Ugrás a tartalomhoz

Molekuláris biológia I-II.

Bálint Miklós (2010)

Educatio Társadalmi Szolgáltató Nonprofit Kft.

5.22. A DNS homológ rekombinációja

5.22. A DNS homológ rekombinációja

Ennek során két DNS-molekula, a kromoszóma homológ szegmentumai cserélődnek ki egymás között. Magasabb rendű szervezeteknél ez folyamat a meiózis során lép fel. A baktériumok, amelyek normális esetben haploidok, különböző egyéb módszereket fejlesztettek ki a genetikai információ csereberéjére. Ilyenek a konjugáció, a transzdukció és a transzformáció. Ezek során az idegen DNS-a recipiens DNS-be (kromoszómába vagy plazmidba) ez általános rekombinációs mechanizmus szerint épül be. Ennek módját Robin Holliday írta le a gombák meiózisa kapcsán (5.44. ábra).

 

5.44. ábra. Robin Holliday által kidolgozott homológ rekombinációs modell. A rekombinálódó kettős láncok egyike fekete, a másik szürke színnel jelzett. Minden vastag vonallal ábrázolt lánc bázispárosodást alakított ki a (vékonyabb vonallal rajzolt) párjával, ill. fordítva. Az X, Y és Z három gént jelent, amelyek az allélpárjait az x, y és z betűk jelölik.

 

 

a) a megfelelő gének egymáshoz rendeződése; b) mindegyik duplexben elhasad az egyik lánc; c) az elhasadt láncok a szomszéd láncokat támadják, invázió; d) az új láncok összekapcsolódnak; e) az átkereszteződési pont eltolódása (branch migration) jelen esteben jobbra, de történhet balra is; f) az e) formát 180-os elfordulás, izomerizáció után így lehet ábrázolni; g) az f) forma horizontális tengely mentén történő hasítása. Ilyenkor az inváziós láncok hasadnak; h) ekkor az izomerizált f) forma a vertikális tengely mentén, vagyis a nem inváziós láncok mentén hasad; i) a g)-ben elhasadt láncok újból összekapcsolódnak, és az ún. hibrid rekombinációs formákat hozzák létre (patch rekombinációs forma); j) a h)-ban elhasadt láncok újból összekapcsolódnak, és az i)-től eltérő rekombináns formákat hozzák létre, ahol a molekula bal felét az egyik parens lánc, míg a jobb felét a másik parens molekula DNS kettős lánca alkotja teljes egészében (splice rekombináns forma).

 

 

A *-gal jelölt régiók mindegyik parens láncból tartalmaznak egy-egy darabot.

 

   

Ennek során a két homológ kettős lánc egymás mellé rendeződik (a). Azután az egyik, majd a másik duplex DNS-ben a meglévő láncokat egy endonukleáz elhasítja (b) és az elhasadt láncok mindegyike ,,hűtlen” lesz a saját kiegészítő láncához, és a másik duplex láncához csatlakozik (c). A különböző DNS-duplexekből származó láncok összekapcsolódnak egymással (d), (e). A láncok kicserélődése ezután tovább folytatódik, és így az átkereszteződési pontok áthelyeződnek (branch migration) mindkét duplexben. Az (f) ábrázolási forma úgy jön létre, hogy az (e) formát 180 -kal elfordítjuk, izomerizáljuk.

Ha az inváziós láncok mentén (horizontális tengely) történik a hasítás (g), az új összekapcsolódások után az (i) variánst kapjuk. Ha viszont a nem inváziós láncok mentén, a vertikális tengely mentén történik a hasadás (h), majd az újbóli összekapcsolás, akkor egy másik fajta (j) variánst kapunk.

Míg az (i) variáns esetén hibrid kettős láncok keletkeznek, addig a (j) variáns esetén rekombináns kettős láncok jönnek létre, ahol a molekula bal felét az egyik parens lánc, míg a jobb felét a másik parens molekula kettős DNS-lánca alkotja teljes egészében.

A Holliday-modell megvalósulását ellenőrizni is lehetett. E. coli sejteket kerestek olyan antibiotikummal (kloramfenikol), ami a bakteriális plazmidok szaporodását nem gátolja, míg kromoszomális DNS-ét igen. Így baktériumsejtekben nagyon sok plazmid szaporodik fel. Ezek a plazmidok ugyanolyan módon rekombinálódnak, mint a bakteriális DNS. A plazmidok izolátumát elektronmikroszkóppal vizsgálva kiderült, hogy ezek kb. 1/3-a 8-as alakú dimert alkot (5.45. a) ábra). Ezt a formát és az 5.45. b) ábrán látható χ formát is láthatjuk az 5.46. ábra különböző részeiben.

 

5.45. ábra. A rekombinálódó DNS-plazmidok elektronmikroszkópos képei. Az a) ábra a 8-as alakot mutatja, amelyet két plazmid alakít ki. b) Ha ezt a struktúrát adott restrikciós endonukleázzal hasítja, akkor a χ forma jön létre.

 

   

 

5.46. ábra. A cirkuláris DNS-plazmidok rekombinációja. Az itt látható d) jelű forma (8-as) megfelel az 5.45. a) ábrán látható formának. Annak megfelelően, hogy az átkereszteződő láncok vagy nem azok mentén történik a hasadás, kétféle forma, a hibrid és a rekombináns keletkezik: f), g).

 

   

Az 5.47. b) ábrán látható alakzaton feltűnő az, hogy az érintkezési pont mindkét oldalán egy-egy DNS-láncnak megvan az azonos hosszúságú párja a másik oldalon. Ezek a karhosszak természetesen változnak, ha másféle restrikciós endonukleázt használnak, de egyfélét alkalmazva mindig ugyanazt az eredményt kapjuk. Ebből arra lehetett következtetni, hogy a DNS-molekulák (plazmidok, kromoszómák) a homológ régiók mentén kapcsolódnak egymáshoz (5.47., 5.48. ábrák).

 

5.47. ábra. a) Ha a cirkuláris DNS-molekulák nem a homológ régióik mentén kapcsolódnának, akkor egy adott restrikciós endonukleáz utáni hasítás után nem volnának szimmetrikusok a χ szárai. Míg ha a homológ régiók mentén történik a kapcsolódás b), akkor a χ szárai szimmetrikusak kell hogy legyenek.

 

   

 

5.48. ábra. a) A χ forma homológ régióját (középen) az AT bázispárok szelektív denaturálása révén ,,nyitották ki” formamidkezeléssel b) Az a) ábra értelmezett, rajzos változata.

 

   

A homológ (vagy általános) rekombináció a kiinduló (parens) DNS-molekulák bármely homológ szekvenciája között létrejöhet. E. coli esetén ezt a folyamatot a rec gének irányítják. Ebben a RecA fehérje központi szerepet játszik. Erre az első jel az volt, hogy egy egyes láncú DNS nagyon stimulálja a RecA fehérje ATP-áz aktivitását.

Az áttörést az hozta, hogy kimutatták, hogy a RecA fehérje katalizálja az egyláncú komplementer DNS-ek kettős láncúvá való alakítását. Ennek során egy háromláncú intermedier keletkezik (5.49. ábra) in vitro kísérletekben.

 

5.49. ábra. Az egyes láncú DNS bázispárosodása a komplementer DNS-lánchoz. A folyamat során átmenetileg háromláncú DNS keletkezik az ún. ,,D hurokkal”. A folyamatot a RecA fehérje katalizálja ATP hidrolízise során.

 

   

A RecA fehérje először egy filamentumot képez az egyes láncú DNS (single stranded, ssDNS) köré. Ez a helikális filament hat, 38 kDa-os monomert tartalmaz DNS-fordulatonként és mintegy 100  Å átmérőjű (5.50. ábra). A DNS a fehérjemolekulák közepén megnyúlik, és így az egymás utáni bázisok közötti távolság 5  Å-re növekszik (a Watson–Crick egymás utáni bázispárok távolsága a B-DNS-ben 3,4  Å). ATP szükséges ahhoz, hogy ez a folyamat kiterjedtté váljon, és ennek során az ssDNS olyan régiókat találjon a DNS kettős láncban, amelyek vele homológ szekvenciájúak (in vivo ssDNS természetesen csak a DNS-károsodás után található).

 

5.50. ábra. a) A RecA fehérje a hossztengely szerinti, ill. b) keresztmetszeti képe. A hat monomer egy-egy kötött ADP-t tartalmaz. A DNS-lánc a középső lyukon halad keresztül.

 

   

A képződött recA fehérje és ssDNS filamentum ezután kötődik a DNS kettős lánchoz. Ennek során a kettős lánc részlegesen letekeredik azért, hogy lehetővé váljon bázisszekvenciája leolvasása. Egy ilyen hélix egy fordulata 18,6 bpárt tartalmaz (a B DNS-ben 10,4 bpár van). Így az ssDNS és a kettős szálú DNS egymás közelébe kerülnek minden RecA fehérje kötőhelyénél (5.51. a) ábra). Az 5.51. b) ábra azt szemlélteti, ahogy a fentifolyamat két kettős szálú DNS (double stranded, dsDNS) esetén is lejátszódik (in vivo). E mechanizmus szerint akár az egyes, akár a kettős láncú inváziós DNS megkeresi a neki megfelelő komplementer DNS-láncot.

 

5.51. ábra. A RecA fehérje által katalizált bázispárosodás és lánckicserélés mechanizmusa. Az a) ábra esetén a támadó DNS egyláncú, míg a b) ábra esetén kétláncú. A fogadólánc mindkét esetben kétláncú. Először (1) az egyláncú a), vagy kétláncú támadó b) DNS kötődnek a Rec fehérjéhez, és így alakul az iniciációs komplex. Ezután a kétláncú ,,fogadó” DNS kötődik a RecA fehérjéhez a), b), amely által egy háromláncú a) vagy egy négyláncú b) struktúra alakul ki (2). Utoljára (3) a RecA fehérje a homológ DNS-láncok bázisait úgy ,,rotálja” (forgatja), hogy a megfelelő DNS-láncok ki tudják cserélni láncaikat (3, a, b). (Vesd össze az 5.48. ábrával az itteni ábra a) részét.) Az egész folyamat csak egy kismértékű rossz bázispárosodást tolerál és megköveteli azt, hogy az egyik DNS-lánc szabad véggel rendelkezzen. Az egyláncú és kétláncú támadó és fogadó DNS esetének b) jobb megértéséhez lásd az 5.53. hipotetikus ábrát is!

 

   

Amint a komplementer láncok rátalálnak egymásra, a kettős lánc tovább folytatja a letekeredést, és lehetővé válik az egyes (vagy kettős) lánc további mozgása (branch migration) (lásd az 5.44. e) ábra).

A Rec fehérje által katalizált rekombinációs folyamatot az ATP hidrolízisének energiája hajtja. ATP szükséges ahhoz, hogy a DNS kötődjön a RecA fehérjéhez. A lánccsere már ATP hidrolízise nélkül is létrejön, de a RecA fehérje mindaddig nem disszociál a DNS-ről, amíg az ATP hidrolízise meg nem történt. Vagyis az ATP-hidrolízis arra szolgál, hogy a RecA fehérje és a DNS szétváljon. Ez emlékeztet arra a folyamatra, amikor az aktin, a miozin és az ATP lép egymással kölcsönhatásba az izomműködés során.

Az is érdekes, hogy a RecA filamentum az F-aktinhoz hasonlóan poláros. A RecA monomerek is egyirányú polimerizációt mutatnak (mint az F aktin monomerek). Ez az egyláncú DNS-szálon 53 irányt jelent. Ennek révén tudja a RecA fehérje egy irányban katalizálni a lánckicserélődést (5.52. a) ábra), vagyis az asszimilálandó lánc irányultsága 35 kell hogy legyen.

 

5.52. ábra. Hipotézis arról, hogy a RecA fehérje hogyan valósítja meg a) az egyláncú és b) a kétláncú DNS-ek közötti homológ régiók kicserélődését.

 

   

A valóságban két kettős láncú DNS között folyik a homológ DNS-szakaszok lánckicserélődése. Ennek módjáról azonban még csak gyenge hipotézisünk van (5.52. b) ábra).

Meg kell jegyezni, hogy az eukarióták a bakteriális RecA-hoz hasonló fehérjével rendelkeznek. Így pl. az élesztő ún. RAD 51 fehérjéje 30%-os homológiát mutat az E. coli RecA fehérjével, és ugyanolyan ATP függő rekombinációt vezérlő készséggel rendelkezik. Az is ismeretes, hogy csirkében és emberben is vannak RAD 51-gyel homológ fehérjék. Tehát valószínű, hogy a RecA filamentumokhoz hasonló fehérjestruktúrák végzik a DNS-rekombinációt (és ilyenfajta kijavítást) az egész élővilágban.

A rekombináció azt kívánja, hogy a támadó (inváziós lánc) egyláncú legyen. Hogyan képződik ez az egyes lánc? Genetikai vizsgálatok szerint a recB, C és D gének (amik az SOS gének közé tartoznak) fontos szerephez jutnak ebben. Ugyanis ezen gének terméke a RecBCD fehérjekomplex (328 kDa), ami egyaránt rendelkezik helikális és nukleáz aktivitással. A RecB fehérje ATP-hidrolízise során katalizálja a kettős láncú DNS letekeredését, míg a RecD fehérje nukleáz aktivitású. Ugyanakkor a RecBCD komplex egy egyláncú DNS-lánc kétláncúvá alakulását katalizálja (5.53. ábra).

 

5.53. ábra. Az egyláncú DNS kialakulása a RecBCD komplex hatására. A magyarázatot lásd a szövegben.

 

   

A RecBCD komplex ATP-hasítás során halad a DNS kettős láncon. Hatására egyes láncú DNS-hurkok keletkeznek. Az enzim elhasítja az egyik láncot, amint a komplex elérkezik a χ szekvenciához. Így szabad 3 OH és 5 P vég keletkezik. Ezután zajlik le a rekombináció úgy, hogy a 3 végi OH-hoz kapcsolódik RecA, és így ez lesz az inváziós lánc. A RecBCD komplex kb. 300 nukleotid/sec sebességgel halad. A χ szekvencia a következő: 5–GCTGGTGG– 3. Az E. coli kromoszóma ebből kb. ezret tartalmaz, így kb. 4 kbázisonként egyet. A hasítás kb. hat nukleotiddal a χ szekvencia előtt történik. Az enzimkomplex további mozgása során egyláncú DNS-t produkál, ami mint inváziós lánc egy homológ DNS kettős láncot támad (lásd még az 5.44. ábrát).

Más egyéb fehérjék is szükségeltetnek a homológ rekombinációhoz. Így az egy lánchoz kötődő fehérje (SSB = single stranded binding protein) ebben a folyamatban is részt vesz, nem csak a replikációban. Ezen fehérjék kötődése gátolja meg, hogy az egyláncú DNS-szálban hajtű képződjön a megfelelő bázisszekvenciák között, és így elég idő maradna arra, hogy a RecA fehérje filamentumot képezzen körülötte.

A topoizomeráz I is szerepet kap itt is azon feszültségek levezetésében, amelyek az egyik DNS kettős szálnak a másik körüli forgása során alakulnak ki (lásd 5.52. ábra) a ,,branch migration” során. A Holliday átkereszteződési pont mozgását RuvB és A fehérje katalizálja ATP hasítása révén. Magát az átkereszteződési pontot azután a RuvC fehérje hasítja, ami felismeri a kereszt alakú helyet.

Az elhasadt láncokat végül a DNS-ligáz köti össze. A RecABCD fehérjék az ún. SOS válaszban – a DNS egyfajta hibajavításában – is részt vesznek. Ezek részleteiről már korábban szóltunk.