Ugrás a tartalomhoz

Élelmiszer-higiénia

Biró Géza (2014)

Agroinform Kiadó

7. A gyors mikrobiológiai vizsgáló módszerek

7. A gyors mikrobiológiai vizsgáló módszerek

Az élelmiszer-mikrobiológiában újabban terjednek a gyors vizsgálati módszerek. Ennek egyik fő oka a HACCP-rendszer elterjedése, amely gyors eredményeket igényel. A gyors vizsgálati módszerek több csoportra oszthatók.

a) Rutin laboratóriumi műveletek gyorsítása

1. A minta homogénezésének új módszerei (ultrahang, rázólombik, Stomacher)

2. Az adagolás és a hígítás automatizálása

3. Az egyszer használatos eszközök alkalmazása (pipetták, Petri-csészék stb.)

4. A leoltási eljárások gyorsítása (prognosztár-módszer, anaerob tenyésztés adott gázösszetétel mellett, petrifilm eljárás)

5. A telep-számlálás egyszerűsítése (képanalizátor, lézeres számláló stb.)

b) A direkt sejtszámlálás újabb módszerei

1. A jó vezetőképességgel rendelkező folyadékban szuszpendált, elektromosan szigetelő tulajdonságú szomatikus sejtek és élesztőgombák egy kapillárison áthaladva az átmenő áramimpulzusok alapján tömegük szerint osztályozva is számlálhatók (PICOSCALE, LABORSCALE, FOSSOMATIC).

2. Sejtszámlálás hidrofób hálózatos memránszűrőn át.

3. Fluoreszcenciás és immunfluoreszcenciás mikroszkópiás eljárás, mely közvetlen eljárásként növeli a kimutatás szelektivitását.

4. Ultrahang echográfia, melynek segíségével a csomagolt élelmiszerek felületének szennyezettsége echogramm felvételével határozható meg.

c) Sejtalkotók szelektív elemzése

1. Penészgombák kimutatása kémiai módszerekkel (kitin, ergoszterin tartalom alapján folyadékkromatográfiával, vagy vékonyréteg kromatográfiával)

2. Limulus-teszt, mellyel a Gram-negatív baktériumok mennyiségére lehet következtetni a hőkezelésen átesett élelmiszerek esetében is. Ennek elve, hogy a Limulus polyphaemus nevű tengeti rák haemolympha-rendszere aktiválható a Gram-negatív baktériumok lipopoliszaharidjának (O-antigén) jelenlétében, amikor gélképződéssel járó „láncreakció’’ indul meg. Az említett rák-féle amoebocytáinak lizátumát az endotoxinnak már nagyon kis mennyisége is koagulálja, ezért az eljárás rendkívül érzékeny.

3. Az ATP meghatározás során luciferin-luciferáz enzimrendszer hatására a mikrobák ATP-je fény kibocsájtása mellett reagál, amelyet fotométerrel mérhetünk. A módszer csak néhány percet igényel.

4. DNS-hibridizációs eljárás: az egyik legfontosabb módszerré válhat, mivel elve a nukleinsavak azonosítására épül. A DNS szálait egyszálúvá választják szét hőkezeléssel, majd lúg hozzáadásával. Ez utóbbira azért van szükség, mert enélkül lehülés után a szétvált szálak újra egyesülnének. Ha ezekhez a szimpla szálakhoz idegen szimpla DNS-t adnak, akkor azok a két szál rokonságától és a környezeti feltételektől függően hibridizálódnak. A baktériumok színtenyészeteit denaturálják (hő, lúg vagy mikrohullámú kezeléssel), majd egy polinukleotid membránhoz kötik azokat. Idegen DNS hozzáadása után inkubáció szükséges és a felesleges reagens alkotórészeket eltávolítják, majd a reakció láthatóvá tétele (vizualizáció) következik. A DNS kinyerésénél fontos elvi szempont, hogy nem jó, ha túl specifikus szakaszt találunk, mert gyakran egy egész genust kell befognunk (Salmonella). Az RNS-t kódoló DNS szakaszok a leginkább konzervatívak, nem mutatnak nagy változatosságot és sok példányban találhatók meg egy sejten belül is. A reakcióban komplementer szálként 20–30 tagból álló szintetikusan előállított oligonukleotidokat használnak, melyeket radioaktív izotóppal jelölnek. Vizualizációra az izotópos módszer helyett lehet immunológiai vagy enzimes módszert is használni. Az eljárás gyakorlati kivitelezésének típusai:

a) a cél és a komplementer DNS egyaránt folyadék fázisban vannak

b) a szendvics hibridizáció esetében a cél DNS-t szilárd fázisra kötött polinukleotid egységekhez kapcsolják, majd ehhez kötődik a folyadék fázisban lévő komplementer DNS.

A módszer érzékenysége két-három nagyságrenddel jobb, mint az immunoassay eljárásoké és még tovább fokozható a polimeráz-lánc reakció segítségével.

d) A mikroba metabolizmus termékeinek kimutatása

1. A reduktáz próbák a mikrobák redoxpotenciál csökkentő hatásának kimutatása alapján működnek (rezazurin-, metilénkék-, nitrátredukciós-próbák). Mivel a különféle mikrobák nem egyforma mértékben változtatják meg a redoxpotenciált, ezért a próbák eredményét nem csíraszámban, hanem csak fokozatban adják meg (Katona, Pusztai 1975).

2. Tejsav, illetve borostyánkősav meghatározás, mely a baktériumok anyagcseréjét követi nyomon.

3. Kénhidrogén és ammónia kimutatása.

4. A mikroorganizmusok anyagcseréje során keletkezett széndioxid mennyiségi meghatározása színreakcióval, radiometriai módszerekkel.

5. Mikrokalorimetria, amely a mikrobák anyagcseréje során termelődött hőmennyiség mérésén alapszik.

6. Turbidimetria mérés, amely a folyadékokban elszaporodott mikroorganizmusok által okozott zavarosságot vizsgálja.

7. A kis szénatomszámú zsírsavak gáz- vagy folyadékkromatográfiás meghatározása, mely főleg anaerob baktériumok meghatározásánál előnyös.

8. Impedancia vagy konduktancia mérés, mely a mikrobák szaporodása során bekövetkező ellenállás vagy vezetőképesség változás mérésén és a mérési görbe elemzésén alapszik. Élelmiszerekben lévő baktériumok és élesztőgombák minőségi és mennyiségi meghatározására alkalmas eljárás a konduktancia mérésén alapuló, teljesen automatizáltan működő BacTrac rendszer. A vizsgálat alapelve az, hogy a mikrobák szaporodását folytonos konduktancia méréssel követi nyomon, majd a szaporodási görbe paramétereit a BacTrac rendszerű számítógépes program értékeli. A módszert eddig nálunk tej és tejtermékek, csokoládé, kakaó, friss saláta, valamint szörpök esetén próbálták ki jó eredménnyel. A legtöbb élelmiszer minta jól vizsgálható a készülékkel, mivel az optikai értelemben vett tisztaság nem feltétele a mérés elvégzésének. A műszer 5 és 55 oC hőmérsékleti tartományban 120 minta mérésére alkalmas. A vizsgálat rendkívül gyors, 3–10 óra alatt eredményt lehet kapni. A készülék beruházás igénye nagy, viszont a működési és a táptalaj költsége igen alacsony.

9. Latex-agglutináció: antigén kimutatásánál az egyenletes méretű latex részecskékhez polivalens H-antisavót kötnek, melyek a szalmonella csillóantigének széles körét tartalmazzák. A reagenst gyanús telepből készített szuszpenzióhoz cseppentjük, vagy akár a szelektív dúsítóból egy speciális nutritív levesbe oltott és 6 órán át inkubált anyagot is használhatunk. A módszer előnye, hogy technikailag egyszerű, eredmények akár egy nap alatt is kaphatók és az eljárás olcsó.

10. Enzimimmun-eljárás (ELISA): enzimmel jelölt ellenanyagot hozunk össze antigénnel. Az ELISA-módszernél (heterogén enzim-immun vizsgálat) az enzim nem befolyásolja az immunreakciót, csak biokémiai megerősítő, jelző rendszerként működik. A módszer működési elve az, hogy a speciális mikroküvetták szalmonella antigénekre előállított monoklonális ellenanyagokkal vannak töltve. A mintában lévő antigén és a kötött ellenanyag között immunkomplex alakul ki, melyhez egy enzimmel jelölt anti szalmonella konjugát kötődik egy ellenanyag-antigén-ellenanyag szendvics komplexet alkotva. ehhez a rendszerhez, mosást követően egy színképző szubsztrátot teszünk, mellyel az enzim intenzív kék elszíneződést ad. Amikor a reakciót egy speciális savas oldattal leállítjuk, a kék szín sárgára változik. A keletkezett szín intenzitását 450 nm abszorbanciánál mérjük.