Ugrás a tartalomhoz

Élelmiszer-higiénia

Biró Géza (2014)

Agroinform Kiadó

4. Fontosabb indikátor és patogén mikrobák

4. Fontosabb indikátor és patogén mikrobák

Az élelmiszerekben sokféle kórokozó fordulhat elő (vírusok, baktériumok, gombák, parazita peték). A patogén, az ételfertőzést illetve ételmérgezést okozó baktériumok kimutatása bonyolult és hosszadalmas eljárás, különösen akkor problematikus, ha az élelmiszerekben nagyon elszaporodott a kísérő mikroflóra. Ebben az esetben a rendszerint kis számban és egyenlőtlen megoszlásban jelenlévő kórokozók csak nehezen tenyészthetők ki. Különösen bonyolult feladat a vírusok és a parazita peték kimutatása (Thatcher, Clark 1977). Ennek a problémának kiküszöbölésére az élelmiszerből a környezetben nagy számban előforduló nem kórokozó, meghatározott mikroba csoportba tartozó könnyen és viszonylag gyorsan kitenyészthető baktériumok meghatározását veszik igénybe (Kiss és mtsai 1974). Ezeket jelző, vagy más néven indikátor mikrobáknak nevezik, jelenlétükből következtetni lehet az élelmiszert ért szennyezés tényére, illetve ennek mértékére (Biró és mtsai 1986). Az indikátor mikroorganizmusok megengedettnél nagyobb számban való előfordulása esetében fokozottan kell számolni patogén mikrobák jelenlétével vagy az általuk termelt toxinok felhalmozódásával.

Az indikátor mikrobák jelentősége abban is kifejezésre jut, hogy fejlődésükhöz ugyanolyan mikroökológiai feltételeket igényelnek, mint a kórokozók, ezenkívül a vizsgálati anyagban általában nagy mennyiségben fordulnak elő és eloszlásuk viszonylag egyenletes.

Az indikátor mikroorganizmusok kimutatásának célja az, hogy segítségükkel könnyen és gyorsan fel lehessen tárni egy gyártási folyamat azon körülményeit, amelyek egészségügyi kockázatot jelentenek a fogyasztó számára.

a) Mikrobaszám (összes élő, aerob és fakultatív anaerob, mezofil és fakultatív pszichrotrof mikrobák száma, összcsíraszám)

Az élelmiszerek többsége fogyasztásra alkalmatlan, ha nagyszámú nem kórokozó mikroorganizmust tartalmaz. Ez jelezheti a gyártásnál felhasznált nyersanyag rossz minőségét, vagy pedig azt, hogy a nem megfelelő módon való feldolgozás, vagy tárolás során volt meg a lehetőség a mikroorganizmusok elszaporodására. Ezáltal jelzi a nem megfelelő gyártástechnológiát, például az elégtelen hőkezelést. Ha magas az élelmiszerben lévő élő mikrobák száma, akkor az csak korlátozott ideig tárolható, vagy tartósító eljárás után is nagy lesz benne a maradék mikroflóra.

Az összes élő mikrobák kimutatásakor 30 oC hőmérsékletű inkubálást alkalmaznak aerob körülmények között, ezért az eljárást aerob és fakultatív anaerob, mezofil és fakultatív pszihrotrof baktérium-szám meghatározásnak is szokás nevezni.

Aerob és fakultatív anaerob mikrobák számának meghatározása

Mezofil aerob és fakultatív anaerob mikrobák a nem szelektív tápagaron (APHA) vagy zselatinos agar felületén, illetve belsejében 30 oC hőmérsékleten 48–72 órán át aerob feltételek között végrehajtott tenyésztés során kifejődött, élő, telepképző baktériumok, élesztő- és penészgombák. Tenyésztésükre folyékony, nem szelektív táptalaj pl. tripton-glukóz-élesztőkivonat leves is használható, ha a vizsgálati anyagban várhatóan kevés a mikrobák száma.

A felületi szélesztéses eljárás

mind a két bemérés 5–5 hígításából párhuzamosan 0,1 cm3 mennyiségeket mérünk megszárított agarlemezek felületére, majd steril üvegbottal egyenletesen elszélesztjük azt. Összesen tehát mintánként 20 lemezt készítünk.

Kép

1. ábra. Aerob és fakultatív anaerob mikrobák számának meghatározása telepszámlálással

A lemezöntéses módszer

az előzőek szerinti összeállításban 1 cm3 mennyiségeket mérünk üres, steril Petri-csészékbe, majd kb. 15 cm3-nyi megolvasztott, majd 45 oC-ra hűtött tápagarral lemezeket öntünk. Bármely eljárással készítjük a tenyészeteket, 30 oChőmérsékleten 72 órán át inkubáljuk azokat. Az értékelés során a kifejlődött jól elkülöníthető mikroba-telepeket megszámoljuk. A telepszám akkor értékelhető, ha az adott lemez felszínének legalább fele részén fejlődtek ki egyenként álló telepek. Ilyen esetben a kapott telepszámot a lemez teljes felületére kell átszámítani. A telepszámláláshoz olyan lemezeket használunk, ahol a kolóniák száma 30 és 300 közötti. Az aerob mikrobák g-onkénti (cm3-enkénti, 100 cm3-enkénti) számát a párhuzamos leoltásokon kapott telepszámok átlagaiból számítjuk ki. Ha a g-onkénti mikroba-szám 300-nál kisebb, akkor a mikrobák számát úgy adjuk meg, hogy az kevesebb, mint g-onként 3,0 x 102. Ilyen minták vizsgálatára az MPN-módszert kell alkalmazni.

Aerob mikrobák számának meghatározása folyékony táptalajban

A minta homogénezése és hígítása a már ismertetett módon történik. Első lépésben a leoltás során a minta párhuzamosan készített alaphígításaiból 10 cm3 mennyiségeket mérünk 3–3 párhuzamos (lombikba kimért) összesen 6 db kétszeres erősségű levesekbe. Ez lesz a 100, azaz a ,,hígítatlan” anyag. A hígításokból 1 cm3 mennyiségeket mérünk 9 cm3 kémcsőbe kiadagolt húslevesekhez, 3–3 párhuzamos felhasználásával (MSZ–364/4–86). A tenyészeteket 30 oChőmérsékleten, 48 órán át inkubáljuk. Pozitívnak értékeljük a kifejezett zavarosodást, üledék- vagy felszíni hártyaképződést mutató csöveket. Negatívnak tekintjük a kristálytisztán maradt tenyészeteket, kétesnek minden egyéb levest. Ez utóbbiakat alapos felrázás után TGÉ-agarra szélesztjük, majd 30 oC-on 48 órán át inkubálás után bíráljuk el.

Kép

2. ábra. Aerobmikrobák számának meghatározása MPN-módszerrel

Automatizált gyors vizsgálati módszerek

Élelmiszerekben lévő baktériumok és élesztőgombák minőségi és mennyiségi meghatározására alkalmas eljárás a konduktancia mérésén alapuló, teljesen automatizáltan működő rendszerek (BacTrac). A vizsgálat alapelve az, hogy a mikrobák szaporodását folytonos konduktancia méréssel követi nyomon, majd a szaporodási görbe paramétereit számítógépes program értékeli. A módszert eddig nálunk tej és tejtermékek, csokoládé, kakaó, friss saláta, valamint szörpök esetén próbálták ki jó eredménnyel. A legtöbb élelmiszer minta jól vizsgálható a készülékkel, mivel az optikai értelemben vett tisztaság nem feltétele a mérés elvégzésének. A vizsgálat rendkivül gyors, 4–10 óra alatt eredményt lehet kapni. A készülék beruházás igénye nagy, viszont a működési és a táptalaj költsége igen alacsony, ezért a beruházás gyorsan megtérül.

b) A kóliform baktériumok és az Escherichia coli higiéniai jelentősége

A kóliform baktériumoknak nevezzük az Enterobakteriaceae családnak a laktózt 30 oC hőmérsékleten bontó nemzetségeit (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Escherichia) melyek az állatok és az ember normál bélflórájának tagjai, ahol lényeges a vitamintermelésük és a kórokozó mikrobák antagonizálása, ezért élelmiszerekben való előfordulásuk esetén bélsár kontamináció lehetősége vetődik fel (Biró és mtsai 1986). Mivel az Escherichia coli a külvilágban általában csak rövid ideig életképes, ezért a friss fekál kontamináció jelzőjének tekintjük. Meg kell azonban jegyezni, hogy bizonyos élelmiszerekben, pl. tej- és tejtermékekben az Escherichia coli kedvező külső feltételek egyidejű fennállása esetén szaporodni is képes, ezért nagyon magas számban való előfordulása nem mindig áll arányban a szennyeződés mértékével (Biró és mtsai 1986).

Azok az Escherichia coli törzsek, amelyek megtapadó képességet biztosító felületi antigénekkel és enterotoxin termelő képességgel rendelkeznek enteropatogéneknek tekinthetők. Ezek a törzsek embert és állatokat egyaránt képesek megbetegíteni. Az enteropatogén Escherichia coli törzsek jellemző 0-, H- és K-antigénekkel rendelkeznek.

Kóliform baktériumok számának meghatározása folyékony táptalajban

A kóliform baktériumokra jellemző, hogy epét vagy epesót tartalmazó szelektív és differenciáló táptalajban 30 oC hőmérsékleten a laktózt gázképződés mellett bontják (MSZ–364012–79, MSZ–3743/1–78).

Döntő módszernél a minta párhuzamosan készített h-ígításaiból 1–1 cm3 folyadékot viszünk 3–3 brillantzöld-laktóz-epe levesbe. Ezután az alaphígításból 10–10 cm3 mennyiségeket pipettázunk nagy kémcsőbe kimért, kétszeres erősségű szelektív táptalajba, hogy elkészíthessük a 10o hígítást. A 10o-tól 104-ig terjedő hígítási sorok készítése során bemérésenként 15–15, így tehát összesen 30 táptalajt oltunk be. A tenyészeteket 30 oC hőmérsékleten 24–48 órán át inkubáljuk. A kétszeres erősségű levesekből – zavarosságuk esetén – normál kacsnyi mennyiséget oltunk tovább egyszeres erősségű szelektív és differenciáló tápoldatba. Az egyszeres erősségű levesekből a kóliform gyanúsakat oltjuk át egy másik ugyanilyen táptalajba. Kóliform gyanúsnak a zavarosodást mutató illetve a Durham-féle erjesztési csőben legalább annak egytized részét kitevő gázképződés mutató tenyészeteket tekintjük. Az újabb leoltásokat további 24–48 órán keresztül 30 oC hőmérsékleten inkubáljuk. A szubkultúrákat akkor tekintjük pozitívnak, ha a Durham-féle cső legalább egytized részéig gázt termeltek. Kóliform negatívnak azok a szubkulturák tekinthetők, amelyekben gázképződés egyáltalán nem figyelhető meg, vagy az erjesztési cső térfogatának egytized részénél kevesebb gáz termelődött.

Kép

3. ábra. A kóliformok számának meghatározása

Kóliform baktériumok számának meghatározása 30 °C hőmérsékleten telepszámlálással

Kóliform baktériumoknak minősülnek a telepszámlálásos módszernél (MSZ–3640/18–1979) a laktózt, epét, vagy epesót tartalmazó szilárd szelektív és differenciáló táptalajok belsejében vagy felületén 30 oC hőmérsékleten a tejcukrot savképződés mellett bontó, jellegzetes telepeket adó mikroorganizmusok.

Döntő vizsgálatnál, mindkét hígítási sorozat megfelelő csöveiből 1–1 cm3-t mérünk steril Petri-csészékbe, majd felolvasztott és 45 oC-ra lehűtött VRBL-agarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után ugyanebből a folyékony agarból még kb. 4 cm3 mennyiséget azok felületére öntünk. A megszilárdult tenyészeteket 30 oC hőmérsékletű termosztátban 24 órán keresztül inkubáljuk, majd megszámoljuk a jellegzetes telepeket azokban a lemezekben, amelyekben számuk 15 és 150 közé esik. A jellegzetes telepek ennél a módszernél sötétpiros színűek és legalább 0,5 mm átmérőjűek.

Az eredmények közlésekor a kapott kóliformszám értékeket általában normál alakban tüntetjük fel.

Ha a kifejlődött telepek száma az alaphígításban nem éri el a 15-öt, akkor az eredményt így adjuk meg, hogy

„a minta kóliform száma kisebb mint

– döntő vizsgálatnál 150/g

– tájékoztató vizsgálatnál 1500/g’’

Ha az alaphígításban a döntő vizsgálat egyik lemezén illetve a tájékoztató vizsgálatnál az egy lemezen egyetlen jellegzetes telep sem fejlődött ki, akkor az eredményt úgy közöljük, hogy

„a minta kóliform száma kisebb mint

– döntő vizsgálatnál 10/g;

– tájékoztató vizsgálatnál 100/g.’’

Escherichia coli számának meghatározása szilárd táptalajon

Döntő vizsgálatnál az Escherichia coli meghatározásakor (MSZ–3640/12–1979) a kóliform pozitívnak minősített telepekből indulunk ki, úgy hogy √n számú kolóniát oltótűvel 2–2 brillantzöld-laktóz-epe levesbe oltunk, majd egyiket 30 oC-os termosztátban, a másikat pedig 44,5 oC hőmérsékletű vízfürdőben inkubáljuk 48 órán át. Escherichia coli gyanúsnak minősítjük a mindkét hőfokon zavarosodást és az erjesztési csőnek legalább egytized részét kitevő mennyiségű gázképződést mutató csöveket. A gyanús tenyészet 44,5 oC hőmérsékleten inkubált tagjaiból VRBL-agarra szélesztünk, majd a lemezeket 37 oC hőmérsékleten egy napig inkubáljuk. A VRBL-agaron kifejlődött jellegzetes telepekkel elvégezzük az IMVIC-próbákat. A próbák eredményének értékelése megegyezik a folyékony táptalajokkal történő Escherichia coli szám meghatározásnál ismertetett módszerrel.

Escherichia coli kimutatása folyékony táptalajban

Döntő vizsgálat alkalmazásánál (MSZ–3640/12–1979) a kóliform pozitív tenyészetek mindegyikéből egy-egy normál kacsnyi mennyiséget oltunk át brillantzöld-laktóz-epe levesbe, majd ezeket 44,5±0,1 oC hőmérsékleten 48 órán át vízfürdőben inkubáljuk (Eijkman-próba). Az elbírálásnál gyanúsnak tekintjük a zavarosodást mutató, valamint a Durham-cső legalább egytized részéig gázt termelt tenyészeteket. Ezekből a csövekből kioltást végzünk VRBL-agar felületére, majd 37 oC-on 24 órán át inkubáljuk azt. Feltételezetten Escherichia coli-nak tekintjük a 2 mm átmérőjű, kerek, tejcukorbontó, tehát élénk piros színű telepeket. Ezek közül lemezenként 5–5 telepet kiválasztunk, majd zselatinos agarra szélesztünk, és az előzőkhöz hasonló körülmények között inkubáljuk, majd elvégezzük velük az IMVIC-próbákat.

– Az indolképzési-próbánál a triptonvízbe oltott és 24 órán át 44,5±0,1 oC hőmérsékletű vízfürdőn inkubált tenyészethez 0,5 cm3 Kovács-reagenst adunk, összerázzuk, majd egy perc múlva értékeljük. Pozitív esetben a felszínen meggypiros elszíneződés keletkezik.

– Metilvörös-próba végzésénél a telepet pufferolt glükózlevesbe oltjuk, majd 24 órás, 37 oC-on való inkubálás után 1–2 csepp metilvörös reagenst teszünk hozzá. Pozitív esetben az egész leves színe élénkpirosra, negatív esetben pedig sárgára változik.

– A Voges-Proskauer próbához felhasználhatjuk a metilvörös próbánál igénybe vett glükóz-leves egy részét. Ehhez 0,2 cm3 1-naftol oldatot, 0,1 cm3 kálium-hidroxidot, és 2 csepp kreatin oldatot adunk, majd jól összerázzuk. Pozitív esetben 2 óra múlva a tenyészet felső részén rózsaszínű elszíneződés keletkezik.

Kép

4. ábra. Az Escherichia coli kimutatása

– A citráthasznosítási próba elvégzéséhez a vizsgálandó tenyészetet alaplevesbe oltjuk, 4-6 órán keresztül 37 oC-on inkubáljuk, majd belőle oltótűvel citrátos magas-ferde agarba szúrunk és felületén is szélesztünk. 24-48 órás 37 oC-on végzett inkubáció után elbíráljuk. Pozitív reakció esetében a táptalaj eredeti zöldes színe kékre vagy sárgára változik, negatív esetben a táptalaj színe változatlan, és baktériumnövekedés sem figyelhető meg.

Az Escherichia coli kimutatása gyors módszerrel

Az Escherichia coli törzsek mintegy 95 %-a termel ß-D-glükuronidáz enzimet, mely a táptalajba tett megfelelő szubsztrátot (4-metilumbelliferil-ß-D-glükuronid) 4-metilumbelliferonná bontja, amely 366 nm hullámhosszúságú ultraibolya fényben kékesen fluoreszkál. A fluoreszkálás optimuma pH 8,0. Az autofluoreszcencia kiküszöbölése szempontjából lényeges, hogy az UV fényforrás teljesítménye ne haladja meg a 6 W-ot, ezenkívül ebből a szempontból fontos a felhasznált táptalajok ellenőrzése. Meg kell jegyezni, hogy kagylók vizsgálatánál az endogén glukuronidáz aktivitás miatt fals pozitív reakciók is adódhatnak. A módszer előnye hogy gyors, nem igényel átoltásokat és alkalmazásával kimutathatók az anaerob tulajdonságú Escherichia coli törzsek is.

c) Enterobaktériumok kimutatása folyékony tápközegben

Az enterobaktériumok az Enterobacteriaceae-családba tartozó, rövid pálcika alakú mikroorganizmusok. Általában körkörös csillókkal rendelkeznek, a nitrátot nitritté redukálják, a glukózt sav vagy sav és egyidejű gázképzéssel fermentálják, oxidáz negatívak. Az emberi és állati béltraktusban, a felszíni vizekben és a talaj mikroflórában gyakoriak. Az egyes fajok között gyakoriak a biokémiai variánsok és az antigénrokonság (MSZ–3640/10–82).

Döntő vizsgálatnál a párhuzamos bemérésekből készített hígítási sorokból 1–1 cm3-t oltunk brillantzöld-glukóz-epe levesbe 3–3 párhuzamossal, majd a csöveket 37 oC hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk. ezután minden leoltott csőből kristályibolya-neutrálvörös-glukóz epe (VRBG) agarra végzünk kiszélesztést, melyet az előző módon inkubálunk. VRBG-agaron a jellegzetes telepek sötétvörös színűek, ugyanilyen csapadékos udvarral övezettek és legalább 0,5, de általában 2–3 mm átmérőjűek. Közülük biokémiai azonosításra lemezenként legalább kettőt választunk ki, majd a telepekből nutritív agarra szélesztünk és egyidejűleg szőlőcukros magasagarba is leoltunk. A leoltásokat 24 óráig 37 oC-on inkubáljuk. A nutritív agaron kinőtt telepekből kaccsal vagy üvegpálcával kis mennyiséget leveszünk, majd oxidáz-reagenssel előzetesen átitatott szűrőpapírra kenünk, majd 10 mp múlva elbíráljuk. Pozitív esetben a szűrőpapír sötétlila színűre változik. Enterobaktérium esetén a reakció mindig negatív. A szőlőcukros magasagarba oltott baktérium szaporodásakor pozitív esetben, – ha a mikroba csillós, akkor a táptalaj egészére, nem mozgó törzs esetén pedig a szúrási csatorna teljes hosszára kiterjedő sárga színváltozás mellett – általában gázképződés jelei is megfigyelhetők. Negatív esetben a táptalaj eredeti színe nem változik meg, enterobaktérium esetén pedig a reakció pozitív.

Enterobaktériumok számának meghatározása telepszámlálással

Döntő vizsgálat végzésekor a párhuzamos bemérésekből készített hígítási sorozatokból 1–1 cm3-nyi mennyiséget steril Petri-csészékbe mérünk, majd felolvasztott és 45 oC-ra hűtött VRGB-agarral lemezeket öntünk (MSZ-364O/21-83). Megszilárdulás után még kb. 4 cm3-nyi táptalajt öntünk a felszínükre, majd a fedőréteg megdermedését követően 37 oC-on 24 órán át inkubáljuk a lemezeket. Az értékelés során azokat a tenyészeteket vesszük figyelembe, amelyeken a jellegzetes telepek száma 15 és 150 közötti. Jellegzetesnek tekintjük a sötétvörös színű, és ugyanilyen csapadékkal körülvett, legalább 0,5 mm átmérőjű telepeket.

Az azonosításkor a VRBG-lemezekről √n számú, de legalább 5 – ennél kevesebb kolónia esetén mindet – jellegzetes telepet veszünk, majd ezeket egy másik VRBG-agarra szélesztjük, illetve egyidejűleg szőlőcukros magasagarba oltjuk. A leoltott táptalajokat 24 órán át 37 oC-on inkubáljuk, majd a kifejlődött telepek egyikével elvégezzük az oxidáz-próbát. Az oxidáz- és a glukózbontási próbát a már ismertetett elvek szerint bíráljuk el.

Kép

5. ábra. Az enterobaktériumok kimutatása

Tájékoztató vizsgálat alkalmával az egy bemérésből készített hígítási sorozat legalább két egymást követő tagjából megszárított felületű VRBG- vagy glukózos Drigalski-agarra szélesztünk 0,1–0,1 cm3-t. Az inkubálási körülmények megegyeznek a döntő vizsgálatnál leírtakkal, azzal a megjegyzéssel, hogy a glukózos Drigalski-agar felületén a 2 mm átmérőjű, sárga színű telepeket tekintjük jellegzetesnek. Az azonosításhoz használható a nutritív agarlemez helyett Takács-féle zselatinos agar, a szőlőcukros magasagar helyett félfolyékony szőlőcukros magasagar és az oxidáz-próbához pedig mind a háromféle reagens.

d) Pseudomonas aeruginosa kimutatása

A Pseudomonas aeruginosa a Pseudomonadaceae-család Pseudomonas-nemzetségébe tartozó, Gram-negatív, aerob, 1,5–3,0 mikrométer hosszuságú és 0,5–0,8 mikrométer szélességű, egyesével, párosával, vagy rövidebb láncokban fejlődő, egyetlen, a mikrobatest végén elhelyezkedő csillóval rendelkező, önálló mozgásra képes mikroorganizmus. A legtöbb törzs trimetilamin képző tulajdonsága következtében színtenyészetben jellegzetesen aromás (hársfavirág) illatú. A törzsek többsége vízben oldódó fluoreszceint és egy kloroformban oldódó, neutrális vagy lúgos közegben kék színű piocianin nevű pigmentet termel. A glukózt oxidatív úton bontják, oxidáz pozitívak, a nitrátot nitrogén gázzá redukálják, bontják a karbamidot és az acetamidot, elfolyósítják a zselatint, a triptofánból indolt nem termelnek. Nem fejlődnek +4 oC-on, de jól nőnek 42 oC-on.

A Pseudomonas aeruginosa előfordul a talajban, vízben, gennyes sebekben, tőgygyulladásban szenvedő tehenek tejében. Feltételesen kórokozó mikroorganizmus (MSZ–3640/7–80).

Döntő vizsgálat során a mintából két bemérést és homogénezést végzünk, majd a hígításokból MPN-módszer esetén hígításonként 3–3 leoltást készítünk úgy, hogy 9 cm3 nitrofurantoinos leveshez 1 cm3 mintát, telepszámlálás esetén pedig megszárított felületű módosított cetrimid agarra 0,1 cm3 mennyiséget mérünk. A leoltott táptalajokat 41-42 oC-on 48 órán át inkubáljuk, de már egy nap elteltével is megvizsgáljuk azokat. Folyékony táptalajoknál jellemző a fejlődés, ha azok zavarosak és azonkívül felületi hártya is keletkezett rajtuk. Pseudomonas aeruginosa gyanúsak a GMAC-agaron a zöldes színű, gyakran gyöngyházfényű, az acetamid bontása következtében rózsaszínű-pirosas udvarral körülvett, hársfavirágra emlékeztető illatú telepek, továbbá különböző teleptípusaik szerint lehetnek:

– 2–4 mm nagyságú, kerek vagy ovális, enyhén zavaros állományú, sima, ellaposodó szélű vagy

– 4 mm-nél nagyobb, domború, erősen nyálkás felszínűek.

A jellegzetes telepek azonosítása

– A részleges azonosítás során Pseudomonas aeruginosának minősíthetők a GMAC-lemezen jellegzetes kolóniákat képező kékeszöld színű és egyidejűleg a trimetilamin termelés miatt hársfavirág illatú telepek.

– A teljeskörű azonosítás során a jellegzetes telepek közül szélesztésenként kettőt kell tovább vizsgálni akkor, ha azok nem mutatták határozott módon a pigment termelést és a jellegzetes illatot.

Az oxidáz-próbát úgy végezzük, hogy a vizsgálandó telepről lehetőleg üvegbottal viszünk egy kis mennyiséget oxidáz-reagenssel megnedvesített szűrőpapírra, majd 2 percen belül elbíráljuk a kialakult színváltozást. Pozitív a reakció, ha a szűrőpapír sötétvörösre vagy kékre színeződik, míg negatív esetben színe változatlan marad.

Nitrát-agarba oltjuk, majd 37 oC-on 24–48 órás inkubálás után 1 cm3 Griess-Ilosvay-reagenst adunk hozzá. Pozitív reakció esetén egy percen belül létrejövő piros elszíneződés nitrit jelenlétét jelzi. Ha ez nem jelenik meg, cinkport kell a tenyészethez tenni és alaposan összerázni. A cink ugyanis savanyú közegben a visszamaradt vagy elbontatlan nitrátot nitritté képes redukálni. Pozitív a reakció abban az esetben is, ha a cinkpor hozzáadása után színváltozás nem észlelhető, jeléül annak, hogy a nitrát teljes egészében nitrogéngázzá alakult át.

A glukóz aerob oxidációjának és az aktív mozgás vizsgálatánál a vizsgálandó telepeket szúrókaccsal 2–3-szor egymással párhuzamosan, függőleges irányban leszúrjuk félfolyékony szőlőcukros magasagar középső részébe, majd a csövet 37 oC-on 24–48 órán át inkubáljuk. A glukóz oxidatív bontását a táptalajnak csak a felületi részén, maximum 5 mm mélységig a savtermelés következtében sárga elszíneződés jelzi, míg a mélyebb részek piros színűek maradnak. A Pseudomonas aeruginosa a glukózt általában a savtermelés mellett gyenge gázképződéssel bontja. Aktívan mozgó mikrobák nem csak a magasagar felületén és a szúrási csatorna mentén, hanem azon túlmenően is mutatnak mikrobafejlődést.

Az indoltermelést triptofán-levesbe vagy peptonvízbe való oltással vizsgáljuk. A leoltott levest 37 oC-on 16–24 órán át inkubáljuk, majd 0,1 cm3 Kovács-féle reagenst rétegzünk rá. Az indoltermelést jelző meggypiros színváltozás 1–2 perc múlva jelenik meg.

A karbamid bontást az ureum-levesbe való oltást követő 37 oC-on 24–48 órán át tartó inkubálás után bíráljuk el. Ureum hidrolízis esetén a táptalaj eredetileg sárga színe rózsaszínre, majd később lilára változik.

Ha a GMAC-lemezen kifejlődött jellegzetes nagyságú és alakú telepek sem kékeszöld (piocianin) pigmentet nem képeznek, s hársfavirágra emlékeztető illatot sem tapasztalunk, akkor a pigmenttermelés erősítésére azokból alaplevesbe oltunk, majd a tenyészeteket 30 oC-hőmérsékleten 24 óráig inkubáljuk. A piocianint termelő tenyészeteket tartalmazó levesek színe kékeszöldre változik.

Kép

6. ábra. A Pseudomonas aeruginos kimutatása

A termelődött pigment piocianin jellegét úgy erősítjük meg, hogy 1 cm3 kloroformot adunk a tenyészethez. Pozitív esetben összerázás után a kémcső alján összegyűlő oldószer kék vagy kékeszöld színű lesz. A Pseudomonas aeruginosa törzsek egy kis része egyáltalán nem vagy csak kis mértékben termel piocianint.

Az elvégzett azonosító próbák alapján Pseudomonas aeruginosának tekintjük a GMAC-agaron jellegzetes telepmorfológiát mutató kékeszöld színű piocianin pigmentet termelő és hársfavirágra emlékeztető illatú tenyészeteket, ezek hiányában pedig az:

– oxidáz-pozitív

– a komplett nitrátredukciót végző

– aktív mozgással rendelkező

– a glukózt aerob módon oxidáló

– a karbamidot ammóniára bontó

– triptofánból indolt nem termelő izolátumokat,

valamint esetenként levestenyészetekben megerősíthető a gyenge piocianin termelő képességük.

Jelenléti vagy hiánypróba esetén pozitív a tenyésztés, ha a leoltott hat csőből legalább egy Pseudomonas aeruginosa-nak minősül az azonosítás során.

MPN-meghatározás során a pozitívnak minősült tenyészetek alapján számítjuk ki a Pseudomonas aeruginosa számot.

Telepszámlálás esetén a jellegzetes telepekről eldöntjük, hogy melyek igényelnek részleges, és melyek teljes körű azonosítást.

e) Az enterokokkuszok számának meghatározása

Az enterokokkuszok egyrészt mint indikátor mikrobák, másrészt pedig mint ételmérgezést előidéző baktériumok egyaránt jelentősek. Származhatnak friss bélsár-szennyezettségből, de a külvilágban hosszabb időn át is életképesek maradhatnak, ezért nem feltétlenül bizonyítják a friss fekális kontaminációt. Hőkezelt élelmiszerekben termorezisztenciája következtében előfordulhat, ezért jelezheti a hőkezelés elégtelenségét vagy az utószennyezést. Az Enterococcus faecalis a nem spórás baktériumok közül igen ellenálló a környezeti behatásokkal szemben, így a fertőtlenítőszerekkel szemben is, ezért jó indikátora az eszközök és felületek tisztításának, fertőtlenítésének. Ha mennyisége élelmiszerben eléri a 106 nagyságrendet, akkor ételmérgezést is okozhat. Egyesek úgy vélik, hogy egyéb ágens okozza a megbetegedést, viszont ilyen esetekben csak az ellenálló enterokokkuszokat lehet már kimutatni.

Az enterococcusok a Streptococcaceae-család Enterococcus, ezen belül pedig a Lancefield-féle D-szerológiai csoportba tartozó Gram-pozitív, rövid (rendszerint 2–6 tagú) láncokban fejlődő, a láncok irányában kicsit megnyúlt, 0,5–1,0 mikrométer átmérőjű, kataláz negatív, véres agaron általában hemolizáló olyan mikroorganizmusok, amelyek megfelelnek a Sherman-féle kritériumoknak (MSZ–3640/13–1976), ennek megfelelően:

– képesek fejlődni +10 és +45 oC közötti hőfokon;

– túlélik a 60 oC hőmérsékleten végzett 30 perces hőkezelést;

– 6,5% konyhasót tartalmazó tápoldatban, illetve

– pH 9,6 mellett, továbbá

– 0,1% metilénkéket tartalmazó tejben, valamint

– 40% epét tartalmazó véres agaron jól fejlődnek.

Kép

7. ábra. Az enterococcusok számának meghatározása

Élelmiszer-mikrobiológiai szempontból fontos fajok az Enterococcus faecalis (beleértve a var. liquefaciens és a var. zymogenes nevű változatait is), az Enterococcus faecium és a Enterococcus durans.

A döntő vizsgálat történhet MPN-módszerrel, vagy telepszámlálással.

Az MPN-módszernél hígításonként 1–1 cm3 mennyiségeket oltunk 3–3 Raj-, vagy Litsky-Mallmann-féle nátrium-azidot tartalmazó enterococcus dúsító táptalajba, majd a csöveket 37 oC hőmérsékleten 48 órán át inkubáljuk. Pozitívnak értékeljük a zavarosodást, illetve a sárga színátcsapást mutató tenyészeteket.

Telepszámlálásnál a hígításokból 0,1-0,1 cm3 mennyiséget szélesztünk nátrium-azidos vagy nátrium-azidos véres (Packer-agar) lemez felületére, majd 37 oC-on 48 órán át inkubáljuk azokat. Enterokokkusz gyanúsnak tekintjük a lemezek felületén kifejlődött 0,5–1,0 mm átmérőjű, kerek, kissé elődomborodó felszínű, sima, esetleg kissé csipkézett szélű, szürkésfehér-szürkéskék színű, Packer-agaron gyakran hemolízises udvarral övezett telepeket.

Azonosítás során első lépésben a Gram-festést kell elvégezni, MPN-módszer esetén közvetlenül a zavarosodást illetve sárga színátcsapást mutató levestáptalajokból, szilárd táptalajok esetén pedig minden gyanús teleppel.

A kataláz-próbát úgy végezzük, hogy 10%-os hidrogén-peroxidot cseppentünk közvetlenül a gyanús levestenyészetbe. Pozitív esetben élénk pezsgés vagy habzás figyelhető meg, negatív esetben pedig – legfeljebb a hidrogén-peroxid önbomlása következtében – kismértékű buborék képződés látható. Szilárd táptalajokról levett telepekkel – lemezenként öttel – tárgylemez-próbát végzünk. Ennek során tárgylemezre cseppentett 10%-os hidrogén-peroxidba a vizsgálandó telepről levett mákszemnyi tenyészetet keverjük, majd az elbírálást a már ismert módon végezzük. Az enterokokkuszok mindig kataláz negatívak.

A hőtűrőképesség vizsgálatánál a Gram-festéssel és a kataláz-próbával gyanúsnak bizonyult tenyészetekből kacsnyi mennyiséget oltunk át 1–1 húslevesbe, majd 37 oC-on 24–48 órán át tartó inkubáció után a leveseket 30 percen át 60 oC-os vízfürdőben hőkezeljük, majd belőlük alapos összekeverést követően újabb levesekbe végzünk leoltást, melyeket az eredetihez hasonló körülmények között inkubálunk. Inkubálás után a zavarosodást mutató tenyészetekkel ismét elvégezzük a kataláz-próbát és ennek negatív eredménye alapján a tenyészetet enterokokkusznak minősítjük. Az enterokokkusznak minősített csövek számának alakulását a Hoskins-féle táblázat alapján értékeljük. Telepszámláláskor megszámoljuk a lemezeken kifejlődött 10 és 300 közötti jellegzetes kolóniákat, majd az 5 azonosításnak alávetett telep eredményének arányában adjuk meg az enterokokkuszok számát.

f) Szalmonellák kimutatása

Szalmonellának nevezünk minden olyan, az Enterobacteriaceae családba tartozó, peritrich csillós – a Salmonella gallinarum-pullorum és néha a Salmonellatyphi kivételével – önálló mozgásra képes, Gram-negatív, nem spórás baktériumot, amely a kimutatására használt szelektív és differenciáló táptalajokon 24 órás inkubálás után 1–2 mm átmérőjű, enyhén domború, általában sima szélű és áttetsző, 48 órás tenyésztés után kissé nagyobb, sugaras, nyálkás sánccal körülvett telepeket alkot (MSZ–3640/8–1980). A szalmonellák nem bontják a laktózt, a szaharózt, a szalicint, az adonitot és a karbamidot, bontják viszont a glukózt, a mannitot, a maltózt és a szorbitot sav, esetenként pedig gáztermelés mellett. A szerotípusok többsége kénhidrogént termel, triptofánból indolt nem képez, a nitrátokat nitritté redukálja. A fajlagos szalmonella-antisavókkal a rá jellemző szerológiai reakciókat adja.

A szalmonellák biokémiai reakcióinak előfordulási valószínűségét a 7. táblázat mutatja be:

[1]

Kép

Meg kell jegyezni, hogy a %-os értékek az eddig leírt összes szerotípusra vonatkoznak, az egyes országokban és termékféleségekben ezek az adatok módosulhatnak.

Lényeges még tudni, hogy a Salmonella-subgenus-III-ba tartozó törzsek laktóz (és ONPG) pozitívak, míg a Salmonella-subgenus-II-be tartozók között laktóz negatív és ONPG-pozitív törzsek is előfordulnak.

A vizsgálat végrehajtása

A minta elkülönítése: az MSZ 3640/5 előírásai, valamint a hatályos élelmezés-egészségügyi és állat-egészségügyi jogszabályok szerint kell venni.

A minta előkészítése: steril húsdarálón kétszer ledarálni és összekeverni, majd azonnal leoltani. Szükség esetén a homogenizátum 0–5 oC hőmérsékleten legfeljebb 1 órán át tárolható.

A minta mennyisége: legalább 100 g előkészített vizsgálati anyagból 25 g-ot kell bemérni homogénező készülék steril edényzetébe. Felület vizsgálata esetén 100 cm2 felület lemosásával nyert tupfer mintából vagy ismert térfogatú öblítő folyadékból indulunk ki.

Tenyésztési módszerek

Direkt tenyésztés: kétféle szelektív és differenciáló táptalajra szélesztünk, majd ezeket 24 órán át 36±1 oC hőmérsékleten inkubáljuk.

Közvetlen dúsítás: a vizsgálati anyagot közvetlenül visszük a dúsító táptalajokba, majd együtt homogénezzük azokkal. A tetrationátos /Bierbrauer-, vagy Müller–Kaufmann-féle/ dúsítót 42–43 oC hőmérsékleten 16–20 órán át, a szelenites táptalajt pedig 36±1 oC hőmérsékleten 48 órán keresztül inkubáljuk.

Elődúsítással kombinált dúsítás: a vizsgálati anyagot pufferolt peptonvízzel homogénezzük, 1 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, ha szükséges, akkor a pH-értéket semlegesre korrigáljuk, majd 36±1 oC hőmérsékleten 6–16 órán át inkubáljuk.

Az inkubálás után az elődúsítóból 10–10 cm3 mennyiségeket oltunk a közvetlen dúsításnál már említett táptalajokba, majd az ugyanott leírt idő és hőmérséklet mellett inkubáljuk.

Kép

8. ábra. A salmonellák kimutatása

A dúsítók kioltása szelektív és differenciáló agarlemezekre: az inkubálási idők eltelte után mindkét dúsítóból két-két szelektív és differenciáló agarlemezre végzünk kiszélesztést. Az egyik táptalaj a Drigalski-féle, a másik pedig a brillantzöld-fenolvörös agar. A 36±1 oC hőmérsékleten 1 napig inkubált lemezeken megvizsgáljuk a szalmonella-gyanús telepek jelenlétét. Drigalski-féle agaron a jellemző telepek élénk sötétkékek, esetleg kissé szürkék, brillantzöld-fenolvörös agaron pedig lilás színűek. Újabban a Drigalski-féle agar helyett az érzékenyebb és szelektívebb Rambach-agart használják. A Rambach-agar a propilénglikol bontás és a ß-galaktozidáz enzim kimutatása alapján differenciál. Ezen a táptalajon a gyanús telepek piros színűek, de egyes fajok esetében színtelen telepek kialakulása tapasztalható (S. typhi, S. paratyphi A, S. typhi suis, S. gallinarum). A kóliformok ezen a táptalajon kékeszöldek, míg a Proteus és a Shigella nemzetségbe tartozó baktériumok pedig színtelenek.

A táptalajokon kifejlődött 5–5 jellegzetes és nem teljesen jellegzetes telepet tápagarra szélesztünk, hogy biztosan színtenyészetet nyerjünk.

Biokémiai azonosítás

Valamennyi telepet ún. rövid biokémiai sorra oltjuk, mely a 8. táblázatban megadott próbák elvégzéséből áll. Ezt a rövid biokémiai sort még kiegészítik egy ferde agarral, egy húslevessel és a Nógrády-Ródler-féle politróp táptalajjal is. Ez utóbbi táptalaj felhasználásával egyidejűleg vizsgálható a kérdéses baktérium-törzs kénhidrogén termelése, karbamid hidrolízise, valamint a laktóz, a szaharóz és a dextróz aerob és fermentatív bontása.

Szerológiai azonosítás

Az önagglutináció kizárása: a vizsgálandó törzset peptonvizes fiziológiás hígító oldatban szuszpendáljuk egy percig. Az önagglutinációt mutató törzsek szerológiai azonosításra nem alkalmasak.

Az O-antigének vizsgálata: a vizsgálandó törzset polivalens (kereső) diagnosztikai 0-savóban szuszpendáljuk, majd elbíráljuk a keletkezett agglutinációt.

A Vi-antigén vizsgálata: a vizsgálandó törzset Salmonella-anti-Vi-savóban szuszpendáljuk. Salmonella Vi-antigén jelenléte csak akkor igazolt,

– ha a párhuzamosan elvégzett O-agglutináció eredménye negatív, majd

– ha a tenyészet 60 oC hőmérsékleten 60 percen át végzett hőkezelése után az agglutináció eredménye

Vi-savóban negatívvá,

polivalens 0-savóban pedig pozitívvá válik.

A vizsgálati eredmények (biokémiai, lizotipiás, szerológiai) együttes értékelése

Szalmonellák azok a nem önagglutinálódó törzsek, amelyek jellemző módon adják a biokémiai, lizotipiás és szerológiai reakciókat

Feltehetően szalmonellák azok a törzsek, amelyek

– jellemző módon adják a biokémiai és lizotipiás reakciókat, de negatív O- és Vi agglutinációt mutatnak

– a biokémiai és lizotipiás reakciókat nem jellemző módon adják, de agglutinációs próbában pozitívak, vagy

– a biokémiai és lizotipiás reakciókat jellemző módon adják, de önagglutinálódnak.

Nem tekinthetők szalmonelláknak azok a törzsek, amelyek a biokémiai és lizotipiás reakciókat nem jellemző módon adják, továbbá nem adják sem az O-, sem sem pedig a Vi-agglutinációkat.

Döntő szerológiai azonosítás: azokat a törzseket, amelyek szalmonelláknak vagy feltehetően szalmonelláknak minősítünk, kizárás, vagy megerősítés – utóbbi esetben faj vagy szerotípus meghatározása – céljából vagy a Nemzeti Salmonella Központba (Országos Epidemiológiai Központ), vagy pedig a Salmonella Referencia Központba (Országos Élelmiszervizsgáló Intézet) javasolt beküldeni az előzményi adatokkal és egyéb kiegészítő információkkal együtt.

Az eredmények megadásának módja

negatív esetben: „25 g vizsgálati anyagból szalmonella nem volt kimutatható’’.

ha legalább egy lemeztáptalajon szalmonella fejlődött, akkor „25 g vizsgálati anyagból Szalmonella-nemzetségbe tartozó baktérium tenyészett ki’’.

Ha szerotípus meghatározásra törzset küldtünk a referencia laboratóriumba, akkor záradékként még az alábbi közlés is kerüljön be: „A szalmonella pontos meghatározása folyamatban van.’’

Ha a szerotípus meghatározása megtörtént, akkor az alábbi információt írjuk az eredményhez: „A vizsgálati anyagban talált szalmonella a ................. fajhoz (szerotípushoz) tartozik.’’

g) Staphylococcus aureus kimutatása

A Staphylococcus aureus Gram-pozitív, 0,8–1,0 µm átmérőjű, gömb alakú, mikroszkópos képen fürtszerűen rendeződött, tenyészetben többnyire aranysárga színű pigmentet termelő, nem mozgó, a glükózt és a mannitot aerob és anaerob módon bontani képes, 7,5% nátrium-kloridot tartalmazó táptalajban is jól fejlődő mikroorganizmus. Lecitináz enzimet termel, véres agaron hemolízist okoz, az emberből és nyúlból nyert vérplazmát koagulálja, ennek hiányában termostabil dezoxiribonukleáz reakciót mutat.

A Staphylococcus aureus ha 106, estleg kisebb mennyiségben fordul elő az élelmiszerekben, akkor enterotoxin termelése következtében ételmérgezést képes előidézni. Lényeges tudni, hogy az élelmiszerekben található mikrobák száma nem feltétlenül arányos a toxin mennyiségével, mivel ez a mikrobák pusztulása után is hatékony marad. A toxin kémiailag egy hőálló, speciális polipeptid, melynek 30–35 ezer Da a molekulasúlya. Polipeptid jellege ellenére a forralást elviseli. Többféle típusa van, melyek jelölése A, B, C, D, E, és F, közülük leggyakrabban az A és a D okoz ételmérgezést.

A Staphylococcus aureus ellenálló mikroba, amely 6 és 47 oC közötti hőmérsékleten is képes osztódni, 20 és 45 oC között pedig toxint termelni. Szaporodik 4,3–8,0 pH-intervallumban, és 0,86-os vízaktivitási értékig, viszont enterotoxin termelése már 0,92-es av-értéknél leáll.

Döntő vizsgálat végzésekor a mintából két bemérést, illetve két hígítási sort készítünk. Jelenléti, illetve hiánypróba esetén az alaphígítóból párhuzamosan – litium-kloridot, nátrium-kloridot, mannitot, glicint, nátrium-piruvátot és kálium-telluritot tartalmazó – 3–3 Giolitti-Cantoni-féle levesbe oltunk, MPN-módszernél pedig hígításonként 3–3 leoltást készítünk (MSZ–3640/9–85). Telepszámlálásnál 0,1 cm3 mennyiségeket szélesztünk – litium-kloridot, glicint, nátrium-piruvátot, tojássárgája emulziót és kálium-telluritot tartalmazó – Baird-Parker-féle agar felszínére. A leoltásokat 37 oC-on, 24–48 órán át inkubáljuk (MSZ–3640/23–85). Értékelés alkalmával azokat a csöveket tekintjük pozitívnak, amelyek fekete elszíneződést, vagy fekete színű csapadék képződést mutatnak. MPN-szám meghatározása esetén a feltételezetten pozitív csövek után következő első negatív levesből is végzünk leoltást. A Baird-Parker agaron a jellegzetes telepek:

– 24 óra múlva: gombostűfejnyi, szénfekete színű, kerek, domború, sima szélű, csillogó telepek, fehér szegéllyel, melyet kb. 1–3 mm szélességben feltisztult udvar vesz körül.

– 48 óra múlva: a telepek kb. kölesszem nagyságúra növekednek, a feltisztult udvar 3–5 mm szélességűvé válik, ezen felül pedig a telepek egy részénél kb. 2 mm széles opálos zóna is megjelenik.

Staphylococcus aureus-nak minősítjük azokat a tenyészeteket, amelyek a Giolitti-Cantoni levesből, illetve a Baird-Parker agarról továbboltva mikroszkóppal vizsgálva Gram-pozitív fürtök formájában láthatók, koaguláz pozitívak, illetve ennek hiányában termostabil dezoxiribonukleáz pozitívak. A telepszám alapján való értékelés során, ha a telepek kevesebb, mint 75%-a bizonyul Staphylococcus aureus-nak, akkor a mikrobák számát az azonosított telepek százalékos értéke alapján kell megadni.

A jellegzetes telepek azonosítása

A feltételezetten pozitív levestenyészetekből egy-egy kacsnyi mennyiséget Baird-Parker lemezre szélesztünk, majd azt 37 °C hőmérsékleten, 48 órán keresztül inkubáljuk. Inkubálás után az azonosítást lemezenként 5–5 teleppel végezzük el.

Az eredeti lemezeken kifejlődött feltételezetten pozitív telepekből azonosításra kiválasztunk n számú, de legalább 5 kolóniát. Azonosításra olyan lemezeket hasznljunk, ahol a telepek száma 30 és 300 között van.

Azonosító próbák:

A Gram-féle festésnél legalább 2 telepből készítünk kenetet, majd mikroszkópban, immerziós nagyítással vizsgáljuk meg. A kékesfeketére színeződött, szőlőfürtszerűen elrendeződött mikrobák jellemzőknek minősülnek.

Kép

9. ábra. A Staphylococcus aureus kimutatása

Koaguláz-próba

Tárgylemezpróbánál a vizsgálandó telepet tárgylemezen egy csepp vízben elkeverjük, majd hozzáadunk egy csepp előzetesen 37 oC hőmérsékletű termosztátban felmelegített házinyúl vérplazmát és összekeverjük. Pozitív estben 5 másodpercen belül makroszkóposan is látható csapadékképződés jelentkezik. Használjunk pozitív kontrollként Staphylococcus aureus, negatív kontrollként pedig Staphylococcus epidermidis törzseket.

Kémcsőpróbánál a vizsgálandó telepet agy-szív infúziós levesbe oltjuk, majd 37 oC hőmérsékleten, 20–24 órán át inkubáljuk. Ezután 0,1 cm3 mennyiséget adunk 0,3 cm3-nyi házinyúl, estleg humán plazmához, illeve 0,9 cm3 teljes citrátos házinyúl vérhez, pozitív és negatív kontrollcsövek egyidejű beállítása mellett, majd 37 oC fok hőmérsékleten, legfeljebb 6 órán át inkubáljuk. Kettő, négy, és hat óra elteltével a plazmát (vért) alvadásra megvizsgáljuk. Pozitívnak tekintjük az alvadásnak ++, +++, ++++ fokát. Hat óra elteltével a legalább ++-nek minősíthető alvadást nem mutató csöveket negatívnak kell értékelni.

Termostabil dezoxiribonukleáz próba végzésénél a megolvasztott dezoxiribonukleinsavas agarból mintegy 15 cm3 mennyiséget Petri-csészébe töltünk. Megszilárdulás után az agarlemezbe kb. 15–20 µl űrtartalmú lyukat készítünk, utána az előzőleg 15 percen át forró vízfürdőben tartott agy-szív infúziós levesből 15–20 µl mennyiséget a lyukba töltünk, majd 37 oC hőmérsékleten 4 órán át inkubáljuk azt. Pozitív esetben a lyuk körül legalább 1 mm széles rózsaszínű gyűrű alakul ki.

A próbát nemcsak teleppel, hanem közvetlenül az élelmiszerrel is elvégezhetjük. Érzékenysége ebben az esetben 0,005 µg/cm3. Előnye még, hogy a már hőkezelt élelmiszer vizsgálatára is alkalmas, hátránya viszont, hogy a dezoxiribonukleáz kivonása élelmiszerből bonyolult és rossz hatásfokú eljárás.

A szabványok nem írják elő az enterotoxin kimutatását, pedig ételmérgezés szempontjából legfontosabb lenne magának az enterotoxinnak a kimutatása, amely azonban hosszadalmas és bonyolult módszert igényel. A Staphylococcus enterotoxinok 1–2 ng/g érzékenységű kimutatására élelmiszerekből legalkalmasabb eljárás különben az enzim-immun módszer.

h) A mezofil szulfitredukáló összes klosztridium és klosztridiumspóra számának meghatározása

A mezofil szulfitredukáló klosztridiumok a Bacillaceae-család Clostridium nemzetségébe tartozó, 37 oC hőmérsékleten anaerob körülmények között fejlődő baktériumok. Peritrich csillóikkal (kivéve C. perfringens) jól mozgó Gram-negatív pálcák. Spóráik tojás vagy gömbalakúak, centrikusak, szubterminális vagy terminális elhelyezkedésűek. Általában erős szénhidrát és fehérjebontó sajátossággal rendelkeznek. Az emberi és állati béltraktusban, a talajban, vizek üledékében gyakran fordulnak elő. Szulfit tartalmú táptalajokban fekete vagy szürkésfekete színű telepeket képeznek. Véres agaron anaerob feltételek mellett különböző típusú hemolízist okoznak.

A C. botulinum és a C. perfringens élelmiszerek fogyasztása következtében jellemző tünetekkel járó megbetegedést, más fajok pedig az élelmiszerek káros szennyeződését okozhatják (MSZ–3640/16–78).

Döntő vizsgálat végzésekor a minta párhuzamos bemérésekből készített hígításaiból 1–1 cm3 mennyiséget viszünk Takács-Narayan féle félfolyékony szulfitredukciós agarba, 3–3 párhuzamos készítésével. A táptalajt tartalmazó csöveket leoltás előtt legalább 10 percig forrásban lévő vízfürdőben tartjuk az oxigénnyomok eltávolítása végett, majd 42–44 oC hőmérsékletre visszahűtjük. A leoltásnál ügyelni kell arra, hogy a pipettázás során ne keverjünk levegőt a táptalajhoz.

Kép

10. ábra. Mesophil szulfitredukáló összes clostridium és clostridiumspóra számának meghatározása

A forróvízben hőkezelt táptalajokból újabb 3–3 párhuzamos leoltást készítünk, majd ezeket a csöveket 80 oC hőmérsékleten 20 percig hőkezeljük, végül áramló vízben 37 oC-ra hűtjük le azokat.

A 80 oC-on hőkezelt és a leoltás után hőkezeletlen táptalajokat egyaránt 37 oC-on 48 órán át inkubáljuk. Feltételezetten pozitívnak a táptalaj felszíne alatt kb. 1 cm-re kezdődően, illetve ettől lefelé diffúz fekete elszíneződést mutató csöveket, vagy fekete gömböcskék alakjában jelentkező telepeket tekintjük. Negatív esetben az inkubálást még további 24 órán át kell folytatni.

A feltételezetten pozitív táptalajokból kacsnyi mennyiséget szélesztünk cikloszerines-tojásos szulfitagarra, vagy glukóz-véresagar lemezre, majd ezeket 24 órán át 37 oC-on anaerob körülmények között inkubáljuk. Cikloszerines táptalajon a jellegzetes telepek 1–2 mm nagyságúak, rendszerint csipkézett szélűek, esetleg a lecitin-bontás következtében sűrű, fehér opaleszkáló zóna veszi körül azokat (Nagler-féle reakció ), máskor a lipáz pozitivitás következtében felületük gyöngyházfényű. Glukózos véres agaron a telepek szürkés-sárgászöldes-fehér színűek, fényes felületűek, általában -, vagy ß-típusú hemolízist mutatnak.

Az azonosítás első lépésében Gram-festést végzünk, melynek értékelése során klosztridiumoknak minősítjük a Gram-pozitív, rövid, szubterminális vagy terminális, esetleg centrális spórát tartalmazó baktériumokat. A vizes metilénkékkel kontraszt festett tusfestésnél a klosztridiumok tokja fekete környezetben a kékre festődött citoplazma körüli nem festődött szegély formájában látható. a kataláz-próbát a szelektív lemezről választott 2 teleppel végezzük úgy, hogy kacsnyi mennyiségüket kb. 5 cm3-nyi 10%-os hidrogén-peroxid oldatba visszük, majd fél perc múlva elbíráljuk a reakciót. A kataláz-negatív mezofil szulfitredukáló klosztridiumok esetében nem tapasztalunk pezsgést, legfeljebb a hidrogén-peroxid önbomlása következtében kismértékű buborék képződés figyelhető meg. Végül az azonosítás során jellegzetes viselkedést mutató telepek közül kettőt újra vissza kell oltani félfolyékony szulfitagarba.

i) A feltételezetten Clostridium perfringens baktériumok kimutatása

A Clostridium perfringens egyenként, vagy párosával, ritkábban rövidebb láncokban fejlődő, Gram-pozitív, rövid, vaskos, pálcika alakú anaerob baktérium, amely azonban mikroaerofil viszonyok fennállása esetén is szaporodik. általában ß-hemolizáló, kataláz enzimet nem termelő, nem mozgó, tokkal rendelkező baktérium. Spórái legtöbbször szubterminálisan, esetenként centrálisan elhelyezkedők, ovoid alakúak. Spóraképző tulajdonsága az általánosan használt táptalajokon esetleges. A szulfit-ionokat szulfiddá redukálja, lecitináz enzimet termel, a nitrátot nitritté redukálja, a zselatint 48 óra alatt elfolyósítja, a laktózt pedig egyidejű sav- és gázképződés mellett bontja. Optimális szaporodási hőmérséklete 37 oC, de képes fejlődni még 46 oC hőmérsékleten is. Véresagaron – anaerob feltételek mellett – szürkéssárga színű, kiemelkedő, nyálkás felületű telepeket képez, amelyek kerek, vagy ovális alakúak, sima, vagy csipkézett szélűek. A szabvány (MSZ–3640/11–83) a feltételezetten Clostridium perfringens jelenlétének, illetve hiányának, legvalószínűbb számának (MPN-módszer), vagy nagyságrendjének (titer-érték) meghatározását írja elő.

Legvalószínűbb feltételezetten Clostridium perfringens szám meghatározása

A mintából készített hígításokból 1–1 cm3 mennyiségeket oltunk 3–3 szulfit polimixin levesbe. A leoltott táptalajokat 37 oC hőmérsékleten 20 órán át inkubáljuk. A szürkésfekete vagy fekete elszíneződést mutató csövekből normálkacs segítségével átoltást végzünk szulfit-cikloszerines agar felületére, majd az előzőhöz hasonló módon inkubáljuk azt. A jellegzetes telepek legalább 2 mm átmérőjűek, kerekek és fekete színűek.

Azonosítás: az azonosítást legalább 10, véletlenszerűen kiválasztott teleppel végezzük el, úgy, hogy azokat tojássárga emulziót tartalmazó zselatinos agarlemezre szélesztjük ki a lecitináz-foszfolipáz aktivitás vizsgálata céljából. Pozitív lecitináz-foszfolipáz reakció esetén a telepek körül a tojásos agar kezdetben opaleszkálóan feltisztul (lecitináz aktivitás), majd esetenként a telepek felülete a zsírbontás következtében gyöngyházfényűvé válik (foszfolipáz aktivitás). Később a feltisztuló zóna megnagyobbodik, majd a telepeket a zsírsavak kálcium-sóinak kicsapódása következtében sűrű fehér zóna veszi körül. A Clostridium perfringens mindig lecitináz-pozitív, foszfolipáz aktivitást viszont nem mutat.

A vizsgálandó telepet félfolyékony nitrát-agarba oltjuk és anaerob körülmények között 37 oC hőmérsékleten 24 órán át tenyésztjük a nitrát-redukció és a mozgás vizsgálata céljából. A nitrát-redukció vizsgálatát a korábban ismertetettek szerint végezzük. Negatív mozgásvizsgálati próba esetén csak a szúrási csatorna mentén, éles vonalban észlelhető mikroba-fejlődés. A Clostridium perfringens nem mozog, a nitrátot pedig nitritté bontja. Ha csak gyenge nitrátredukciót tapasztalunk, az negatívnak minősül, mivel a Clostridium perfringens nitrátredukciója azonnali és erős.

A vizsgálandó telepekkel beoltunk egy-egy megolvasztott, majd 45 oC -re lehűtött zselatinos laktóz agart, majd anaerob körülmények között 37 oC hőfokon 24 órán át inkubáljuk. A Clostridium perfringens a laktózt egyidejűleg sav- és gáztermelés mellett bontja, ezért a táptalaj színe sárgára változik, felületén pedig gázbuborékok jelennek meg.

A laktózbontás elbírálása után helyezzük a csöveket egy óra időtartamra kb. 4 oC hőmérsékletű hűtőszekrénybe a zselatinelfolyósítás vizsgálata céljából. Pozitív a reakció, ha a táptalaj egy óra elteltével nem szilárdul meg. Ha megdermedt, akkor az inkubálást még egy napig kell folytatni, majd a próbát meg kell ismételni. A Clostridium perfringens a zselatint 48 óra alatt elfolyósítja.

j) Clostridium botulinum kimutatása

A Clostridium botulinum egyesével vagy párosával, ritkán rövid, esetleg hosszabb láncokban fejlődő, Gram-pozitív, obligát anaerob viszonyok mellett növekvő, általában ß-hemolizáló, kataláz negatív, peritrich csillóival önállóan mozgó, rövid, vaskos pálcika alakú baktérium.

Spóraképzésre nagymértékben hajlamos; spórái ovoid alakúak, rendszerint szubterminálisak, ritkábban centrálisak, viszont a spóraérés időszakában terminálisak. Több típusa (A–G) ismert, amelyek a toxin jellege és hőállósága, ezenkívül tenyésztési tulajdonságok (főként hőfok optimum) tekintetében térnek el egymástól.

A Clostridium botulinum által előidézett ételmérgezés elsősorban a toxin kimutatásával történhet, mivel a baktériumot nehéz kitenyészteni.

A Clostridium botulinum szulfit-tartalmú táptalajon redukáló képességénél fogva fekete vagy szürkésfekete, tojássárgáját tartalmazó táptalajokban pedig lecitináz és lipáz aktivitása következtében gyöngyházfényű, jellegzetes opálos udvarral körülvett telepeket képez.

A glukózt egyidejűleg sav és gáztermelés mellett bontja, az adonit fermentálására nem képes, a nitrátokat nem redukálja nitritté. Obligát anaerob feltételek mellett tenyésztett agarlemez felületén szürkéssárga színű, kiemelkedő, nyálkás felületű, sima vagy csipkézett szélű, kerek vagy tojásdad alakú telepekben fejlődik (MSZ-3640/14-1976).

A Clostridium botulinum kimutatása: a Clostridium botulinum mikroba jelenlétének illetve hiányának megállapítása a vizsgálandó anyag meghatározott mennyiségében.

A vizsgálat menete: A húsmintából készített alaphígításból 10–10 cm3 mennyiséget (1 g vizsgálati anyag) elődúsítás céljából Holman-levesekbe oltunk, majd a két táptalaj közül az egyiket a spórák aktivizálása és a vegetatív sejtek elpusztítása végett 80 oC hőmérsékleten 20 percig hőkezeljük. Clostridium botulinum E típusának gyanújakor a hőkezelést 60 oC hőmérsékleten 30 percen át végezzük. Ezután mindkét leoltást szigorúan anaerob körülmények mellett 35 oC hőmérsékleten 2–5 napon át inkubáljuk. A zavarosodást mutató pozitív tenyészetekből átoltást végzünk félfolyékony szulfitredukciós agarba, majd azt 48 órán át inkubáljuk. A diffúz módon szürkülést, vagy feketedést mutató feltételezetten pozitív tenyészetekből azonosítás céljára további vizsgálatokat kell végezni.

Ennek során minden csőből két-két gükóz-véragar lemezre kell széleszteni, melyen 35 oC hőmérsékleten 72 órás inkubációt követően a jellegzetes telepek közepes vagy nagy, domború, fénylő, ép szélű és sima felszínű, rendszerint ß-hemolizáló zónával körülvett formában fejlődnek. Néhány jellegzetes teleppel azonosító próbákat kell végezni.

– Gram-festés során általában szubterminális, ritkábban centrális elhelyezkedésű, nem festődő spóra is látható a magányosan vagy párosával, ritkábban rövid láncok formájában jelenlévő formák mellett.

– Egy-egy megszárított cikloszerines-tojásos szulfit agarlemez egyik felére Clostridium botulinum antitoxint szélesztünk, majd legalább két azonosítandó telepet a felezőre merőlegesen szélesztünk. Pozitív lecitináz reakció esetében a lemez antitoxin mentes részén a telepeket sűrű fehér zóna veszi körül (pozitív Nagler-féle reakció), a lemez másik felében viszont ez a zóna hiányzik, mivel itt az antitoxin közömbösítési próba pozitív.

– Pozitív lipáz reakció esetén a szürkésfekete telepek felülete jellegzetesen gyöngyházfényű.

– Függőcsepp-készítmény fáziskontraszt, vagy ennek hiányában sötét látóteres mikroszkópos vizsgálatakor ügyelni kell arra, hogy a Brown-féle molekuláris mozgástól elkülönítsük a mikrobák aktív mozgását.

– A mozgás vizsgálatot el kell végezni félfolyékony szulfitagarba való oltással is, ahol pozitív esetben a táptalaj diffúz megfeketedése észlelhető.

– A nitrát redukció vizsgálatára 0,3 % agart tartalmazó nitrát-agart oltjuk be, majd 24–48 órás inkubálás után a tenyészethez Griess-Ilosvay reagenst adunk. Pozitív esetben rózsaszínű elszíneződés keletkezik, negatív esetben nincs színváltozás. Negatív próbánál - a komplett nitrát redukció kizárására- cinkport is kell a tenyészethez adni az elbontatlanul visszamaradt nitrát kimutatására. Ebből a cink enyhén savanyú közegben nitritet képez, mely az előbbi reagenssel kimutatható.

– A glükózbontást szőlőcukros félfolyékony agarban vizsgáljuk, ahol 72 órás tenyésztés alatt a sav- és gáztermelés jeleként a tenyészetben gázbuborékok jelennek meg, míg a táptalaj színe a neutrálvörös indikátor jelenlétében sötétvörös színűre változik.

Az adonitvízbe oltott tenyészet színe a 72 órás inkubálás alatt sem változik.

Az eredmények értékelése

Ha a vizsgálat során legalább egy telep Clostridium botulinum-nak bizonyult, és a toxinkimutatási próba is pozitív volt, akkor a vizsgálati jegyzőkönyvben az alábbiakat kell közölni:

„A vizsgálati anyag 1,0 g-nyi mennyisége Clostridium botulinum-ot tartalmaz; a toxinvizsgálat eredménye pozitív’’

Ha a vizsgálat során legalább egy telep feltételezetten Clostridium botulinum-nak bizonyult, de toxinvizsgálatot nem végeztek, akkor a vizsgálati jegyzőkönyvben az alábbiakat kell közölni:

„A vizsgálati anyag 1,0 g-nyi mennyisége feltételezetten Clostridium botulinum mikrobát tartalmaz; toxinvizsgálat nem történt’’

Ha a vizsgálat során legalább egy telep feltételezetten Clostridiumbotulinum-nak bizonyult, de a toxinvizsgálat eredménye negatív eredményű, akkor a vizsgálati jegyzőkönyvben az alábbiakat kell közölni:

A vizsgálati anyag 1,0 g-nyi mennyiségéből a Clostridium botulinum-ra jellemző tulajdonságokkal rendelkező mikroba tenyészett ki; a toxinvizsgálat eredménye negatív.’’

Ha a vizsgálat során egyetlen kiválasztott telep sem bizonyult feltételezetten Clostridiumbotulinum-nak vagy az anyag feltétlen anaerob mikrobákat egyáltalán nem tartalmazott, akkor a jegyzőkönyvben az alábbiakat kell feltüntetni:

Clostridium botulinum a vizsgált anyag 1,0 g-jából nem volt kitenyészthető.

Botulinum toxin kimutatása

A botulinum toxin a Clostridium botulinum különböző típusai által termelt, típusspecifikus, nagy molekulasúlyú, fehérje természetű, rendkívül erős valódi méreganyag. Emberre az A-, B-, E-, és F-toxintípus mérgező, (a G-típussal antitoxikus savó hiányában a szabvány nem foglakozik) halálos adagja mintegy 0,1 mikrogramm. A botulinumtoxin különböző típusai 100 oC hőmérsékleten 3 perc alatt inaktiválódnak (MSZ–3640/15–77).

A vizsgálatot végző laboratóriumban a botulinum toxin kimutatásával foglakozó személyeket toxoid védőoltásban kell részesíteni.

A vizsgálati anyagból vett mintát úgy készítjük elő, mint az előző esetben. Az előkészített minta kb. 6 g mennyiségét 3 cső Tarozzi-féle levesbe, és 3 cső Tripkazin-pepton-glukóz-élesztőkivonat (továbbiakban TPGYT) levesbe osztjuk el. A leoltott táptalajokat 35-, illetve 26 oC hőmérsékleten 5 napig anaerob viszonyok között inkubáljuk. Ezután a tenyészeteket táptalajonként egy-egy centrifugacsőbe összetöltjük és az így kapott két kevert tenyészetet 7000 percenkénti fordulatszám mellett 30 percig centrifugáljuk, majd a szupernatans részt Millipore vagy G-5-ös jelű üvegszűrőn megszűrjük. Lényeges megjegyezni, hogy Seitz-féle szűrő használhatatlan erre a célra, mivel ennek nagy a fehérje adszorbeáló képessége. A centrifugált és szűrt anyagot kétfelé osztjuk. Egyik feléből származó kb. 5 cm3 mennyiséget 10 percig forrásban lévő vízfürdőben tartjuk, a másik felét pH 6,2-es zselatin-foszfát puffer hígítóval 1:5, 1:10 és 1:100 arányban meghígítjuk.

Kísérleti állatoltás: 3x2 fehér egeret a toxin tartalmú kivonat 0,5–0,5 cm3 mennyiségeivel ip. oltunk, majd 2 egeret a hőkezelt kivonat ugyanilyen mennyiségével hasonló módon oltunk be. Ez utóbbiak szolgálnak negatív kontrollként.

Ezután a kísérleti állatokat 5 napon át megfigyelés alatt tartjuk.

Botulinum toxin jelenlétére pozitív a kísérlet, ha

– bármelyik hőkezeletlen hígítással beoltott egércsoport legalább egyik egyede botulizmus tünetei mellett elpusztul, és egyidejűleg a két kontroll egér viszont életben marad

Negatív az állatkísérlet, ha

– valamennyi oltott egér életben marad, csupán a negatív kontroll-csoportban fordul elő nem botulizmusszerű elhullás.

Kétes az állatkísérlet, ha a hőkezeletlen, hígított anyaggal oltott állatok között volt nem botulizmusszerű elhullás, ugyanakkor a kontroll egerek egészségesek maradtak.

Ha az állatoltási próba eredménye pozitív volt, akkor el kell végezni a toxinközömbösítési próbát is.

Toxinközömbösítési próba

Ennek során a vizsgálati anyag 50 g mennyiségéből steril homogenizátumot készítünk, majd pH 6,2-es zsalatin-foszfát puffer hígítóval együtt lecentrifugálás után a felülúszó egy részét 30 percen át forrásban lévő vízfürdőben tartjuk. Ezután öt, 1,2 cm3 mennyiségű hőkezeletlen toxin tartalmú vidál-csőbe 0,3 cm3-nyi A-, B,- és E-(továbbá esetleg C- és D-) botulinum antitoxint tartalmazó savó hígítást adagolunk, melyek egyenként 3–3 NE antitoxinnak felelnek meg. További két Vidál-cső közül az egyikbe nem hőkezelt kivonatot és normál házinyúl savót, a másikba pedig hőkezelt kivonatot és az előbbi normál házinyúl savót adunk pozitív illetve negatív kontroll oltóanyagnak, majd a csöveket 30 percig 37 oC hőmérsékletű termosztátban tartjuk.

A B-, E-, és az F-típusokhoz tartozó nem proteolitikus törzsek esetén a toxin aktivizálása céljából célszerű a toxinközömbösítési próbát tripszin kezeléssel is elvégezni.

Az így elkészített oltóanyagok mindegyikével 2–2 egeret ip. oltunk, majd a kísérleti állatokat az előzőeknek megfelelően figyeljük meg.

Toxinkivédési próba

A mikrobamentes kiinduló vizsgálati anyagból pH 6,2 értékű zselatinfoszfát puffer hígítóval 1:2, 1:10 és 1:100 arányú friss hígításokat készítünk. Az A, B és E antitoxint tartalmazó védősavót fiziológiás oldattal 1:5 arányban hígítjuk. Ezután 6–6 egeret ip. oltunk a háromféle antitoxin hígításaival, majd 30 perc múlva a hattagú egércsoport 2–2 egerét ip. beoltjuk a vizsgálati anyag háromféle hígításával. Pozitív kontrollnak pedig 6 egeret oltunk ip. az 1:2 arányban készült friss hígítással.

A toxinközömbösítési és a toxinkivédési próba elbírálása

Pozitív a próba, ha

– az egyik (esetenként azonban két, igen ritkán három) antitoxint kapott egércsoport életben marad és egyidejűleg

– a pozitív kontrollcsoport egyedei, valamint a többi oltott egerek botulizmusra jellemző tünetek mellett a megfigyelési időn belül elpusztulnak és emellett

– toxinközömbösítési próba igénybevétele esetén a hőkezelésen átesett toxintartalmú kivonatot kapott negatív kontrollcsoport egyedei pedig életben maradnak.

Botulinum toxin kimutatása tartályba zárt gyanús élelmiszerből vagy annak maradványaiból

Folyékony élelmiszer vagy a tartálynak zselatin puffer hígítóval kimosott maradéka közvetlenül vizsgálható. Szilárd halmazállapotú élelmiszert az előzőekben leírt pufferoldattal egyneműsítünk, majd a már ismertetett módon centrifugálunk és szűrünk. A kivonatot hígítjuk és tripszinnel a korábbiak szerint aktivizáljuk. Ezután összesen 14 fehér egeret oltunk; 3x2 egeret ip. a nem tripszinkezelt kivonat tízszeres illetve százszoros hígításaival, majd 3x2 állatot ugyanígy, de a tripszinnel kezelt anyagokkal. Végül két egeret a hőkezelt kivonattal negatív kontrollként oltunk be.

A kísérlet elbírálása megegyezik a korábbiakkal, azzal a különbséggel, hogy pozitív esetben közömbös, hogy az egerek a tripszinnel kezelt, vagy a kezeletlen oltóanyagtól betegedtek meg.

Az eredmény értékelése

Ha a toxinvizsgálat a Clostridium botulinum baktérium kimutatásával egyidőben történik, az eredményt a már korábban ismertetettek szerint kell megadni.

Ha a toxinvizsgálat nem kapcsolódik közvetlenül a Clostridium botulinum kimutatásához, akkor meg kell adni,hogy milyen vizsgálati anyagból történt a toxin kimutatása.

k) Bacillus cereus számának meghatározása

A Bacillus cereus a Bacillaceae család Bacillus nemzetségébe tartozó, 3–5 µm hosszú és 1,0 µm széles, Gram-pozitív, fakultatív anaerob, spórát képező, önálló mozgásra általában nem képes, pálcika alakú baktérium. A glukózt aerob és anaerob módon fermentálni képes a glicerint, a szaharózt és a szalicint eltérő mértékben, az arabinózt, a xilózt és a mannitot pedig nem fermentálja. A nitrátot nitritté redukálja, rendelkezik lecitináz és foszfolipáz aktivitással, bontja a tirozint és 10–45 oC hőmérsékleten szaporodik (MSZ–3640/6–1984).

Spórái általában centrálisak, a pálcák gyakran láncokat képeznek.

A telepek véres agaron tejüvegre emlékeztető, zöldesszürke színű, általában -, ß-, ritkábban pedig - hemolízist mutatnak, laposak, esetenként szemcsézettek. Ha nyúlványaik vannak, ezek gyökérszerűek és az agaron rajzanak. Elegendő vasat tartalmazó táptalajon egyes törzsek piros színű, más törzsei pedig zöld színű, fluoreszkáló pigmentet termelnek. Főként a talajban, a vízben, a tejben, és a melegvérűek bélcsatornájában fordul elő. Feltételesen kórokozó baktérium.

Döntő módszer végzésénél fenolvörös-mannit-tojássárgája-polymixin agarra 0,1 cm3 hígítást szélesztünk, majd a lemezeket 37 oC hőmérsékleten 48 óráig inkubáljuk. A kifejlődött telepek laposak, szemcsézett felületűek, csipkézett szélűek, felületükön gyöngyházfényű és feltisztult vagy széles precipitációs zónával rendelkeznek (lecitináz-foszfolipáz aktivitás), kifejezett lilás háttérrel.

A kifejlődött 15 és 150 közötti számú gyanús telepet megszámoljuk.

Azonosítás

– Gram-festés: kékesfekete színű, láncokba rendeződött, kissé vaskos, rövid pálcák, melyek gyakran spórákat is tartalmaznak. A spórák ellipszis alakúak, centrálisak, vagy szubterminálisak, a baktériumtestet nem domborítják ki.

– Lecitináz-foszfolipáz aktivitás: pozitív esetben a táptalaj a telepek körül feltisztul, majd ezek felülete a zsírbomlás következtében gyöngyházfényűvé válik.

– Aerob és anaerob glükózbontás: a glükózos magasagart 37 oC hőmérsékleten 48 órán át inkubáljuk. Pozitív esetben a táptalaj bíbor színe sárgára változik, gázképződés nem figyelhető meg.

– Nitrátredukció: nitrátlevesbe oltott telepet 37 oC hőmérsékleten 24 óráig inkubáljuk, pozitív esetben a G–I reagens hatására piros elszíneződés keletkezik. Esetenként előfordulhat komplett nitrátredukció is.

– Voges-Proskauer-próba: pozitív.

l) Bacillus anthracis kimutatása

Élelmiszer-higiéniai szempontból a Bacillus anthracis elsősorban a húsvizsgálatnál játszik fontos szerepet. A kórokozó valamennyi emlős állatot és az embert egyaránt megbetegíti, ezért zoonózis szempontból különösen nagy a jelentősége. Leginkább fogékonyak iránta a növényevő állatok, de a sertés is hajlamos a megbetegedésre.

A baktériumra jellemző, hogy Gram-pozitív vaskos, vágott végű pálcika alakú baktérium. Az állati testben burkos formában van jelen, és így fejlődik széndioxidot tartalmazó légkörben is (Belák és mtsai, 1983.). Aerob viszonyok között keltetve viszont spórákat képez, melyek centrálisak és olyan ellenállóak, hogy csak 10 perces forralás, vagy 160 oC hőmérsékletű száraz hő hatására pusztulnak el.

Antigénjei közül legfontosabb egy típusspecifikus poliszacharid (haptén), mely egyaránt ellenáll a hőnek és a rothadásnak is. Kimutatására az Ascoli-féle termoprecipitációs próbát vesszük igénybe.

Ascoli-féle módosított termoprecipitációs próba

Az Ascoli-féle módosított termoprecipitációs próbával a lépfene baktériumok által okozott fertőzöttséget tudjuk szerológiai úton diagnosztizálni. A próbával azonban nem a szervezetben képződött specifikus ellenanyagokat, hanem a fertőzést okozó lépfene baktériumok antigénjeit mutatjuk ki. Ezért a vizsgálatra nemcsak a vérsavó, hanem mindazon szervrész (vagy azokból készült élelmiszer) alkalmas, amely a fertőzött állatból származik. A lépfene gyanúja azonban leggyakrabban a kényszervágott vagy elhullott állatok esetében merül fel, s ilyenkor általában a vért használjuk fel vizsgálati anyagként (Csiszár 1964). A próba gyakorlati kivitelezése: 2–3 babszemnyi tömegű vizsgálati anyagot kb. 5–10-szeres mennyiségű fiziológiás konyhasó oldattal felöntjük, majd hideg vízfürdőbe állítva a forrástól számított 10 percig hőkezeljük. Ezután a kivonatot üvegtölcsérbe tett azbesztgyapoton átszűrjük, és a szűrletet lehűtjük. A próbát rétegezve végezzük el, pozitív és negatív kontrollcső beállításával. Három darab precipitációs csőbe 0,5–0,5 cm3 gyárilag előállított lépfene elleni savót mérünk. Ezt követően a pozitív kontroll csőbe 0,5 cm3 lépfene antigént, a negatív kontroll csőbe 0,5 cm3 fiziológiás konyhasó oldatot, a harmadik csőbe pedig 0,5 cm3 szűrletet rétegezünk.

A próbát 5 perc után elbíráljuk, a végső elbírálás 10 perc múlva történik. A pozitív csővel azt kontrolláljuk, hogy a felhasznált diagnosztikai savó ellenanyag tartalma megfelelő-e a jelenlévő lépfene antigének kimutatására, a negatív csővel pedig a reakció specifikus voltát ellenőrizzük.

A B. anthracis és a B. cereus elkülönítése a 8. táblázat szerint történik:

Kép

m) Yersinia enterocolitica kimutatása

A Nemzetközi Nomenklatúra Bizottság 1974-ben választotta el a Pasteurella nemzetségtől és helyezte az új Yersinia genusba, melybe három faj tartozik: a Yersinia pestis, a Yersinia pseudotuberculosis és a Yersinia enterocolitica. Mindhárom baktériumfaj állatok és emberek megbetegedését okozhatja. Az utóbbi két species emberben sokféle kórforma közül főleg hasi panaszokban megnyilvánuló enyhébb vagy súlyosabb lefolyású enterocolitist, mesenterialis lymphadenitist okozhat, melyekhez septicaemia is társulhat (Lányi és mtsai 1980). A Yersinia enterocolitica az 1960-as években került a korábban bakteriológiailag negatívnak tartott megbetegedések kórokozójaként az érdeklődés középpontjába. Bizonyítottan ételfertőzések előidézője, a kórokozót a klinikailag tünetmentes ember vagy az állat bélsarával ürítheti. A Yersinia enterocolitica Gram-negatív, rövid pálcika alakú baktérium, mely 25 oC hőmérsékleten tenyésztve jobban nő és mozog, 37 oC-on általában mozgásképtelen. Folyékony táptalajban 4 oC hőmérsékleten 2-3 hét alatt szelektíven dúsítható. A Yersinia enterocolitica törzseket O és H antigénjeik alapján szerológiai csoportokba sorolják, gyakorlati jelentősége azonban csak az O-csoportnak van. Emberi megbetegedéseket Európában és Kanadában főleg az O3 és O9-es szerocsoportok, míg az USA-ban inkább az O8-as szerocsoportok idéznek elő. A 9-es O-antigén szoros kapcsolatban van a Brucella fajok antigénjeivel, amely a brucellózissal kapcsolatos szerológiai próbákat zavarhatják. Az embernél végzett szerológiai diagnózis esetén O9-es antigénnel kapott agglutinációnál a savót Brucella antigénnel ki kell meríteni. A Yersinia enterocolitica törzseknek eddig mintegy 11 fágképét határozták meg. Közülük a leggyakoribb humán patogének az O3 szerocsoportba tartozó törzsek általában VIII-as fágtípusúak. Az O3-as szerocsoportba tartozó törzsek biokémiai aktivitására jellemző, hogy indol negatívak, nem bontják a xilózt, laktózt és az adonitot, szobahőn képeznek acetil-metil-karbinolt, míg 37 oC hőmérsékleten nem. A Yersinia entericolitica törzsek öt biotípusba sorolhatók a szalicin, a xilóz, az eszkulin, a szorbit, a szacharóz bontása, az ONPG-próba, valamint a nitrát-redukció alapján.

n) Listeria monocytogenes kimutatása

A Listeria monocytogenes Gram-pozitív pálcika alakú, kataláz pozitív és oxidáz negatív baktérium. Tokja nincs, spórát nem képez. Az eszkulint hidrolizálja, a glukózból, maltózból és a szalicinből savat képez, míg a mannitot és a xilózt nem bontja. Indolt nem termel, az ureumot nem hidrolizálja és nem képez kénhidrogént. A metilvörös és Voges-Proskauer próba pozitív, a nitrátot nem redukálja nitritté. 25 oC-on csillós, jellegzetes mozgást végez. A patogén törzsek juhvéres agaron ß-hemolízist mutatnak és a ß hemotoxinnal rendelkező Staphyylococcus aureus törzsekkel pozitív Camp-próbát adnak (Lányi és mtsai, 1980). 4–42 oC hőmérsékleten szaporodik, 60 oC feletti hőmérsékleten gyorsan elpusztul. Ezenkívül képes szaporodni széles pH-intervallumban és alacsony vízaktivitás mellett is.

A Listeria monocytogenes a természetben széles körben előfordul, így megtalálható a talajban, növényeken, valamint az ember és az állatok bélcsatornájában. Takarmányokban 60–100%-os, szarvasmarhák bélsarából mintegy 50%-os gyakorisággal mutatták ki. Emberből először Nyfeldt tenyésztette ki 1929-ben. USA adatok szerint a burgonya 25%-ban, a retek 30%-ban a gomba és az uborka pedig 10%-ban volt fertőzött. Hazánkban élelmiszerekben nagy gyakorisággal volt található L. monocytogenes. A juh listeriosist hazánkban először Mócsi és Sályi állapította meg, melyet a szilázs nem megfelelő érése során elszaporodott L. monocytogenes okozott. A Listeria nemzetségbe tartozó baktériumok közül csak a L. moncytogenes és a L. ivanovii képes emberi megbetegedést előidézni, míg a nemzetség többi faja az összes emlősre és madárfajra patogén.

Kórtani szerepüket illetően még sok a tisztázatlan kérdés. Embernél szórványosan előforduló abortuszban, illetve agyburok- és agyvelőgyulladásban jelentkező megbetegedések jellemzőek. Az ember fertőződésének forrása még nem kellően tisztázott, azt sem ismerjük pontosan, hogy ebben mennyiben játszik szerepet az állatokkal való érintkezés. A kórokozót egyébként egészséges emberek és állatok is üríthetik. Valószínű, hogy a fertőzési lánc olyan, hogy egyformán szerepel benne az ember, az állat és a környezet.

Az utóbbi időkben a listeriosis központi kérdéssé vált, miután jelentősen emelkedett azoknak az emberi megbetegedéseknek a száma, amelyek bizonyos élelmiszerek (pasztőrözött tej, káposzta saláta, mexikói típusú lágysajt) fogyasztására vezethetők vissza. Az emberi megbetegedéseknél lényeges szerepet játszik az immunrendszer állapota is. A tapasztalatok azt mutatják, hogy a gyenge immunrendszerű magzatok, az idősek és az immunszupresszív kezelést kapott egyének esetében kell számolni a listeriosis kialakulásával.

A L. monocytogenes megbetegedést előidéző adagja állatkísérletek alapján 103–105 nagyságrend volt, de ezt nagy mértékben befolyásolják a hajlamosító tényezők is. Mivel rutin vizsgálatoknál 25 g mennyiségű élelmiszer mintát dúsításos eljárással vizsgálnak, megnézték azt is, hogy a pozitívnak talált esetekben milyen a L. monocytogenes szám. MPN-módszer alkalmazásával általában ezt 0,3/g alattinak találták, tehát a szám igen alacsony volt. Ez lehet az egyik magyarázata annak, hogy bár az élelmiszerek széles körben tartalmaznak L. monocytogenes-t, mégis ritka a megbetegedés.

A L. monocytogenes kimutatásra 1988 óta alkalmazzák az ELISA-módszert, melyhez előzetesen 40 órás, folyékony táptalajban történő dúsítást írtak elő. Legjobb hatékonyságúnak találták a kettős dúsítást. Az ELISA-módszer csak genus specifikus eredményt ad, ezért szűrővizsgálat számára megfelelő, a pozitívnak talált mintákból el kell végezni a tenyésztést is. A negatív eredményű ELISA vizsgálat esetében a vizsgált élelmiszer viszont forgalomba hozható.

Alkalmas még genus szintű gyors vizsgálatra a DNS hibridizációs módszer is, amelynek legújabban már létezik L. monocytogenes specifikus változata is, ezenkívül igen jónak találták a fluoreszcens eljárást.

o) Campylobacter jejuni kimutatása

A Campylobacter jejunit l957-ben izolálták először, majd l972-ben hozták összefüggésbe enteritises megbetegedéssel. Régebben a baktériumot a Vibrio genusba sorolták, majd ennek pontos definiálása után ma önálló nemzetséget alkot. Közegészségügyi jelentősége is van, mivel embereket gyakran megbetegít (Lányi és mtsai 1980). Egyes szerzők szerint a Campylobacter jejuni világszerte hasonló elterjedtségű mint a szalmonellák, mivel a humán enteritises megbetegedéseknél 3–14%-ban mutatták ki kórokozóként.

C.fetus subsp. fetus emberben sepsist, endocarditist, enteritist okoz, juhokban és szarvasmarhákban pedig vetélést idéz elő.

C.fetus subsp. jejuni a háziállatokban, madarakban és emberben a béltraktus természetes lakója, de hasmenéssel járó gastroenteritist okozhat emberben, kutyában és macskában. Szarvasmarhában és juhokban vetélést idézhet elő, baromfiban lázas tünetek mellett hepatitis okozója. A vágott baromfi testfelületéről nagyon gyakran izolálható a kórokozó. Terjesztheti még a sertés húsa, a vadon élő állatok, de gyakran előfordul az ivóvízben vagy a tengervízben is.

A Campylobacter jejuni a Spirillaceae-családba tartozó, spórákat nem képező, Gram-negatív 0,2-0,5 µm széles és 1,5–5,0 µm hosszúságú, S- vagy csavar alakú, 42–45 oC hőoptimumon mikroaerofil körülmények között növekedő baktérium. Mozgása dugóhúzószerű, rendkívül élénk. Biokémiailag jellemző rá az oxidáz- és a kataláz-pozitivitás, a nalidixinsav-érzékenység, valamint a hippurát hidrolizáló képesség. Érzékeny mikroorganizmus, amely nehezen tűri a 46 oC-t meghaladó hőmérsékletet. A biokémiai próbákban általánosan használt szénhidrátokat nem bontja, fejlődéséhez nagy vízaktivitású közeget igényel.

Kimutatása során (MSZ–3640/24–89) a vizsgálandó 25 g mintát 225 cm3 mennyiségű Preston-féle levesben homogénezzük, majd 42 oC hőmérsékleten 16–18 órán át mikroaerofil körülmények között inkubáljuk. A Preston-féle leves fagyasztással hemolizált ló- vagy marhavért, vas(II) szulfátot, nátrium-metabiszulfitet, nátrium-piruvátot, polimyxin-B-szulfátot, rifampicint, trimetoprimot, valamint cikloheximidet tartalmaz.

Inkubálás után a dúsítóból szelektív, módosított szelektív campylobacter agarra végzünk kiszélesztést. A szelektív agar az általában használt komponenseken kívül glukózt, L-cisztint, fagyasztással hemolizált ló- vagy marhavért, vas(II) szulfátot, nátrium-metabiszulfitet, nátrium-piruvátot, polimyxin-B-szulfátot, rifampicint, trimetoprimot, valamint cikloheximidet tartalmaz. A szelektív agart leoltás után 42 oC hőmérsékleten 1–2 napon át inkubáljuk, majd a bírálat során kiválasztott n számú jellegzetes telepet azonosító próbáknak vetünk alá. jellegzetes telepnek tekintjük a nagy, lapos, kerek, a szélesztés mentén esetleg összefolyó, szürkés színű, fényes felszínű, irizáló, ép szélű és vajszerűen kenhető konzisztenciájú, vagy a kisebb (0,5–2,0 mm átmérőjű), kerek formájú, domború, épszélű, fényes felszínű, tömött állományú, sárgásszürke kolóniákat.

A Campylobacter jejuni aerob körülmények mellett nem fejlődik, az oxidáz- és a kataláz-próbában pozitív, hidrolizálja a nátrium-hippurátot, fáziskontraszt- vagy sötétlátótér-berendezéssel ellátott mikroszkópba helyezett függőcsepp-készítmény vizsgálatakor a karcsú, dugóhúzó vagy S-alakú mikrobák jellegzetes dugóhúzószerűen előrehaladó csavarmozgása látható. Fejlődését a nalidixsav erőteljesen gátolja.



[1] *A táblázatban *-gal jelölt reakciók elvégzésének szükségességét a vizsgáló esetenként dönti el.