Ugrás a tartalomhoz

Gyermekgyógyászat

László, Maródi (2013)

Medicina Könyvkiadó Zrt.

16. Gyermekgyógyászati laboratóriumi diagnosztika

16. Gyermekgyógyászati laboratóriumi diagnosztika

Kappelmayer János, Szabó Teréz

A laboratóriumi tesztekről általában

A laboratóriumi tesztek alkalmazhatósága

A klinikai laboratóriumi diagnosztikai vizsgálatok alap-vetően lehetnek a betegágy melletti tesztek (point of care testing), illetve valós központi laboratóriumi vizsgálatok. Ez utóbbiak három nagy egységbe csoportosíthatók:

klinikai kémia,

hematológia/immunológia,

mikrobiológia.

Ezen fejezet csak a legfontosabb klinikai kémiai és hematológiai vizsgálatokkal, illetve az azok eredményeit befolyásoló tényezőkkel, valamint azon speciális szempontokkal foglalkozik, amelyek csecsemő- és gyermekkorban fontosak. Továbbá összefoglaljuk azokat az újabb, modern módszereket, melyek ma már részei a klinikai laboratóriumi munkának, és a jövőben még inkább azzá válnak.

A gyermekgyógyászati kórképek jelentős részében a laboratóriumi elváltozások következményei egy alapbetegségnek (veseelégtelenség, malabsorptio), más részüknek viszont valóban metabolikus alapja van (pl. diabetes mellitus, hypothyreosis). A laboratóriumi tesztek mindkét csoportban az alábbi területeken használhatók.

Diagnózis. A diagnózis gyakran felállítható az anamnézis és a fizikális vizsgálat alapján, a pontos diagnózishoz az esetek jelentős részében nélkülözhetetlenek a laboratóriumi vizsgálatok is. A diagnózis felállítása, még ha részdiagnózis is, lehetővé teszi a sürgős – esetleg életmentő – kezelést (pl. hypoglykaemia vagy hyperkalemia esetén).

Prognózis. A laboratóriumi diagnózishoz használt tesztek prognosztikai információt is nyújthatnak (pl. a szérumkreatinin vagy cisztatin C koncentráció mérése progresszív vesebetegségben jelzi, hogy mikor van dialízisre szükség).

Monitorozás. A laboratóriumi tesztek jelentős részét monitorozásra használják. Ez vonatkozhat a kórkép lefolyásának követésére (pl. vércukor-meghatározás diabetes mellitusban) vagy a kezelés monitorozására (diabetesben a glikozilált hemoglobin mérése), de szükség lehet a kezelés szövődményeinek kimutatására is (pl. cefalosporinkezeléskor létrejövő K-vitamin-hiányos állapot).

Szűrés. A laboratóriumi teszteket kiterjedten használjuk a még tüneteket nem mutató betegségek felismerésére is.

Referenciatartományok

A laboratóriumi vizsgálatok eredményeit referenciatartományhoz hasonlítjuk, melyet normál tartománynak is neveznek. Ez az elnevezés azonban félrevezető, mert a referenciatartomány nagyon gyakran nem- és korfüggő, így azon érték, ami az egyik beteg esetében még „normálisnak” mondható, az egy másik esetében már kóros lehet.

A referenciatartomány nem minden esetben követi a gaussi eloszlást. Számos vizsgálat pl. alkalikus foszfatáz, gamma-GT, bilirubin, koleszterin, triglicerid esetén ismert a jobbra ferde (skewed) megoszlás (16.1. ábra). A referenciatartományok bizonyos esetekben igen széles határok között változhatnak (pl. urea, albumin, TSH), ilyen esetekben a referenciatatomány felső határa 2–3-szorosa is lehet az alsó határnak. Máskor ez a tartomány rendkívül szűk (Na, ozmolalitás, pH). Nagyon fontos, hogy az ilyen szűk tartományban regulált anyagok meghatározására olyan analitikai módszereket használjunk, melyek reprodukálhatósága nagyon jó, így az analitikai variabilitás nem haladja meg a szűk biológiai variabilitást.

16.1. ábra. a, b Gauss-eloszlást (a, felső grafikon) és jobbra ferde megoszlást (b, alsó grafikon) mutató laboratóriumi paraméterek eloszlási hisztogramjai (A Gauss-eloszlás ábráján feltüntetett s a standard deviáció)

Egy betegség gyanújakor vagy egyedi teszteket vagy a laboratóriumi tesztek paneljeit szokás kérni (ld. ké-sőbb). A laboratóriumi vizsgálatok értékelésekor az egyik legfőbb kérdés mindig az, hogy összeegyeztethe-tő-e az eredmény a klinikai tünetekkel. Amennyiben igen, úgy további vizsgálatokkal alátámaszthatjuk vagy finomíthatjuk a diagnózisunkat. Amennyiben a klinikai kép és a laboratóriumi eredmények nem egyeztethetők össze, úgy az alábbi egyszerű gondolatmenet javasolható megoldásként.

A gyermeknél kóros laboratóriumi eredményt kaptam, melyet a klinikai kép nem igazol.

Milyen mértékű az eltérés, hány tesztet kértem?

Amennyiben csak néhány tesztben van a referenciatartománytól jelentéktelen eltérés, tudnunk kell, hogy pl. 10 vizsgálat kérése esetén 40% esélyünk van arra, hogy egy kiessen a referenciatartományból, vagyis a mért patológiás érték nem szükségszerűen takar valamilyen kórképet. Amennyiben az eltérés jelentős, és esetleg több paraméterben jelentkezik, úgy új minta vételét kell elrendelni és ismételt vizsgálatot kell végeztetni.

Ritkán az is előfordul, hogy valamely ismert kórképben a korábban kóros eredmények javulnak a romló klinikai állapot ellenére. Pl. diabetes mellitusban eltűnik a glycosuria a GFR jelentős csökkenése miatt, vagy májbetegségek végstádiumában a korábban észlelt magas transzaminázszintek csökkennek a májsejtállomány rohamos mértékű csökkenése miatt.

Szenzitivitás és specificitás

Minden vizsgálat (legyen az laboratóriumi, képalkotó vagy fizikális) eredményének értékelésekor tisztában kell lennünk azzal, hogy milyen a teszt diagnosztikai szenzitivitása és specificitása. A diagnosztikai szenzitivitás a pozitív eredmények százalékos előfordulása bizonyítottan beteg populációban, azaz a valódi pozitív (VP) eredmények gyakorisága, míg a specificitás azt mutatja, hogy az egészséges populációban a valódi negatív (VN) eredmények milyen százalékban fordulnak elő. A 80%-os szenzitivitás azt jelzi, hogy a bizonyítottan beteg embereknek csak 80%-ában kapunk kóros eredményt, míg a 80%-os specificitás azt jelenti, hogy a teszt alapján az egészségesek 20%-át is betegnek találjuk. Az ideális diagnosztikai teszt az lenne, ha mind a szenzitivitás, mind a specificitás 100% lenne. A valóságban egyetlen diagnosztikai teszt sem éri el ezt a szintet, mindegyikkel kaphatunk álpozitív (ÁP) és álnegatív (ÁN) eredményeket. A laboratóriumi tesztekre jellemző, hogy ha a diagnosztikai határt túl magasan szabjuk meg, akkor a teszt rendkívül specifikus, de a szenzitivitás alacsony, míg ha a diagnosztikai határt lejjebb visszük, akkor a teszt szenzitivitását növeljük a specificitás rovására.

A szenzitivitás és specificitás az alábbi egyszerű formulákkal számolható ki.

szenzitivitás = VP VP + ÁN × 100 specificitás = VN VN + ÁP × 100

Az újszülöttkorban végzett szűrőtesztek esetén fontos, hogy a szenzitivitás 100%-os legyen lehetőleg minél magasabb specificitással. Ugyanis csak ebben az esetben biztosítható az, hogy a betegek közül senkit sem fogunk egészségesnek nyilvánítani, az egészségesek pedig csak kis százalékban adnak álpozitív eredményt.

A laboratóriumi tesztek eredményeit befolyásoló tényezők

Mintavétel, minták tárolása, minták típusai

Mintavétel

A laboratóriumi vizsgálatok eredményét befolyásoló, a tulajdonképpeni laboratóriumi analitikai munkát megelőző, ún. preanalitikai tényezők közül a nem megfelelő mintavétel az egyik leggyakoribb hibaforrás. A mintavétel lehetőleg azonosidőpontban, a legtöbb laboratóriumi vizsgálat esetén reggel történik. Különösen fontos az időpont gondos megválasztása a jelentős diurnális változásnak kitett paraméterek (pl. adrenalin, ACTH, kortizol) esetében és terápiás gyógyszerszint-meghatározásnál.

A beteg előkészítése, diéta. A vizsgálatok jelentős részét „éhgyomri” vérmintából végezzük. Ez kisgyermekeknél általában nem tartható, mivel a folyadékháztartásuk labilis, és az éhség és a szorongás rosszullétet is okozhat. Könnyű reggeli és főként igény szerinti folyadékfelvétel ajánlható, hacsak a vizsgálat speciális előírásai nem kontraindikálják azt.

Mintavétel céljára a minta és a tervezett vizsgálat szempontjából legelőnyösebb adalékanyagokat (pl. alvadásgátló, glikolízisgátló, antibiotikumot közömbösítő) is tartalmazó speciálismintavevő eszközök kaphatók, melyek gyakran a minta szakszerű tárolását és szállítását is lehetővé teszik.

A zárt vérvételi rendszer használatával a fertőzésveszély minimális. A vákuumos vérvételi eszközök használata újszülöttekben és fiatal csecsemőkben nehézségekbe ütközhet. Ilyenkor a szárnyas tű és toldalékok alkalmazása, vagy a kombináltan (vákuumos, ill. hagyományos fecskendőként is) használható vérvételi rendszer jelentheti a megoldást.

A minták tárolása és szállítása

A laboratóriumi vizsgálatok túlnyomó többségét a mintavétel napján végezzük. A mintavétel többnyire a vizsgálatot végző laboratóriumban vagy az intézmény osztályain, ambulanciáin történik. A minták szakszerű szállítása, tárolása a laboratóriumi vizsgálatok eredményét befolyásoló jelentős preanalitikai tényező, ezért speciális vizsgálatoknál tájékozódjunk a mintaszállítás körülményeiről. Ilyen információkat célszerű a laboratóriumok honlapjain közzétenni (pl. www.kbmpi.hu honlapon a Diagnosztika/Vizsgálatok/Speciális mintavétel fejezetben).

Általános szabályként elmondható, hogy laboratóriumi vizsgálat céljára vett mintát a mintavételt követő egy–két órán belül el kell juttatni a feldolgozás helyére. Amennyiben ez nem lehetséges, vérminta esetében gondoskodni kell a szérum/plazma és az alakos elemek szétválasztásáról (centrifugálás, leszívás) és a tiszta felülúszó lezárt csőben megfelelő hőmérsékleten történő szállításáról. A ma általánosan használt vacutainer csövek nagy része egy szeparátor gélt tartalmaz, mely centrifugálás után elválasztja a szérumot a lecentrifugált sejtektől. A minta néhány napig 4 °C-on így is eltárolható. Ha előreláthatóan hosszabb tárolásra lesz szükség, ami egyes speciális, főként immunkémiai vizsgálatok esetén gyakori, célszerű a tiszta, hemolízismentes szérumot vagy plazmamintát lefagyasztani. Általában elegendő a háztartási mélyhűtő használata (–20 °C).

A teljes vér tárolása, szállítása haematológiai vizsgálatok céljára szobahőn vagy hűtve lehetséges. Bizonyos vizsgálatokhoz (pl. leukémiatipizálás) történő mintatovábbításkor a hűtés szükségtelen, sőt káros. Mikroszkópos kenetértékelés frissen kikent natív vércseppből, esetleg 4 óránál nem régebbi, szobahőmérsékleten tartott EDTA-s vérből lehetséges. Az automata fehérvérsejt-differenciálás a vérvételtől számított 4 órán belül elvégzendő.

A vérgázanalízis tipikus ágy melletti (POCT) vizsgálat, de szállítása csak anaerob módon kezelt (lezárt végű kapillárisban) történhet, és így sem tárolható hosz-szan. Ilyen esetben azonban a kombinált vérgáz+ion analizátorok által mért káliumkoncentráció az esetleg bekövetkező és rejtve maradt hemolízis miatt hamisan emelkedett lehet, ezért nem értékelhető.

Beszárított vércseppből végezhető örökletes anyagcserezavarok szűrése és a molekuláris genetikai vizsgálatok egyre szélesebb köre. Ezekhez a vizsgálatokhoz a szűrőpapírra beszárított vércsepp nejlontasakba helyezve, egyszerű postai borítékban továbbítható a vizsgálatot végző laboratóriumnak.

Mikrobiológiai vizsgálatok céljára a steril mintavevő edényben vagy transzport-táptalajon tartjuk és szállítjuk az anyagot. Vizelet kivételével a hűtés szükségtelen, sőt hátrányos.

A minták típusai

Kapilláris vér. Újszülöttek, fiatal csecsemők vizsgálatakor néhány csekély vérigényű paraméter meghatározására a sarokból vagy ujjbegyből nyerhető kapilláris vér. A vérvételi terület melegítése a vérátáramlást fokozza, így akár fél–egy milliliter vért is levehetünk. Préselni, nyomkodni nem szabad, mert a vér alakos elemei sérülnek (hemolízis), és a vérhez nagyobb meny-nyiségű szövetnedv keveredhet. Ez a vérmintát laboratóriumi feldolgozásra alakalmatlanná teszi, vagy a kapott eredményt lényegesen torzítja. A kapilláris vérminta vétele általános gyakorlat a hematológiai kórképek monitorizálásánál nagyobb gyermekek esetén is, hiszen a gyakori mintavétel így kisebb trauma, mint a vénapunkció, és jóval kevesebb a levett vérmennyiség (16.2A, B, C ábra).

16.2. ábra. Kapilláris minta vételének technikája (A), a levett vérminta (B), valamint az előhígított „poharas vérkép”-hez való minta (C)

Vénás vér. Megfelelő perifériás véna punkciójával vagy igen gondosan vénás kanülből, katéterből nyerhető. Utóbbi esetben nagyon fontos a mintavételt meg-előzően az infúziós folyadékkal kevert vérminta eltávolítása, hogy az eredmény valóban az in vivo értékeket tükrözze. Tekintettel a vérvételi hibák nagy kockázatára ennél a módszernél, csak akkor folyamodjunk a kanülből történő vérvételhez, ha a beteg állapota ezt feltétlenül indokolja.

Artériás vér. Műtőben, intenzív osztályon, elsősorban vérgázanalízis céljára veszünk mintát az artériákból. A mintavétel megfelelő technikai feltételeket és felkészültséget igényel.

Liquor cerebrospinalis. Csecsemő- és kisgyermekkorban gyakran szükséges a liquor laboratóriumi vizsgálata görcsök okának kiderítésére vagy meningitis gyanúja esetén. Mikrobiológiai vizsgálatok céljára steril, lezárt kémcsőben, kémiai vizsgálatok céljára nem steril, tiszta csőben érkezhet a minta.

Vizelet. Általános kvalitatív vizsgálathoz – az üledék mikroszkópos megtekintését is beleértve – frissen ürített vizelet szükséges. Ez lehet tiszta edényben vagy csecsemők vizeletgyűjtő tasakjában felfogott otthoni minta is, de ilyen esetben gondoskodni kell arról, hogy a minta 2 órán belül a laboratóriumba kerüljön.

Mikrobiológiai vizsgálat céljára steril (műanyag) tárolóedénybe levett, szigorúan középsugár-vizelet alkalmas. Csecsemők és inkontinens betegek esetében steril vizeletgyűjtő tasak alkalmazható. Szükség esetén katéterrel vagy suprapubicus punctio segítségével nyerhetünk vizeletet.

Kvantitatív vizeletvizsgálathoz, clearanceszámításhoz a vizelet gyűjtése szükséges. A gyűjtés a vizsgálat céljától függően különböző időtartamú (6, 12, 24 óra) lehet, és történhet egy vagy két (pl. nappali és éjszakai) frakcióban. Fontos a gyűjtés időtartamának pontos betartása (pl. reggel 7 órától másnap reggel 6 óráig, hogy csak 1 reggeli vizeletminta legyen benne) és az adott időszakban ürített vizelet maradéktalan összegyűjtése. A gyűjtés befejeztével a vizeletet nagyon alaposan össze kell keverni, és a homogén vizeletből a laboratórium által megjelölt mintamennyiséget a transzportedénybe tölteni. Ezen egyszerűnek tűnő előírások be nem tartása vagy a beteg túlzott folyadékfogyasztása a laboratóriumi vizsgálatok sikertelenségének leggyakoribb oka!

A vizelet gyűjtése alatt szükség lehet a mérendő paraméter (pl. Ca, katekolaminok, fehérjék) stabilizálására, a mikroorganizmusok növekedésének megakadályozására. A laboratórium mind a gyűjtés körülményeire vonatkozó információkat, mind pedig a konzerválószert biztosítja, ezért a gyűjtés megkezdése előtt célszerű konzultálni a feldolgozást végző laboratóriummal.

Széklet. A laboratóriumban igényelhető speciális tartályban egy mogyorónyi friss székletminta a legtöbb vizsgálat céljára elegendő.

A vizsgálat iránya lehet:

Mikrobiológiai vizsgálat – pl. a kórokozó direkt kimutatása mikroszkópos (féregpete, protozoon), immunológiai (Rotavírus) vagy tenyésztéses (Salmonella) módszerrel.

Okkult vérzés kimutatása – külön e célra készült, postai szállításra is alkalmas higiénikus mintavevő tartályban elhelyezett borsónyi székletmintából elvégezhető a vizsgálat. A korszerű immunológiai módszerekkel a human haemoglobin specifikus kimutatása lehetséges, így szigorú diéta nélkül is értékelhető a vizsgálat.

Egyéb vizsgálati anyagok. Punctatumok, sebváladék, biopsziás anyag amelyekből mikrobiológiai vagy biokémiai feldolgozást végzünk.

Alvadásgátlók

Ha a vizsgálathoz teljes vér vagy plazma szükséges, a vérmintát antikoagulánst tartalmazó csőbe kell venni. Ilyen mintát használunk a haematológiai és haemostasisvizsgálatokhoz és néhány klinikai kémiai teszthez (vérgázok, ammónia, cyclosporinszint meghatározása). Az újszülöttgyógyászatban a rendelkezésre álló vérminta korlátozott mennyisége miatt gyakran számos tesztet kapilláris teljes vérből végeznek. Az alvadásgátlók közül a következők terjedtek el a klinikai gyakorlatban.

Heparin. Relatíve fiziológiás alvadásgátló, mely az antithrombin III hatásának fokozásán keresztül hat, kis mennyiségben a vérben is megtalálható. A laboratóriumi tesztekkel általában nem interferál. Nátrium-, kálium-, lítium- vagy ammóniumsó formájában kerül forgalomba. Természetesen a nátrium- és kálium-heparinát ezen ionok koncentrációjának meghatározásával interferál, így ebből a mintából végzett nátrium- vagy káliummeghatározás nem értékelhető. A heparin a Giemsa-festésnél kékes színű hátteret eredményez. A heparin gátolja az LDH-t, a savi foszfatázt és a T4, illetve T3 transzportfehérjékhez való kötődést, így a szabadhormonszintek emelkedését észleljük, mely heparinnal kezelt betegeknél is előfordulhat, és így ezen betegeknél az fT3 és fT4 szintek óvatosan értékelendőek.

EDTA. Az EDTA kiváló antikoaguláns haematológiai vizsgálatokhoz, mivel a celluláris komponensek integritását megőrzi. Azáltal hat, hogy az alvadási folyamatokhoz nélkülözhetetlen kálciumot megköti. Az EDTA – feltehetően a kofaktor fémion megkötése révén – gátolja az alkalikus foszfatáz, kreatinkináz és leucin aminopeptidáz aktivitást. EDTA-t tartalmazó minta természetesen alkalmatlan kalcium- és vasmeghatározásra is.

Citrát. Kalciummegkötés révén ható antikoaguláns, amelyet a haemostasisvizsgálatra történő mintavételnél használunk, mivel hatását kalciummal könnyen semlegesíthetjük. Természetesen nem végezhető citrátos mintából kalciummeghatározás, illetve bizonyos enzimmeghatározások sem. A haemostasisvizsgálatoknál különösen csecsemő- és újszülöttkorban jelenthet problémát a citráttúlsúly. A normális vér:citrát arány 9:1, mely azonban a plazmavolumen – illetve hematokrit – függvényében kissé változhat. Amennyiben a hematokritérték erősen emelkedett (0,6–0,7), a fenti mennyiségű citrát túlságosan sok, hiszen a plazmavolumen lecsökkent, és csak a plazma alvadását kell meggátolni. Ilyen magas hematokritnál a haemostasistesztekben a citráttúlsúly miatt hosszú APTI-t, esetleg hosszú PI-t mérhetünk. Ezekben az esetekben a vérmintát általában fele mennyiségű citráttal elegendő levenni. A százalékos hematokritérték ismeretében a szükséges citrát pontos mennyisége az alábbi képlettel adható meg.

Citrát (ml) = 1,85 × 10–3 (100 – hematokrit) × plazma (ml)

Egyéb antikoagulánsok. Az oxalátot ma alig használják a klinikai gyakorlatban, a nátrium-fluorid viszont, miután gátolja a glikolízisben résztvevő enzimeket, jól használható glükóz tartósítására, de a fluorid a sejtanyagcserét és a sejtmembránt is károsítja, ezért fluoridos plazma nem használható más kémiai összetevők mennyiségi meghatározására.

Egyéb interferáló tényezők

Hemolízis

A hemolízis két módon is befolyásolhatja a laboratóriumi tesztek eredményét. Egyrészt a vvt-kben jelentős mennyiségben kimutatható anyagok (kálium, magnézium, foszfát, LDH, savi-foszfatáz) onnan felszabadulva jelentősen megemelik a szérumban mért szinteket. Azon szérumkomponensek, melyek szintje a vörösvértestben alacsony, a hígulás miatt alacsony értéket mutatnak (nátrium, klorid). A másik mechanizmus, hogy a szérumban lévő magas hemoglobintartalom – mely 200 mg/l felett szemmel is jól észlelhető – a különböző laboratóriumi tesztekkel interferál. Ezért például az újszülöttek bilirubinszintjének méréséhez differenciál-spektrofotometriás eljárást kell alkalmazni, mivel a minta gyakran hemolizált. Fontos tudni, hogy a vvt-kben és thrombocytákban lévő komponensek (pl. kálium) látható hemolízis nélkül is kikerülhetnek a sejtekből. Ilyen pseudohyperkalemia jöhet létre ha pl. túl sok idő telt el a vérvétel és a szérum elkülönítése közt, vagy traumás vérvétel után, esetleg extrémen emelkedett fehérvérsejt- vagy thrombocytaszám esetén. Míg az előbbi két esetben ismételt vérvétellel a valós káliumérték tisztázható, emelkedett fvs- vagy thrombocytaszám esetén csak a plazmából végzett vizsgálat ad valós eredményt.

Icterus

A szérum általában akkor szembetűnően sárga, ha bilirubin szintje meghaladja a 40–50 μmol/l-es értéket. Az emelkedett bilirubin többféle laboratóriumi teszt értékelését zavarhatja. A bilirubin fényérzékeny, szobahőmérsékleten direkt napfényre kitett minta bilirubinkoncentrációja rohamosan csökken. Ezt a bilirubinmérésnél figyelembe kell venni, és mivel a bilirubin a gyakran kért vizsgálatok közé tartozik, a szérumot nem szabad fénynek kitett helyen tárolni.

Lipaemia

Általában 4 mmol/l körüli trigliceridértéknél a szérum zavarossá válik. Mintavételi problémaként akkor jelentkezhet a turbiditás, ha zsíros étel fogyasztása után rövid időn belül (2–7 óra) történt a vérvétel. Ilyenkor a felszaporodó VLDL okozza a szérum egyenletes zavarosságát. Amennyiben az étkezést követően még rövidebb idő telik el, akkor elképzelhető, hogy a minta állás után feltisztul, és csak a szérum tetején fogjuk a chylomicronok jelenlétét észlelni. A lipaemiás szérum zavarhatja mind a szubsztrát-, mind az enzimmeghatározásokat. Különösen gyakran tapasztalunk lipaemiát újszülöttek és csecsemők mintáinak vizsgálatakor, hiszen a vérvétel a gyakori szoptatások közben történik. Valós lipid-értékeket ilyenkor is csak akkor kaphatunk, ha hosz-szabb perióduson át (10–12 óra) szüneteltetjük a szoptatást. Az étkezés után történt mintavétel a triglicerid-értékekben jelentős eltérést eredményez, míg a koleszterinszintet alig emeli, melynek az az oka, hogy a képződött chylomicronok és a VLDL csak elenyésző mértékben tartalmaz koleszterint.

A szervezetet érő hatások

A láz

A láz nagyon sok élettani változást eredményez. Kezdetben hyperglykaemia jelentkezik, melynek következtében az inzulinszekréció fokozódik és javul a glükóztolerancia, de az inzulinszekréció nem szükségszerűen csökkenti a vércukorszintet, mivel ilyenkor a növekedési hormon- és a glukagonszint is gyakran emelkedik. A láz idején csökken a tiroxinszint, mely egyébként akut megbetegdésekben láztól függetlenül is létrejöhet. Fertőzést kísérő lázas állapotban a plazma-kortizolszint magas, meghaladja a normális maximális reggeli értéket. A normális cirkadián ritmus felborul, és a plazma-kortizolszint délután és este a legmagasabb. A májban fokozódik a proteinszintézis, melynek következtében az akut-fázis fehérjék (C-reaktív protein, haptoglobin, orozomukoid, fibrinogén) szintje megemelkedik. A láz gyakran társul hyperventillációval, aminek respirációs alkalózis a következménye. Az emelkedett pH miatt növekszik a foszfor és egyéb elektrolitok kiválasztása.

A trauma és a shock

A biokémiai válasz a kiváltó ok és a stresszt általában kísérő változások együttes eredője. A kortizolszintben 3–5-szörös növekedés következik be, és jelentősen megemelkedhet a katekolaminok szintje is. A sérülést követően az extravascularis térbe azonnal folyadék kerül, és a plazmavolumen csökken. Ha ez olyan mértékű, hogy a keringést is befolyásolja, a glomerularis filtráció is csökken, melynek következtében az urea- és kreatininszint emelkedik. Amennyiben szöveti destrukció is van, a keringésben megemelkedik az izomban található enzimek (CK, GOT, LDH) aktivitása. A fokozódó szöveti katabolizmus fokozott oxigénfogyasztással jár és savas metabolitok kialakulását eredményezi, pl. a laktátszint akár 2–3-szorosára is emelkedhet.

Cirkadián változások

A napszakos ingadozások születéskor még nem mutatkoznak, de 3 éves kortól fokozatosan kialakul a fel-nőttekre jellemző fluktuáció. Ismert a szérum vastartalmának ciklikus változása, a reggeli éhgyomri (8 órás) értéknél a 14 órakor mért érték akár 50%-kal is kevesebb lehet. Hasonló tendenciájú, de jóval kisebb mértékű változás figyelhető meg a káliumszintben. A réz szintje és a vaskötő kapacitás ilyen változást nem mutat. A hormonok napszaki ingadozása közül elsősorban a kortizol és az ACTH emelendő ki, de ismert az aldoszteron, renin, TBG, növekedési hormon, adrenalin és noradrenalin napszakos ingadozása is.

Testhelyzet

A testhelyzet számos laboratóriumi paraméter koncentrációját befolyásolja. A járó- és fekvőbetegtől vett mintában mért erdmények jelentős eltérést mutathatnak. Álló helyzetben az intravazális folyadék az intersticiumba lép át, ezért a nem filtrálható nagy molekulatömegű anyagok koncentrációja (pl.albumin) álló helyzetben emelkedik, míg a 6000-nél kisebb molekulatömegű, szabadon diffundáló molekulák koncentrációja nem változik.

Gyógyszerhatás

A gyógyszerhatások laboratóriumi vizsgálatának alapvetően két területét kell megkülönböztetni.

A gyógyszernek terápiás hatékonyságát kívánjuk lemérni laboratóriumi módszerekkel.

A gyógyszerek milyen – terápiás hatásuktól független – laboratóriumi változásokat hoznak létre.

Míg az előbbi a gyógyszer hatását vagy a kezelés effektivitását teszteli, utóbbi általában a gyógyszer mellékhatásának következménye.

Terápiás gyógyszerszint-monitorozás (TDM)

Egy gyógyszer terápiás hatékonyságának lemérésére több lehetőség kínálkozik, és ezeknek csak egy része a laboratóriumi megközelítés. A legegyszerűbb lehetőség az, ha a biológiai hatékonyságot tudjuk monitorozni, mint pl. antihypertensivumkezelésnél a vérnyomásmérés, vagy inzulinkezelés esetén a vércukorszint-meghatározás. A gyógyszer hatásosságát monitorozzuk akkor is, amikor a haemostasisdiagnosztikában orális antikoagulánst szedő betegnél prothrombinidő- (PI) meghatározást vagy konvencionális heparinkezelésben részesülő betegnél aktivált parciális thromboplasztinidő (APTI) meghatározását végezzük. Más esetben viszont ilyen egyszerű megközelítés nem alkalmazható. Kihasználva azt, hogy a biológiai hatékonysággal sokkal jobban korrelál a vérben mért gyógyszer-koncentráció, mint a bevett dózis, bizonyos esetekben a vérben, illetve a szérumban mért gyógyszer-koncentráció, szolgálhat támpontul a terápia ellenőrzéséhez. Ehhez természetesen néhány dologgal tisztában kell lennünk. Csak olyan gyógyszer szintjét érdemes monitorozni, ahol a terápiás tartomány relatíve szűk, vagyis ahol kicsi a különbség a minimálisan effektív koncentráció és a már toxikus szint között, így a toxicitás könnyen kialakulhat. Nagyon fontos ez olyan szerek esetén, mint pl. az antiepileptikumok közül a phenytoin, mely egy bizonyos dózisszint után, annak kismértékű emelése ellenére, a plazmakoncentráció extrém kiugrását és toxikus tüneteket eredményezhet. Felesleges olyan gyógyszer koncentrációját mérni, ahol a hatás a szer metabolitjának következménye. A gyógyszerszint-monitorozás világszerte bevált technika pl. digoxin-, phenytoin-, aminoglikozid antibiotikumok, cyclosporin-, theophyllin- vagy metothrexatkezelés esetén. A gyógyszerszint-monitorozás különösen fontos lehet több gyógyszer együttes adásakor, hiszen az egyidejűleg adott gyógyszerek jelentősen befolyásolhatják egymás felszívódását, megoszlását, metabolizmusát vagy kiürülését. A keringésben lévő gyógyszerek egy része, általában a nagyobb hányada, fehérjéhez kötött, míg más részük szabad formában van jelen. Biológiai hatékonysága csak az utóbbinak van. A laboratóriumi vizsgálatokban alkalmazott módszerek általában az összgyógyszerszintet mérik. A gyógyszerszint meghatározásához meghatározott időben kell levenni a mintát. Egyrészt a gyógyszerszedés megkezdése óta elegendő időnek kell eltelni ahhoz, hogy “steady state“ állapot jöjjön létre. Ez a gyógyszer féléletidejének 5-szöröse, mely például a digoxin esetében 5 × 1,6 = 8 nap. Másrészt a gyógyszerek legtöbbjénél a völgykoncentrációt kell mérni, vagyis a vérmintát laboratóriumi vizsgálatra közvetlenül a gyógyszerbevétel vagy parenterális beadás előtt kell venni (16.3. ábra).

16.3. ábra. A gyógyszerek plasmakoncentrációjának alakulása a gyógyszeradagolás megkezdése után. A csúcskoncentrációhoz való mintavétel időpontja nem minden gyógyszer esetén definiálható, ilyen esetekben csak a völgykoncentráció informatív (Rövidítések – MTC: minimálisan toxikus koncentráció; MEC: minimálisan effektív koncentráció)

Kivételt jelenthet ezen szabály alól az immunszupresszív szerek, pl. cyclosporine, szintjének mérése, mivel ott gyakran a csúcskoncentráció, pl. 2 órás érték informatívabb. A metotrexátkezelés esetén valamennyi minta vétele a gyógyszerbeadás után történik, és itt a TDM-mérés eredménye a normál sejtek védelmére szolgáló folsavkészítmény (Leucovorin) dózisának megállapításához szükséges.

A gyógyszerek által kiváltott hatások laboratóriumi jelei

A gyógyszerek a laboratóriumi tesztekkel két módon interferálhatnak:

A szer vagy metabolitjai in vivo hatnak a vizsgált kémiai, laboratóriumi paraméterre.

A szer hatása in vitro érvényesül, vagyis a gyógyszer fizikai vagy kémiai sajátossága váltja ki az interferenciát.

Igen ritkán fordul elő, hogy a hospitalizált beteg ne kapjon gyógyszert. Ettől jóval gyakoribb, hogy akár 8–10-féle gyógyszert is kap a beteg egyszerre. A gyógyszerek hatásai a laboratóriumi tesztekre rendkívül szerteágazóak. Ennek részletes tárgyalása messze meghaladná e könyv kereteit, ezért itt most csak néhány, a gyermekgyógyászat szempontjából jelentős hatásra hívjuk fel a figyelmet. Az intramuscularisan adott gyógyszerek megemelhetik a szérumban a kreatinkináz (CK), laktát-dehidrogenáz (LDH) és aldoláz aktivitását. A penicillinszármazékok im. adása általában jelentősebb CK-emelkedést okoz. Nagy dózisú penicillin infúzióban adva hyperkalemiát eredményezhet (1 millió egység penicillin G, 1,7 mmol K-ot tartalmaz).

A penicillin helyett ma gyakrabban adott cefalosporinok viszont nem ritkán K-vitamin-hiányos állapotot hoznak létre, és jelentős PI- és APTI-megnyúlást okoznak. Számos gyógyszer serkenti a máj mikroszomális enzimjeinek aktivitását és szintézisét. Minthogy ezek az enzimek nem gyógyszerspecifikusak, a fokozott bio-transzformáció, illetve a lebontás egyéb molekulákra is kiterjed. Előnyös hatás remélhető az enzimindukciótól az újszülöttek hyperbilirubinemiájának csökkentésében azáltal, hogy pl. a phenobarbital meggyorsítja a bilirubin konjugációját.

A gyógyszerek laboratóriumi teszteket befolyásoló sokféle hatását jól szemlélteti a phenytoin. Hosszantartó kezelés során sok esetben csökken a szérum-kalcium- és -foszfát-szint, míg az alkalikus foszfatáz aktivitást és a gamma-GT-szintet a már említett enzimindukáló hatás növeli, viszont ugyanez a hatás egyidejűleg csökkenti a bilirubinkoncentrációt.

Korfüggő változások

A laboratóriumi vizsgálatok eredményének értékeléséhez gyermekkorban nélkülözhetetlen a beteg életkorának ismerete. Különösen fontos ez újszülött- és csecsemőkorban, hiszen az intrauterin érési folyamatok jelentős része a születéskor nem zárul le. Koraszülöttek esetében a helyzet tovább komplikálódik a gestatiós korral. Egyes paraméterek (pl. véralvadási faktorok) plazmakoncentrációja koraszülöttekben az érett újszülöttekhez képest „kórosan” csökkent, ez a különbség csak 2–3 hónap alatt tűnik el. A továbbiakban a koncentráció a postnatalis életkornak megfelelően növekszik. Más tényezők esetében kifejezett életkorfüggő eltérést láthatunk a felnőttkori normálértékekhez viszonyítva, ez azonban a gestatiós kortól független. A szérumenzimek közül a transzaminázok aktivitása születéskor enyhén meghaladhatja a felnőttkori értéket, de néhány napon belül normalizálódik. Így ezen enzimek vizsgálata diagnosztikai szempontból jól hasznosítható. A foszfatázok ezzel szemben az egész növekedési periódus alatt a felnőttkori aktivitás 3–5-szörösét is elérhetik, igen nagy egyéni különbséget mutatva. Az alkalikus foszfatáz enzim aktivitásának meghatározására a máj és epeutak betegségeinek differenciáldiagnosztikája, valamint a csontanyagcsere folyamatának vizsgálata céljából gyakran kerül sor. Az eredmények értékelésékor mindig nagyon gondosan kell mérlegelni a beteg korát, nemét és a növekedés ütemét. Csak ismételt vizsgálatokkal, az enzimaktivitásnak a kórlefolyás során észlelt változásait és egyéb kiegészítő vizsgálati eredményeket is figyelembe véve és a klinikai képpel összevetve vonhatók le megfelelő következtetések a laboratóriumi eredményekből.

A szérumfehérjék közül az immunglobulinok koncentrációja születéskor alacsony. Csak az anyai eredetű IgG található számottevő mennyiségben az újszülött vérében, az IgM mérhető mennyisége intrauterin infekció jeleként értékelhető. Az immunglobulinok szintézise a postnatalis élet során indul meg, az anyai immunglobulinok fokozatos eltűnése mellett.

Egyes metabolitok koncentrációja is eltér a fel-nőttkoritól. A glükóz születéskor a felnőttkori érték fele, kétharmada körül mérhető. Fontos szem előtt tartani, hogy a neonatalis vörösvérsejtek fokozott anyagcseréje és az igen gyakori polyglobulia a glükóz in vitro felhasználódásához vezethetnek, amennyiben a vérvétel és a feldolgozás között hosszú idő telik el. Ennek meg-előzésére a vérvételhez glikolízisgátló vegyület (fluorid) használata ajánlatos.

Az urea koncentrációja a pozitív nitrogénegyensúlynak megfelelően inkább csökkent. Ugyancsak kisebb a vér kreatinintartalma, ebben azonban az izomtömeg függvényében jelentős egyéni eltérések mutatkozhatnak.

A referenciatartományok meghatározása a korábban részletezett elvek alapján történik. Meghatározása gyermekkorban különösen nehéz. Az enzimaktivitást nemzetközi egységben (U/L) határozzuk meg. Egységnyi aktivitásnak felel meg a definíció szerint az enzim által egy perc alatt átalakított anyag mennyisége, mikromolban kifejezve. Egyes enzimek esetében még azonos hőmérsékleten is a szubsztrát (pl. amiláz) vagy a reakcióelegyben használt puffer eltérő kémiai tulajdonságai (pl. alkalikus foszfatáz) miatt a különböző gyártmányú reagensekkel ugyanazon minta mérésekor extrém mértékben eltérő eredményt kaphatunk.

A véralvadási vizsgálatok közül az orális antikoagulánskezelés monitorozása már nemzetközi szabvány szerint történik, a többi vizsgálatnál a laboratóriumi napi kontroll és „normál” érték használata kikerülhetetlen.

Mindezek alapján indokolt, hogy minden egyes laboratórium határozza meg a saját referenciaértékeit, és azt bocsássa a lelettel együtt a klinikus rendelkezésére.

A következőkben tájékoztató jelleggel közöljük néhány fontosabb paraméter korspecifikus referenciatartományát, nemzetközi irodalmi adatok alapján (16.1. táblázat).

Betegágy mellett végzett vizsgálatok

Előnyük a gyors hozzáférhetőség. Sokszor a kezelő-orvos számára egy gyors tájékoztató jellegű vizsgálat felbecsülhetetlen értékű információt jelent, és meghatározza a beteggel kapcsolatos további intézkedéseket. Hátrányuk a standardizáció hiánya. Még jól felszerelt és egyébként ellenőrzött központi laboratóriumokban is a legkevésbé megbízható, sok szubjektív elemet tartalmazó vizsgálatok tartoznak ebbe a körbe.

A vörösvérsejt-süllyedés sebességének meghatározása. A plazma fehérjeösszetételének különböző okokból bekövetkezett megváltozását tükröző vizsgálat. Infectio, autoimmun és egyéb gyulladásos megbetegedések, daganat, trauma, műtét utáni állapot magyarázhatja a nem specifikus, de igen érzékeny eljárás pozitivitását. A különböző gyulladásos markerek diagnosztikai értékelhetőségét is ehhez viszonyítjuk. Hibaforrás lehet a nem megfelelő vér/citrát arány.

Vizeletvizsgálat. A vizelet vizsgálata általános kvalitatív próbákból és az üledék mikroszkópos vizsgálatából áll. A klasszikus kémiai „kémcsőpróbákat” teljes egészében kiszorították a gyorstesztek. A különböző gyártók által forgalmazott tesztcsíkok 6–10 paraméter kvalitatív vagy szemikvantitatív vizsgálatát teszik lehe-tővé. A csomagoláson színes ábrák segítik az értékelést. Használatuk kényelmes, higiénikus, megbízhatóságuk messze felülmúlja a hagyományos módszerekét. További előnyök: a glükóz kimutatása a sok álpozitív reakciót adó redukciós próbák helyett specifikus glükóz-oxidáz reakcióval történik. A fehérje, ketontestek, bilirubin és urobilinogén kimutatása mellett lehetséges a pH, fajsúly meghatározása, fehér- és vörösvérsejtek, baktériumok jelenlétének kémiai jelzése. A tesztcsíkok (szemi)kvantitatív kiértékelésére leolvasó műszerek is kaphatók (16.4. ábra).

16.4. ábra. Általános vizeletvizsgálat szárazreagens csík műszeres kiértékelésével. A meghatározás pontossága és objektivitása jobb, mint vizuális kiértékelés esetén

Kenetfestés. Osztályos körülmények között végezhető a kenetfestés és értékelés. Tulajdonképpen az eddigiektől eltérően már eszközigényes eljárásokról van szó, hiszen szükség van egy mikroszkópra. A haematológiai vizsgálatok automatizációja az utóbbi években hatalmas fejlődésen ment keresztül. Ma már manuálisan csak akkor javasolt a sejtszámlálás, ha az valamely technikai probléma miatt az automatával nem kivitelezhető.

2.127. táblázat - 16.1. táblázat. Néhány klinikai laboratóriumi paraméter korspecifikus referenciatartománya

Laboratóriumi teszt

Életkori csoport

Referenciatartomány

Albumin

Újszülött

Felnőtt

23–38 g/l

30–55 g/l

Alkalikus foszfatáz (DGKC-módszer)

Újszülött

1 hét–1 év

2–14 év

Felnőtt

˂ 500 U/l

˂ 1000 U/l

˂ 720 U/l

˂ 100–280 U/l

Ammónia

Újszülött

Gyermek

Felnőtt

˂ 110 µmol/l

˂ 48 µmol/l

11–55 µmol/l

Bilirubin (összes)

1. nap

2. nap

3–5. nap

1 hét után

Felnőtt

˂ 100 µmol/l

˂ 154 µmol/l

˂ 205 µmol/l

˂ 25 µmol/l

˂ 20 µmol/l

Fehérvérsejtszám

˂ 6 hónap

˂ 10 év

˂ 7 év fölött

6–17,5 G/l

4,5–13,5 G/l

4,8–10,8 G/l

Glükóz

˂ Újszülött

˂ 1 hétnél idősebb

Felnőtt

1,7–3,3 mmol/l

2,9–5,4 mmol/l

3,6–6,0 mmol/l

Gamma-GT

˂ 1 hónap

˂ 2 hónap

6 hónapnál idősebb

Felnőtt

˂ 151 U/l

˂ 11 4 U/l

˂ 50 U/l

7–50 U/l

GOT (ÁSAT)

˂ 1 hét

˂ 1 év

Felnőtt

˂ 100 U/l

˂ 65 U/l

˂ 40 U/l

GPT (ALAT)

˂ 1 hét

˂ 1 év

Felnőtt

˂ 45 U/l

˂ 45 U/l

˂ 40 U/l

Hematokrit

˂ 1 hónap

6–12 hónap

1–6 év

Felnőtt nő

Felnőtt férfi

0,41–0,66

0,32–0,42

0,34–0,43

0,36–0,48

0,40–0,52

Hemoglobin

Újszülött

˂ 1 hónap

12–18 év lány

12–18 év fiú

Felnőtt nő

Felnőtt férfi

140–205 g/l

110–171 g/l

116–153 g/l

120–164 g/l

120–160 g/l

135–170 g/l

Húgysav

˂ 1 hónap

Gyermek

Felnőtt nő

Felnőtt férfi

˂ 311 µmol/l

˂ 362 µmol/l

140–340 µmol/l

220–420 µmol/l

Kalcium (összes)

˂ 4 hét

2–12 hónap

Felnőtt

1,8–2,8 mmol/l

2,1–2,7 mmol/l

2,1–2,6 mmol/l

Kálium

Újszülött

2–12 hó

Felnőtt

3,0–6,0 mmol/l

3,6–5,8 mmol/l

3,5–5–3 mmol/l

Klorid

Újszülött

1–18 év

Felnőtt

96–116 mmol/l

96–111 mmol/l

99–111 mmol/l

Koleszterin

< 1 hónap

2–12 hónap

Felnőtt

1,3-4,4 mmol/l

1,6-4,9 mmol/l

< 5,2 mmol/l

Kreatinin

Újszülött

< 6 év

Felnőtt nő

Felnőtt férfi

< 75 μmol/l

< 52 μmol/l

< 44–97 μmol/l

62–106 μmol/l

Kreatinkináz (CK)

< 1 hét

1 hét – 1 év

Felnőtt

< 600 U/l

< 240 U/l

< 24–195 U/l

LDH

< 2 hét

< 2 év

Felnőtt

< 1700 U/l

< 600 U/l

230–460 U/l

Nátrium

Újszülött

1–18 év

Felnőtt

132–147 mmol/l

132–145 mmol/l

135–150 mmol/l

Thrombocyta-szám

Minden életkorban

150–400 G/l

Urea (Karbamid)

< 1 év

1–14 év

Felnőtt

< 1,4–6,8 mmol/l

1,8–6,4 mmol/l

3,6–7,2 mmol/l

Vas

Újszülött

Gyermek

Felnőtt nő

Felnőtt férfi

7–45 μmol/l

7–19 μmol/l

7–26 μmol/l

10–28 μmol/l


Verejtékelektrolit-meghatározás. Tipikus gyermekgyógyászati laborvizsgálat a cisztikus fibrosis kivizsgálásában alkalmazott verejtékelektrolit-meghatározás, melyre több fajta célkészüléket fejlesztettek ki (16.5A, B ábra). A vizsgálat 3–5 percig tartó pilocarpin iontoforézissel kezdődik, amit tipikusan az alkar hajlító oldalán alkalmazunk, szőrmentes felületen, ahol viszonylag nagy a verejtékmirigyek száma. Ezután a stimulált felületet desztillált vízzel leöblítjük, majd 30–60 percen át gyűjtjük a verejtéket a készülékhez tartozó gyűjtőfeltét segítségével. Végül közvetlenül meghatározzuk az összegyűjtött verejtékminta kloridion-koncentrációját, ez 60 mmol/L fölött kóros. Álpozitív eredményt kaphatunk mellékvesekéreg-elégtelenség, nephrogén diabetes insipidus, hypothyreózis, hypopartathyreózis, malnutrició és egyes örökletes anyagcserezavarok eseteiben. Álnegatív lehet az eredmény a felszívódási zavar okozta hypoproteinémia miatt oedemás mucoviscidosisos betegekben.

16.5. ábra. Mintavétel verejtékelektrolit-meghatározáshoz (A) és a verejtékelektrolit mérésére szolgáló készülék (B)

Vércukor meghatározása tesztcsíkkal. Gyakran az analitikailag kevésbé pontos, csak tájékoztató, de gyors vizsgálat a beteg szempontjából vitathatatlan elő-nyökkel rendelkezik. Használható a rosszullét jellegének megítélésére – hypo- vagy hyperglicaemia, vagy éppen normális vércukor-koncentráció mellett más okból fellépő panaszok – illetve cukorbetegek rendszeres otthoni önellenőrzésére. Fontos megjegyezni: a tesztcsík is lehet hibás, ill. nem megfelelő körülmények között tárolva tönkremehet. A mérőműszert időről időre hitelesíteni kell. A tesztcsíkkal végzett vizsgálat analitikai pontossága mindig elmarad a laboratóriumi körülmények között végzett vizsgálatétól, ezért időnként – és a gyógyszerbeállítás idején feltétlenül – szükség van pontos vércukor-meghatározásra is. A mai POCT-készülékek általában minimális vérmennyiségből akár 8–10 paraméter mérésére képesek. Ennek előnyei elvitathatalanok, ugyanis nagyban meggyorsítja a klinikai döntéshozatalt, és nagyon kis mennyiségű vérből igen sok adatot tud szolgáltatni, így pl. ideális koraszülöttek–újszülöttek vizsgálatára, állapotuk monitorizálására.

Azonban a POCT-készülékekkel kapott eredmények csak abban az esetben tekinthetők validnak, ha azt (i) megfelelően képzett személyzet végzi, akik képzése kiterjed a megfelelő mintavételre és egyéb preanalitikai szempontokra is; (ii) a készülék rendszeresen karbantartott, és azon megfelelő időnként belső és külső minőségi kontroll vizsgálatok mérése történik; (iii) a betegeredmények archiválásra kerülnek a laboratóriumi informatikai rendszerben. Sajnos a hazai gyakorlat még messze áll ezen ideális állapottól, pedig nagyon fontos figyelembe venni, hogy a POCT-módszerrel végzett vizsgálatok (vérgázok, bilirubin, glükóz stb.) validak legyenek, mivel a mérések után gyakran azonnal terápiás beavatkozások történnek.

Sürgősségi laborvizsgálatok

A nap 24 órájában állandóan elérhető, a vizsgálat jellegétől függően maximum 1/2–1 órán belül elvégezhető meghatározások, melyeknek eredménye az orvosi döntést, beavatkozást jelentősen befolyásolhatja. Általában súlyos, életveszélyes állapottal kapcsolatba hozható paraméterek.

A sav-bázis anyagcsere vizsgálata célszerűen az intenzív osztályon, perinatalis intenzív centrumban, a beteg közvetlen közelében történik, így elkerülhetők a minta szállításából, tárolásából adódó hibák, az esetlegesen bealvadt minta gyorsabban pótolható, és az eredmény is azonnal rendelkezésre áll. Sok esetben egy vérmintából a vérgázok mellett a legfontosabb ionok (nátrium, kálium, klorid és ionizált kalcium), sőt glükóz és laktát is meghatározható.

A sürgős vizsgálatok elrendelésekor mindig mérlegelni kell, hogy csak a valóban informatív, legfontosabb paramétereket kérjük. Egy betegtől 20–25 „sürgős” vizsgálat egyidejű elrendelése demoralizál, és technikailag is lehetetlenné teszi a gyors eredményközlést. Emellett az egyedileg végzett sürgős vizsgálatok anyagköltsége a sorozatmérések árának többszöröse lehet.

Molekuláris diagnosztika

Az orvostudomány és ezen belül az újszülött- és gyermekgyógyászati kórképek diagnosztikája az utóbbi évtizedekben jelentős változáson ment át. Az olyan kórképek laboratóriumi diagnosztikája, mint a cysticus fibrosis, a Gaucher-kór, a Duchenne-féle izomdystrophia, dystrophia myotonica, a primer immundefektusok, a 21-hidroxiláz-hiány, a haemophilia vagy a fiatalkori thrombosisok hátterének vizsgálata mindaddig nem volt lehetséges, amíg az elsősorban biokémiai és molekuláris biológiai módszereket alkalmazó alapkutatások fejlődése ezt lehetővé nem tette. Ma az olyan módszerek, amelyek 10–20 évvel ezelőtt még vagy nem is léteztek vagy csak a kutatólaboratóriumokon belül voltak használatosak, bevonultak a klinikai laboratóriumokba, és a mindennapi orvosi diagnosztika részévé váltak. Ez teremtette meg a lehetőséget arra, hogy a betegségek okait molekuláris szinten keressük, és az addig meglehetősen bizonytalan diagnózisú vagy nem is vizsgálható kórképek esetében pontos diagnózist tudjunk adni. A molekuláris szintű diagnosztika elsősorban a fehérjék és a nukleinsavak azonosítása terén ért el kimagasló eredményeket. Ma már elképzelhetetlen a gyermekkori leukémiák diagnosztikája a felszíni és intracitoplazmatikus markerek analízise nélkül, vagy a Duchenne-féle izomdystrophia kivizsgálása a megfelelő génszakaszok deléciójának kimutatása nélkül. Ezen fejezet kereteit messze meghaladó kérdés az, hogy a molekuláris genetika ilyen rohamos fejlődése nem csak a diagnosztika, hanem a terápia területét is jelentősen befolyásolhatja. A hagyományos gyógyszeres kezelés során a szervezetben zajló funkciók egyensúlya tolódik el, de a szervezet nem kap új funkciókat. A génterápia a szervezetben addig nem is létező új funkciókat indít el, olyan esetekben, mint a mono- vagy multigénes megbetegedések, a rák, szív- vagy szövettranszplantáció. A világon már több száz humán génterápiás vizsgálat történt, amelyek elsősorban a daganatos megbetegedésekre és a monogénesen öröklődő kórképekre terjednek ki. A génterápiás eljárások kétharmada az Egyesült Államokban került kivitelezésre, és az összes génterápiás vizsgálatnak alig több mint 3%-a jutott el a szélesebb körű (III-as fázisú) klinikai kipróbálásig. Így elmondhatjuk, hogy a génterápiás próbálkozások nem váltották be a hozzájuk fűzött nagy reményeket, és az utóbbi 3 évben számuk évente már nem is emelkedett. A molekuláris biológiai labordiagnosztika ennél már jóval előbbre tart. Ezen fejezet röviden össze kívánja foglalni azokat a módszereket, amelyek a molekuláris szintű klinikai laboratóriumi diagnosztika részét képezik.

Fehérjék/receptorok analízise

Western blot. Gyakran szükség van annak kimutatására, hogy valamely fehérje az adott sejt vagy szövet homogenizátumában jelen van-e vagy hiányzik. Ezen kimutatási eljárások egyik módszere a Western-blotting. Először a fehérjetartalmú mintákat egy vertikális elektroforézisnek vetjük alá, majd a poliakrilamid gélben lévő fehérjéket lapszerint egy nitrocellulóz membránra visszük át. A nitrocellulóz papír – mely a gélnél mechanikai hatásoknak sokkal jobban ellenáll – alkalmas immunreakció kivitelezésére. Ennek első lépésében egy – a vizsgálni kívánt fehérje ellen termelt – antitesttel inkubáljuk a nitrocellulóz membránt, majd az első antitest ellen termelt második antitest következik, mely enzimmel jelzett. Az enzim szubsztrátjának hozzáadása után a reakció vizualizálható lesz, vagyis a kérdéses fehérje – vagy annak fragmentjei – színes sávként tűnnek fel.

Immuncitokémia. Hasonló immunreakciót felhasználva detektálhatók fehérjék sejt- vagy szövetpreparátumon is. Ilyenkor természetesen az értékelés mikroszkóppal történik. Ezen módszerrel a vizsgálni kívánt molekula szöveten vagy szerven belüli eloszlásáról is felvilágosítást kapunk.

Áramlási citometria. A felszíni vagy intracelluláris fehérjék kimutatását egyidejűleg különböző egyéb markerek kombinációjával is elvégezhetjük, így meg tudjuk azt mondani, hogy adott fehérjét milyen típusú sejtek tartalmaznak. Ha a fenti kettős jelzésű reakciót sejtszuszpenzión végezzük és a mintát áramlási citométerben analizáljuk, akkor megadható az egyes markerekre jelölődő frakciók százalékos aránya és a jelölődés intenzitása is, sőt újabban megfelelő kalibráció segítségével a receptorok átlagos sejtenkénti száma. Ezt a módszert használjuk fel a leukémiák tipizálása vagy a primer immundefektusok diagnosztikája terén.

DNS-, RNS-analízis

Sejtciklus-analízis és DNS-index

A humán szomatikus sejtek 2N kromoszómaállománnyal rendelkeznek. A sejtciklus S fázisában a DNS-tartalom növekszik, és a G2/M fázisban eléri az eredeti mennyiség kétszeresét (4N). A csontvelői vagy tumorsejtek DNS-analízise a kettős szálú DNS-be interkalálódó festékkel történik, melynek következtében a DNS mennyiségével arányos fluoreszcencia emittálódik. Ennek alapján megadható a sejtciklus egyes fázisában lévő sejtek százalékos aránya, illetve a DNS-index, mely a vizsgált sejtpopuláció G0/G1 fázisban lévő sejtjeinek és a kontroll lymphocyták DNS-mennyiségének hányadosa. Diploid sejtek esetén a hányados közel 1. Hyperdiploiditás (DNS-index > 1,05) vagy hypodiploiditás (DNS-index < 0,95) fontos prognosztikai faktor leukémiák és szolid tumorok esetén is.

Southern blot és Northern blot. A genomiális DNS fragmentációja restrikciós endonukleázokkal az első lépése a Southern blot analízis elvégzésének. A kérdés ilyenkor az, hogy mely restrikciós fragmenshez hibridizál az adott tisztított próba. A DNS restrikciós fragmenseket gélelektroforézissel elválasztjuk, denaturáljuk, majd a Western blothoz hasonlóan a nukleinsav fragmenseket egy nitrocellulóz membránon immobilizáljuk. A nitrocellulózt ezután radioaktívan jelölt nukleinsav szekvenciákkal inkubáljuk. A komplementer szekvenciák egymáshoz kötődnek, és a kötődést autoradio-graphiás vagy fluoreszcens módszerrel mutatjuk ki.

A Northern blot esetében a DNS-nél leírtakhoz hasonlóan mutathatjuk ki a messenger RNS-eket. Ez igen ritkán végzett diagnosztikai eljárás, melyhez először denaturálni kell az RNS-molekulákat, hogy a hidrogénhidak felbomlásával lineáris molekula jöjjön létre. Ezt követi a gélelektroforézis, a nitrocellulózra történő átvitel, majd a radioaktívan jelölt DNS-sel történő hibridizáció és autoradiográfia.

Polimeráz láncreakció (PCR). Soha még eljárás nem forradalmasította olyan mértékben a molekuláris biológiát, mint a PCR. Feltalálóját (Mullis) 1994-ben Nobel-díjjal jutalmazták. A PCR-hoz egy ismert szekvenciájú DNS-szakasz (templát) szükséges, és két oligonukleotid, mely a DNS-szál 5’ és 3’ végével komplementer. A PCR-reakció enzime a Taq DNS polimeráz, amely igen nagy hőtűrésű (hőforrásokban élő baktériumból, a Thermus acquaticusból származik). Ez az enzim végzi a DNS-lánc hosszabbítását a megfelelő deoxinukleotidok beépítésével. Az első lépésben a kettős DNS-spirált 91–94 °C-on szétválasztjuk, hogy egyszálú DNS jöjjön létre. A mintát később 50–60 °C-ra hűtjük, hogy az oligonukleotid primerek a megfelelő szekvenciával össze tudjanak kapcsolódni (hibridizálni). Ezután a DNS-szakaszok szintetizálása történik Taq polimeráz jelenlétében 72 °C-on. A folyamat végén 2 dupla példányú DNS-hélix áll majd rendelkezésre. Ha ezt a három lépésből álló folyamatot (denaturáció, hibridizáció, extenzió) megfelelő (n) számú alkalommal elvégezzük, elméletileg 2n példányt kapunk a kívánt szekvenciából. Ha a PCR-hoz nem egy, hanem több primert használunk (multiplex PCR), akkor lehetőségünk van arra, hogy több gén amplifikált termékeit, vagy egy gén különböző szakaszait detektáljuk egyidejűleg. Ez különösen hasznos olyan esetekben, amikor a mutáció a génnek jó néhány régiójában előfordulhat, mint a Duchenne-féle izomdystrophia esetén. A PCR nélkülözhetetlen eszközzé vált a fertőző betegségek gyors, pontos etiológiai diagnózisában, a vérkészítmények virológiai szűrésében (HIV, HBV, HCV), klinikai epidemiológiai vizsgálatokban, valamint az öröklődő betegségek és rizikófaktorok diagnózisában.

A molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a gyermekgyógyászati diagnosztikában. A molekuláris biológiai vizsgálatokhoz általában perifériás vér használatos, melynek fehérvérsejtjeiből nyerjük a szükséges DNS-t, de ezen kívül egyéb lehetőségek is vannak. A molekuláris biológiai vizsgálatok a diagnosztika számos területét érintik, mint pl a B- és T-sejt génátrendeződés vizsgálata hemopoietikus zavarokban, a mycobacteriumok kimutatása molekuláris biológiai módszerekkel, vagy valamely fehérje messenger RNS-nek kimutatása in situ hibridizációval biopsziás anyagon. Fontos tudni, hogy a molekuláris biológiai vizsgálatok nem kiegészítő vizsgálatok, hanem sokszor a biztos diagnózis egyetlen letéteményesei, mint pl. cysticus fibrosisban előforduló mutációk kimutatása, a fiatalkori thrombosisok esetén az V. véralvadási faktor mutációjának kimutatása vagy anti-HCV-negatív beteg HCV-fertőzöttségének bizonyítása.

Irodalom

William J., Marshall: Klinikai kémia. Medicina Kiadó, 2003.

Debreczeni Lóránd, Kovács L. Gábor: Gyakorlati laboratóriumi medicina. Literatura Medica Kiadó, 2008.

Soldin-Brugnara-Wong: Pediatric Reference Ranges. AACC Press, 2003.