A kallusz szelekció hatása a Pucinellia distans tenyészetek morfogenezisére. Organogén kallusz (A1) és gyökérfejlődés (A2); embriogén kallusz (A3) és hajtás- valamint gyökérfejlődés (A4); zöld és albinó növényregeneráció a kallusz szelekció előtt (B) és után (C és D) (Heszky L, Binh D. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növénynemesítés Tanszék, Gödöllő)

E folyamatban az izolátum főleg kambiális- és parenchimasejtjei, de még az olyan specializálódott sejtek is, mint a kollenchima, vesznek részt. A differenciálatlan állapot azonban nagyon labilisnak tekinthető, ezért a tenyésztési feltételek változtatásával a kalluszban különböző differenciálódási folyamatok indukálhatók. A tenyésztés során leggyakrabban vakuolizált parenchimasejtek, illetve tracheasejtek alakulnak ki, de tracheidák, kambium- és floémsejtek is differenciálódhatnak.

A kallusz- vagy sejtszuszpenzió tehát részben differenciálatlan, részben már differenciálódott sejtekből áll, amelyek morfogenetikai potenciálja különböző. Ez az alapja az organogén vagy embriogén típusú kalluszszelekciónak.

A sikeres indukciót követően a differenciálatlan parenchimasejtekből (3/3A. ábra) hálózatos sejtfalvastagodással először tracheidák (szállítószövet-elemek) differenciálódnak (3/3B. ábra). A tracheidává differenciálódott kalluszsejtek vagy nyalábszerűen, vagy centrálisan csoportosulva helyezkednek el (3/3D. ábra).

Kép

3/3. ábra: Hajtásmerisztéma differenciálódás dohány kalluszból (60–250 x). Differenciálatlan kallusz sejtek (A), tracheida (B), merisztematikus sejtek (C). Indeterminált merisztémák kialakulása a tracheida központok körül (D). Hajtáscsúcs differenciálódás során kialakul az epidermisz a szőrképletekkel (E), illetve megjelennek a levél - kezdemények (F) (Heszky L. 1975 nyomán)

Az utóbbi esetben a tracheida központok körül – a második lépésben – apró, kerek, nagymagvú merisztémasejtek differenciálódnak, amelyekből intenzív osztódás eredményeként eumerisztematikus központok (merisztemoidok) alakulnak ki a kalluszban (3/3C–D. ábra). Ez az állapot megfelel az általános vagy indeterminált primordium fejlődési stádiumnak. Tehát ebben a fejlődési fázisban még nem dőlt el, hogy végül is gyökér- vagy hajtásmerisztéma alakul-e ki.

A következő lépésben – a táptalajban levő hormonoktól függően – dől el a szerv típusa, tehát a morfogenezis iránya. A hajtásdifferenciálódás esetében az általános merisztéma kerületi (tunika) és központi (korpusz) tájra különül. A tunika külső sejtrétegéből az egy sejtsoros felületi merisztéma, a protoderma differenciálódik (3/3E. ábra), amelyen később a szőrképletek is megjelennek. A kerületi merisztémákból, a tenyészőkúp csúcsa közelében levélprimordiumok differenciálódnak (3/3F. ábra). Ezt követően megindul a prokambiális, illetve szállítónyaláb-kezdemények differenciálódása. A továbbfejlődés eredménye a levélkezdeményekkel részben takart hajtástenyészőkúp (3/4A-B. ábra).

Kép

3/4. ábra: Hajtás- és gyökérfejlődés dohány kalluszból (25–40x). Differenciálódó hajtás tenyészőkúp és levélkezdemény (A), szállítóelemek körül egyidőben differenciálódó hajtáscsúcsok (B). Kalluszban differenciálódott hajtás tenyészőkúp két levélprimordiummal (C), szállítóelemek körül egyidőben differenciálódó gyökércsúcsok (D), kalluszból fejlődő gyökér (E) (Heszky L. 1975 nyomán)

A gyökérdifferenciálódás esetében az általános merisztémából a gyökértenyészőkúpot felépítő hisztogének alakulnak ki. A 3/4D-E. ábrán a kalluszból fejlődő gyökerek szerkezetében felismerhető a kaliptra, a peribléma, a pleroma és a dermatogén. A gyökérszőrös zóna és a megnyúlási szakasz élesen nem különíthető el. A pleromában a kallusz tracheida központjához kapcsolódó szállítónyalábok fokozatos kialakulása is megfigyelhető (3/4D. ábra).

Egy-egy tracheida központ körül egyszerre több merisztéma is differenciálódhat, amit gyökér esetében a 3/4D. ábrán, a hajtás esetében a 3/4B. ábrán mutatunk be.

Végeredményben az organogenezis során egypólusú tenyészőkúpok alakulnak ki, melyekből vagy hajtások, vagy gyökerek fejlődnek. Az ellentétes pólus differenciálódását általában külön táptalajon kell indukálni (3/5C-B. ábra).

Kép

3/5. ábra: Az organogenezis dohány (A) levélkorong tenyészetben, levélkorong eredetű kallusz- (B); gyökér- (C); hajtás (D); és virágdifferenciálódás (E). (Gyulai G., Heszky L. és mtsai 1995 nyomán)

3.5. A járulékos szervek differenciálódása

Az in vitro hagyma differenciálódást lásd a Járulékos szervtenyészetek c. (5.4.3) fejezetben.

3.5.1. A virág morfogenezise in vitro

Virágok in vitro differenciálódását elsőként két francia kutatónak sikerült indukálnia. Módszerüket KIEM TRAN THANH VAN munkacsoportja fejlesztette tovább 1975-ben.

Lényege, hogy virágzó dohánynövényekről a virágzati szárból felületi nyúzatot – mely az epidermisz- és a szubepidermisz-rétegen kívül két-három parenchimasejtsort is tartalmaz – izolálnak táptalajra.

Az indukció extrém alacsony auxin (naftilecetsav, 10-6 mol) és citokinin (benziladenin, 10-6 mol) koncentráció vagy oligoszacharidok hatására következik be.

Első lépésben merisztéma fejlődik, ami második lépésben virágkezdeménnyé differenciálódik, majd in vitro kialakul a virág (3/5E. ábra).

Az eredményekből az valószínűsíthető, hogy a generatív merisztéma differenciálódásának determinációja a sejtekben már az izolálás előtt in vivo bekövetkezett. Az in vitro feltételek megfelelő körülményeket teremtettek az ontogenezis e generatív irányához.

Ezt erősítették meg az Eleusine coracana vegetatív merisztémájának in vitro eredményei is. A vegetatív merisztémán anélkül alakultak ki a virágrügy kezdemények majd virágok, hogy előtte bekövetkezett volna a dedifferenciálódás. Az indukciót a táptalajba adagolt zeatin váltotta ki, ezt követően a folyamat autonóm módon ment végbe, tehát a virágmerisztéma, virágprimordium kialakulás, majd az egyes virágrészek fejlődése. Ebből arra lehetett következtetni, hogy a vegetatív merisztéma a vegetatív fejlődés helyett képes a generatív (virág) fejlődés információját is realizálni. Végeredményben a merisztéma morfogenetikai szempontból többféle programot is tartalmaz és azok szerencsés körülmények között in vitro ki- vagy bekapcsolhatók.

3.5.2. Gumóindukció in vitro

Az in vitro gumófejlődés a burgonya hajtástenyészeteiben gyakran megfigyelhető folyamat. A gumónak, mint módosult szárnak a kialakulása in vitro feltételekkel befolyásolható. A kereskedelmi volumenű (Tajvan, Új-Zéland) mikrogumó előállítási technológia lényege, hogy a gumóindukciót háromhetes hajtástenyészeteken (30–50 hajtás lombikonként) végzik sötétben. A tenyészetekre folyékony MS-táptalajt öntenek 4 napra. A táptalaj 21% szacharózt, 3,2 x 10-6 mol benziladenint és aminosavakat (3,5-szeres töménységben) tartalmaz. A kezelést követő 14. naptól – a szórt fényben, 16 óra megvilágításban és 25 °C-on inkubált tenyészetekben – hajtásonként egy mikrogumó differenciálódása indul meg a 4. vagy 5. nóduszon. A mikrogumó az adott nódusz levele hónaljrügye helyén alakul ki.

Növekedésük általában 6–8 hétig tart. Végül is mindegyik hajtáson 1 db 0,3–1,0 cm átmérőjű mikrogumót lehet kapni, tehát számuk lombikonként az eredeti hajtásszámnak megfelelően 30–50 db.

A módszer hatékonysága jelentősen javítható a Rita-rendszer alkalmazásával (részletesen lásd a Mikroszaporítás a XXI században c. (5.8.1) fejezetben). A Rita-val egy nóduszos rügyből 10 hét alatt 3 gumó állítható elő. A gumók 50%-a 0,5 g-nál nagyobb volt és belőlük 3–4 hajtás fejlődött. Annak ellenére, hogy a 3 mm-nél nagyobb átmérőjű mikrogumókból is normális növények fejlődnek, a legnagyobb termés a 7 mm-es mikrogumókkal érhető el.

Az in vitro fejlődött gumók nem minden esetben hajtanak ki azonnal. Nyugalmi periódusuk 70–140 napig tart szobahőmérsékleten tárolva.

Hazánkban a nyolcvanas években a Meriklón GT dolgozott ki és alkalmazott egy mikrogumó indukciós rendszert, amelyet a hazai vetőgumó előállítás technológiájába akartak beépíteni, sajnos sikertelenül. Jelenleg Keszthelyen (POLGÁR ZS.) és Nyíregyházán (DOBRÁNSZKY J.) foglalkoznak mikrogumó előállítással.

3.6. Szomatikus embriógenezis

A szomatikus embriógenezis létezésével kapcsolatos vitát a hatvanas években végül is maguk a felfedezők, STEWARD és REINERT professzorok döntötték el, különálló sejtből fejlődő sárgarépa embriók teljes ontogenezise folyamatának bemutatásával.

A 2,4-D megvonásával indukált sárgarépa-embriógenezis első lépéseként a kalluszban nem embriók, hanem az organogenezishez hasonló merisztematikus központok alakulnak ki. A szomatikus embriógenezis ezeknek a merisztemoidoknak a felületi sejtjeiből indul. Elektronmikroszkópos vizsgálatok bizonyították, hogy a néhány sejtes proembrió már teljesen elkülönül a környező sejtektől, rajta plazmodezmákat nem lehet megfigyelni.

Kép

3/6. ábra: Szomatikus embriogenezis szója sziklevél eredetű kalluszban (SEM méretjelzés 10 μ) A sziklevél explantumok korai kalluszosodása, ep: sziklevél epidermisz, me: mezokotil (A); I. kallusz típus: megnyúlt, nem embriogén kallusz sejtek (B, x155); II. kallusz típus: ekválisan osztódó, nem embriogén kallusz sejtek (C, x155); III. kallusz típus: inekválisan osztódó kalluszsejtek (D, x550); kétsejtes (E, x1000) ap: apikális, ba: bazális; háromsejtes (F, x1000); és négysejtes (G, x1000) proembrió; gömb- (H, x20) és szívstádiumú (I, x20) szomatikus embriók (Gyulai G. Kiss E., Heszky L. 1993. Acta Biol. Hung. 44, 189–196 nyomán)

Az embrionálissá vált sejtek (3/6C és D. ábra) először transzverzálisan osztódnak, létrehozva a kétsejtes proembriót (3/6E. ábra). Az apikális sejt longitudinálisan osztódva két utódsejtet hoz létre, így a háromsejtes proembrió T alakú (3/6F. ábra).

A két terminális sejt ezután transzverzális fallal kvadránst (3/6G. ábra), majd periklinális fallal oktánst alakít ki, miközben a szuszpenzorsejt is osztódik. A továbbiakban az embriókezdemény sejtjei periklinálisan osztódnak, melynek eredményeképpen centrális és periferiális merisztématáj különül el. Az in vivo embriógenezishez hasonlóan a hipofízissejt is osztódik.

A fejlődő embrió fokozatos szerveződésének következtében előbb a soksejtes gömb alak (3/6H. ábra), majd a szív- és torpedóstádium (3/6I. ábra) figyelhető meg.

Közben az embrió bipolárossá válik, és a szuszpenzor felőli oldalon a gyökércsúcs, az ellentétes oldalon pedig a sziklevelek kezdenek differenciálódni. A radikula- és a hipokotilkezdemények megnyúlása torpedóstádiumú embriókat eredményez. Ezt követően a sziklevelek fejlődése általában megáll, és megindul az embrió szöveteinek differenciálódása.

Kép

3/7. ábra: Növényregenerálás szomatikus embriógenezis indukcióval a Puccinellia distans kalluszból (SEM) Puccinellia kallusz sejtjei (A, 300x); differenciálódó egyszikű embrió, s = szkutellum, p = plumula, k = koleoptil (B, 150x); csírázó szomatikus embrió, növekvő koleoptillal (C, 150x); kalluszban differenciálódott nagyszámú szomatikus embrióból fejlődött zöld és albinó növények (D). (Binh D, Heszky L., Gyulai G., Kiss E., Csillag A. 1989 nyomán)

Az egyszikű növények szomatikus embriógenezise szintén indukálható in vitro. Az embriók ontogenezisének főbb morfológiai és anatómiai fázisai e növénycsoportok esetében sem térnek el lényegesen a zigotikus folyamatoktól (3/7. ábra). A szomatikus embriógenezist követően a tenyészetekben hajtással és gyökérrel rendelkező növények fejlődnek, de előfordulhat, hogy az egyik pólus fejlődése gátolt. A gátlás a táptalaj módosításával megszüntethető, és a pólus fejlődése könnyen kiváltható.

3.7. Az in vitro szerv- és embriódifferenciálódás molekuláris háttere

Napjaink növényi biotechnológiájának eredményessége nagymértékben függ a tenyésztett sejtekből történő növényfelnevelés sikerességétől. A több évtizedes múltra visszatekintő szövettenyésztési kutatások jelentős tömegű empirikus információt halmoztak fel. Ennek ellenére a növényfelnevelés gyakorlata számtalan bizonytalansági tényezővel terhelt. Nagy kutatási kapacitásokat kíván a módszerek optimalizálása. Egy adott gazdasági növény esetében genotípusonként igen eltérő lehet a regenerációs képesség. Megdöbbentő különbségekhez vezethet a szövettenyészetek viselkedésében a táptalaj összetevőinek megváltozása, a fény- és hőmérsékleti viszonyok módosítása, a kiindulási inokulum megválasztása, a reagáló genotípusok kiszelektálása. A kutatók igen sok energiát fordítanak a táptalajok főbb alkotóelemei közül a növekedési anyagok, a hormonok hatásának tanulmányozásásra. Természetesen hasonlóan fontos az ásványi elemek, a vitaminok illetve szénforrások szerepének tisztázása. Az értékelendő kombinációk száma végtelen, ami méginkább indokolttá teszi általános elvek lefektetését, a molekuláris folyamatok leírását. A technológiai megbízhatóság, a hatékonyság a szövettenyészeti módszerek esetében is megkívánja a próbálgatásos megközelítésektől való elmozdulást. Ezt segíthetik a növények növekedését és fejlődését szabályozó gének izolálása, a hormonok hatásait megvalósító jelátviteli mechanizmusok feltárása, a sejtek osztódását illetve differenciálódását biztosító szabályozó elemek felfedezése. Ezekkel a kérdésekkel részletesen foglalkozik egy, a közelmúltban megjelent tanulmány (DUDITS, 1999), ezért a jelen analízis csak néhány fontosabb szempontot emel ki.

Kép

3/8. ábra A szója knotted (KN1) homeotikus gén cDNS-ének kifejeztetése fodros levelek kialakulásához vezetett dohány transzformánsokban A jobb oldali levél az SR1 kontroll növényről származik. (Török Katalin kísérlete, SZBK, Szeged)

A helyhez kötött életmódból fakadóan a növények esetében az egyedfejlődési program nagyfokú rugalmasságára van szükség, ami részét képezheti egy általános alkalmazkodóképességnek, a mechanikai sérülések vagy a szélsőséges környezeti hatások okozta károsodások mérséklésének. A növekedés és szervképzés flexibilitásának letéteményesei az osztódó sejtekben gazdag merisztématikus szövetek. A gyökér- és hajtásmerisztéma-kezdemények kialakulása már az embriogenezis korai fázisában bekövetkezik, és ezek a merisztémaszövetek biztosítják a növényi test kialakulását, amely folyamat a növény egész életciklusát végigkíséri (lásd RAGHAVAN, 1997). Lényegében merisztémák szerveződésével veszi kezdetét a lombikban történő növényregeneráció is. Merisztématikus struktúrák közvetlenül tenyészetbe vihetők, illetve differenciált szövetek tenyésztése esetén a sejtek osztódásának aktiválásával kell megteremteni a merisztémák kialakulásának feltételeit. Az in vitro lejátszódó szervdifferenciálódás, az organogenezis folyamatának közelebbi megismerését segítheti a gyökér- illetve hajtásmerisztémák működésében szerepet játszó gének felfedezése. Ezek közül kiemelt figyelmet érdemelnek az ún. homeotikus gének, amelyek DNS-kötési képességgel rendelkező ún. homeodomain régiót tartalmazó fehérjéket kódolnak. A hajtásmerisztéma morfogenezisével kapcsolatos homeotikus gének családjának jellegzetes képviselői a KNOTTED (KN1), SHOOT MERISTEMLESS (STM) vagy a MERISTEM L1 LAYER (ATML1) gének, melyek funkciójára mutánsok analíziséből lehet következtetni. A kukorica, a rizs vagy a szója KN1 gének kifejlesztése erős, konstitutív promoterrel dohány- illetve Arabidopsis növényekben növekedésgátláshoz, az apikális dominancia mérsékléséhez és a levelek fodrosodásához vezetett (3/8. ábra). Több esetben hajtáskezdemények fejlődése figyelhető meg a transzformánsok levelein. Fontos észrevétel, hogy ezekben a transzformáns növényekben megemelkedett citokinin-szintet lehetett kimutatni. Ennek tudható be, hogy csökkenthető a táptalajba adott kinetin szintje, ami szükséges a hajtások differenciálódásához (3/9. ábra). A növényi hormonok és a hajtásregeneráció közötti kapcsolatot a szövettenyésztési eredmények már sokoldalúan igazolták. A KN1 génnel kapcsolatos eredmények azt mutatják, hogy a hajtásképződés folyamatát a fejlődési programot meghatározó gének is meghatározzák, talán éppen a hormonháztartás befolyásolása révén.

Kép

3/9. ábra A szója knotted (KN1) gént hordozó dohány transzformánsokban megváltozott a hormonok mennyisége. Így már a táptalaj hoz kis mennyiségben (0,2 mg/l) adott kinetin több hajtáskezdemény differenciálódását indukálta (Miskolczi Pál kísérlete, SZBK, Szeged)

A gyökérmerisztéma kialakulását szabályozó gének működésére szintén mutánsok vizsgálatával következtethetünk. Az Arabidopsis ROOT MERISTEMLESS (RML1,2) gének mutációját hordozó növények esetében az embriogén gyökérfejlődés normális, de a későbbi gyökérnövekedés jelentősen gátolt a sejtek osztódásának hiánya miatt. A tenyésztett szövetekben lejátszódó gyökérfejlődés sok vonatkozásban hasonló tényezők befolyása alatt áll, mint amelyek az oldalgyökerek kialakulását idézik elő. Mindkét esetben az auxinok, mint az indolecetsav (IES), kulcsszerepet játszanak. Az ABERRANT LATERAL ROOT FORMATON (ALF) mutánsok segíthetnek az IES szerepének megértésében. Így az ALF1-1 gén hibája folytán túlzott mértékű oldalgyökér-kialakulás figyelhető meg, amely IES-túltermelésre vagy emelt auxinérzékenységre vezethető visz-sza. Az ALF4-1 gén terméke szükséges lehet ahhoz, hogy a periciklus sejtjei érzékeljék az auxinhatást vagy képesek legyenek válaszreakcióra. Ezek a mutánsok érdekes kísérleti anyagot adhatnak a szövettenyészetekben lejátszódó gyökér-differenciálódás tanulmányozásához is. A növények tenyésztett testi sejtjeiben lejátszódó embriógenezis az egyik legizgalmasabb fejlődésbiológiai jelenség, amely alapvetően megkülönbözteti a növényeket a többi magasabb rendű eukarióta szervezettől. Gondoljunk csak arra, hogy milyen bonyolult beavatkozásokra volt szükség a totipotencia kialakításához a juh differenciált sejtjeiben (WILMUT és mtsai, 1997). A növények esetében a sejtek átprogramozhatósága, az egyedfejlődési program újraindíthatósága széleskörűen megfigyelt, általános képesség. Az előző fejezetben a sárgarépa-embrió kialakulásához szükséges szövettenyésztési lépéseket láthattuk. Szomatikus embriók természetesen a gabonafélék szövettenyészeteiben is kialakulhatnak. Éretlen embriók, a fiatal levelek alsó régiói vagy a kalászorsó kitűnő kiindulási anyagnak bizonyultak embriogén tenyészetek létrehozásához. Kérdés az, hogy a szövettenyésztési tapasztalatokat értékelve tudunk-e közös, kulcsfontosságú faktorokat megjelölni, amelyek az embriogén-program elindításához szükségesek. A kísérletek végeláthatatlan sora demonstrálta, hogy a szintetikus auxin, a 2,4-diklórfenoxiecetsav (2,4-D) nélkülözhetetlen az embriogén tenyészetek létrehozásánál. A 2,4-D azon túl, hogy a folyamat elindításában játszik szerepet, fajtól, tenyészettől függően gátolhatja az embriók végső kifejlődését. Ezért szükséges a 2,4-D megvonása vagy alacsonyabb koncentráció használata. Az auxinok, így a 2,4-D, a sejtekben bonyolult jelátviteli hálózatot aktiválnak, amelyek kezdve a membránok polarizáltságának megváltoztatásával, receptorok, GTP-kötő fehérjék közreműködésével az inozitol-1,4-biszfoszfát szintjének emelkedését okozzák, ami Ca2+-t szabadít fel az endoplazmatikus retikulumból. Lényeges a pH-változás szerepe az embriogén aktivációban. A Ca2+ jel továbbításában Ca2+-kötő fehérjék, enzimek (kalmodulin, Ca2+ függő kinázok, foszfatázok) vesznek részt. A jelátviteli út végén a transzkripciós változások – gének kikapcsolása, új gének aktiválása – következnek be. Igen jelentős a c itoszkeleton átstrukturálódása. A mikrotubulus-hálózat rendezettsége fellazul, majd bekövetkezik a hormonkezelt sejtek osztódása. A hormonaktivált sejtosztódás alapvető feltétel ahhoz, hogy a tenyésztett sejtekben az embriogén program elinduljon. További nagyon lényeges követelmény, hogy az osztódás aszimmetrikusan játszódjon le és polaritás alakuljon ki. Az embriogén sejtek kisebbek, sűrű citoplazmával rendelkeznek, és az egymás utáni osztódások kompakt, térfogatában behatárolt, többsejtű, gömb formájú embriogén struktúrák kialakulásához vezetnek. Ezzel szemben az embriogén indukció hiányában a nagyobb térfogatú sejtekből szimmetrikus osztódásokon keresztül organizálatlan kalluszszövetek alakulnak ki. Ivaros megtermékenyítéskor a zigóta első osztódása szintén aszimmetrikus. Az apikális sejt biztosítja az embrió, míg a bazális sejt a szuszpenzor kialakulását (lásd 3/6. E ábra). Feltételezhető, hogy a morfológiai hasonlóságon túl az embrió-differenciálódást biztosító jelátviteli mechanizmusok, a fejlődési programot megvalósító gének hasonló szerepet töltenek be a két sejtrendszerben.

A 2,4-D-vel kiváltott embriogén sejtállapot egyrészt visszavezethető az auxinhatásra, a sejten belüli auxinszint megemelkedésére, a pH-változásra. Másrészt kísérletesen igazolható a stressztényezők fontos hozzájárulása az embriogenezis elindításához. Sebzés, hő- vagy ozmotikus sokk, fémion-toxicitás egyaránt elősegítheti az embriók kialakulását. Ezzel összefüggésben megfigyelhető számos stresszgén aktiválódása az embriogén indukció során. A hősokkgének mellett a ferritin vagy méregtelenítő enzimek génjei szintén működésbe lépnek. Természetesen Northern hibridizációval kimutatható az auxin-aktivált gének mRNS-szintjének megemelkedése. Ugyanígy működésbe lépnek a sejtosztódást szabályozó ún. sejtciklus gének is. Megjelennek az embriogén sejtekre jellemző extracelluláris fehérjék. A szív és torpedó stádiumú embriókon megfigyelhető a merisztémák kialakulása. Az embriógenezis egyes fázisai igen hasonlóak a zigótikus és szomatikus embriók esetében. A szomatikus embriók alapját képezhetik hatékony szaporítási technológiák kidolgozásának. A feltárt molekuláris folyamatok ismeretében új lehetőségek nyílhatnak olyan megtermékenyítés nélküli magképződés biztosításához, amelyek az apomixis jelenségén alapulnak. Mind az apomixis, mind a szomatikus embriógenezis felhasználható a hibridhatás rögzítésében és új szaporítóanyag-előállító módszerek kifejlesztésében.

3.8. A növényregenerálás eredményei

A különböző biotechnológiai eljárások objektumai a szomatikus sejteken kívül haploid ivarsejtek, illetve protoplasztok is lehetnek. A haploid morfogenezis különböző útjaival, az androgenezissel (4.2.1; 4.2.2 fejezetek), a ginogenezissel (4.3 fejezet) stb. az „Ivaros szaporodás biotechnológiája” c. 4. fejezetben, a protoplasztnövény rendszerrel pedig a „Szomatikus hibridizáció protoplasztfúzióval” c. 6.3. fejezetben foglalkozunk. Ebben a pontban a legfontosabb kultúrnövényekre vonatkozóan összefoglalva mutatjuk be a növényregenerálás helyzetét szomatikus sejtből, ivarsejtből és protoplasztból (3/1. táblázat).

Kép

A 3/1. táblázat alapján nyilvánvaló, hogy napjainkban még nem minden kultúrnövény esetében állnak készen a rendszerek a gyakorlati alkalmazásra. A szomatikus sejt-növény rendszer készen áll a búza, árpa, rizs, repce, lucerna, dohány, burgonya esetében. A haploid rendszer jól alkalmazható a búzánál, árpánál, rizsnél, repcénél, lucernánál, dohánynál, nyárnál, paprikánál stb.

A legszűkebb keresztmetszetet a protoplaszt-növény rendszer jelenti, melynek gyakorlati felhasználása emiatt visszavonulóban van a 90-es években.

A morfogenezis sikeres indukciójában jelenleg nagyfokú bizonytalanság van a növényi biotechnológia körében. Ennek lényege, hogy anatómiai szempontból ugyan pontosan ismerjük azokat a folyamatokat, amelyeket in vitro indukálnunk kell akkor, amikor a tenyészetekből növényeket akarunk felnevelni, de még jórészt ismeretlenek és csak részben tisztázottak ezeknek a molekuláris előzményei.

Amit nem tudunk, nem több, mint az, hogy nem ismerjük a morfogenezis indukciójában, determinációjában, illetve folyamatában részt vevő, azt szabályozó géneket és azokat az endogén feltételeket, amelyeket a sejtben biztosítani kell ezeknek a géneknek a bekapcsolásához, működéséhez. Ha tudnánk, hogy molekuláris szinten milyen feltételek szükségesek ahhoz, hogy a sejteket a totipotencia realizálására állítsuk át, akkor a növényregenerálás ténylegesen tervezhető és könnyen reprodukálható mérnöki módszer lenne. Amíg nem leszünk ezeknek az ismereteknek a birtokában, addig a sikeres regenerálás jórészt a szerencse és a közvetett tapasztalatok bizonytalan és empirikus megközelítésének függvénye marad.

Felhasznált és ajánlott irodalom

Ammirato. P. V. (1983): Embryogenesis. In: Evans, D. A., Sharp, W. R., Ammirato, P. V. Yamada, Y. (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 1, 82–123. McMillan Publ. Comp., New York–London.

Binh, D. Heszky, L. E., Gyulai, G., Kiss, e., Csillag, A. (1989): Plant regeneration from callus of Puccinellia distans (L.) Parl. Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 18, 195–200.

Binh D. , Heszky L. E. (1990): Restoriation of regeneration potential of long-term cell culture in rice (Oryza staiva L.) by salt pretreatment. J.Plant Physiol. 136, 336–340.

Croes, A. F. Derksen, R., Kemp, A., van Wezel, H. Barendse, G. W M. (1986): Influence of the developing fruit on aging of the floral stalk tissue with respect to flower bud regeneration in vitro. J. Plant Physiol., 125, 61–68.

DUDITS, D. (1999): A sejtosztódás, differenciálódás és az egyedfejlődési program szabályozásának molekuláris alapjai. In: Balázs, E. és Dudits, D. szerk. Növény Molekuláris Biológia: Szemelvények, Akadémiai Kiadó, Budapest.

Gyulai G., Janovszky J., Kiss E., Lelik L., Csillag A., Heszky L. E. (1992): Callus initiation and plant regenration from inflorescence primordia of intergeneric hybrid Agropyron repens L. Beauv x Bromus inermis Leyss. Cv. Plant Cell Reports 11, 266–269.

Gyulai G., Kiss J., Jekkel Zs., Kiss E., Heszky L.E. (1995): A selective auxin and cytokinin bioassay based on root and shoot formation in vitro. J.Plant Physiol., 145, 379–382.

Halperin, W. (1969): Morphogenesis in cell cultures. Ann. Rev. Plant Physiol., 20, 395–418.

Haydu, Z., Vasil, I. K. (1981): Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf tissues and anthers of Pennisetum purpureum Schum. Theor. Appl. Genet., 59, 269–273.

Heszky, L. E. (1973): Investigation at the early stage of embryogenesis into the development of the adventive embryo organized from a cell of the callus tissue in Daucus carota L. Acta Botanica, 22, 303–305.

Heszky, L. E. (1975) : Possible ways of morphogenesis in higher plants tissue cultures. Acta Agronomica, 24, 123–141.

Heszky, L. E., Do, Q. B., Kiss, E., Gyulai, G. (1989): Increase of green plant regeneration efficiency by callus selection in Puccinellia limosa (Schur.) Holmbg. Plant Cell Rep., 8: 174–177.

Kiss E., Heszky L.E., Gyulai G., Horváth Zs., Csillag A. (1991): Neomorph and leaf differentiation as alternative morphogenetic pathways in soybean tissue culture. Acta Biologica 42, 313–321.

Kiss J., Heszky L.E., Kiss E., G. Gyulai (1992): High efficiency adventive embryogenesis on somatic embryos of anther, filament and immature proembryo origin in horse chestnut (Aesculus hippocastanum L.) tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 30, 59–64.

RAGHAVAN, V. (1997): Molecular Embryology of Flowering Plants. Cambridge University Press.

Reinert, J. (1959): Über die Kontrolle für Morphogenese und Induktion von Adventivembryonen in Gewebekulturen aus Karotten. Planta, 53, 318–333.

Skoog, F., Miller, C. O. (1957): Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exper. Biol., 11, 118–131.

Thomas, E., Davey, M. R. (1975): From Single Cells to Plants. Wykeham Publ., London.

Tran Thanh Van, K. (1973): In vitro control of de novo flower, bud, root and callus differentiation from excised epidermal tissues. Nature, London, 246, 44–45.

WILMUT, I., SCHINIEKE, A. A., McWHIR, J., KIND, A. J., CAMPBELL, K. H. S. (1997): Viable offspring derived from fetal and mammalian cells. Nature, 385, 810–813.