Ugrás a tartalomhoz

Általános állattenyésztés

Bodó Imre, Dinnyés András , Farkasné Bali Papp Ágnes, Fésüs László, Hidas András, Holló István, Horvainé Szabó Mária, Komlósi István, Kovács András, Lengyel Attila, Mihók Sándor , Nagy Nándor, Polgár J. Péter, Szabó Ferenc , Szabóné Willin Erzsébet, Tőzsér János

Mezőgazda Kiadó

Citogenetika

Citogenetika

A citogenetika tudományterülete a genetika sejtszinten megfigyelhető jelenségeivel foglalkozik. Ezek alatt elsősorban a különböző mikroszkópos technikákkal megjeleníthető kromoszómák, illetve sejtmagvak vizsgálatát értjük.

A ma már számos hisztológiai, kromoszómafestési és molekuláris citogenetikai módszer igen sokrétű megfigyelésekre ad módot. Az utóbbi technikák tették lehetővé a molekuláris és a citogenetika közvetlen kapcsolódását, a molekuláris citogenetika kialakulását.

Az állattenyésztésben a citogenetika módszereit a kromoszóma rendellenességek felismerésére, a domesztikációs kutatásokban, valamint a biotechnika-biotechnológia területén alkalmazzuk.

Alapfogalmak és módszerek

A kromoszómák az öröklődés DNS-ből és fehérjékből álló fizikai egységei, amelyek a gének többségét hordozzák. Az azonos kromoszómán lokalizált gének kapcsoltan öröklődnek.

A citogenetika alapvető eszköze a fénymikroszkóp, amely célszerűen fluoreszcens vizsgálatokra is használható. A modern készülékeket videokamerás számítógépes képértékelő rendszerek egészítik ki. Az áramlásos citométer olyan fluoreszcens mikroszkóp, amely a lencse előtt folyadékban áramló sejtek értékelését automatikusan óriási (több ezer sejt/perc) sebességgel végzi. A szorterrel felszerelt készülékek különböző sejttípusok, illetve kromoszómák elkülönített gyűjtésére is alkalmazhatók. Az elektronmikroszkópot ritkábban használják.

Vizsgálati technikák. A kromoszómák tanulmányozására többnyire intenzíven osztódó szövetekre, sejtekre van szükség. Sűrűn osztódó sejtek, szövetek (pl. csontvelő, embriók, egyes daganatok, meiózis, petesejtek) azonnal vagy rövid inkubálás után vizsgálhatók („direkt preparálás”), de a legtöbb esetben 2–3 napos limfocita (MOORHEAD és mtsai. 1960) vagy 1–2 hetes fibroblaszt-tenyészetekből nyerjük a kromoszóma-preparátumokat.

A sejtosztódást vegyi kezeléssel (pl. kolhicin, vinblasztin) metafázisban megállítva növeljük az értékelhető sejtek arányát, majd a kromoszómák szétterülésének javítására a sejteket hipotóniás oldatban duzzasztjuk, és ecetsavas alkoholban fixáljuk. A fixált sejteket tárgylemezre szélesztjük, amelyen a célnak megfelelő festés után vizsgáljuk a kromoszómákat.

A rutin preparátumokat Giemsával festjük, az osztódásokat 100–125-szörös nagyítással felkeressük, majd 1000–1250-szeres immerziós nagyítással vizsgáljuk. A kromoszómák mérete és alakja (6.3. és 6.4. ábra) szerint az egyes fajok sejtjeinek jellemző kromoszómakészletét nemzetközi megegyezések alapján mesterséges rendszerbe rakják, és ezt nevezik normális kariotípusnak (6.6. táblázat).

6.3. ábra - A kromoszóma részei

kepek/6.3.abra.png


6.4. ábra - A kromoszómák alaki osztályozása a centroméra helyzete alapján

kepek/6.4.abra.png


6.6. táblázat - Emlős házi- és haszonállataink normális kromoszómaszáma

Faj

2n

Megjegyzés

Házinyúl (Oryctolagus cuniculus)

44

 

Csincsilla (Chinchilla laniger)

64

 

Nutria (Myocastor coypus)

42

 

Kutya (Canis familiaris)

78

 

Kékróka (Alopex lagopus)

50–48

Robertson-polimorfizmus

Vörösróka (Vulpes vulpes)

34–40

34 + 0–6 mikrokromoszóma

Vadászgörény (Putorius putorius furo)

40

 

Amerikai nyérc (Lutreola vison)

30

 

Macska (Felis catus)

38

 

Háziló (Equus caballus)

64

 

Háziszamár (E. asinus)

62

 

Házisertés (Sus domesticus)

38

 

Kétúpú teve (Camelus bactrianus)

74

 

Egypúpú teve (C. dromedarius)

74

 

Láma (Lama glama)

74

 

Alpaka (L. pacos)

74

 

Rénszarvas (Rangifer tarandus)

70

 

Gímszarvas (Cervus elaphus)

68

 

Dámszarvas (Dama dama)

68

 

Kecske (Capra hircus)

60

 

Juh (Ovis aries)

54

 

Bivaly (Bubalus bubalis)

50

alfaj-polimorfizmus

Mocsári bivaly (B. b. kerabau)

48

(tandem-transzlokáció)

Marha (Bos taurus)

60

 

Jak (Poephagus grunniens)

60

 

Bali marha (Bibos banteng)

60

 

Gajal (Bibos frontalis)

58

 

Funkcionális szempontból a kromoszómák autoszómákra és gonoszómákra (testi és ivari kromoszómákra) oszthatók. Emlősöknél a nőivar homo (2n, XX), a hímivar pedig heterogametikus (2n, XY), az X-kromoszóma jellemzően a nagy, míg az Y a legkisebb alakok közé tartozik. A madaraknál ez fordítva alakult ki, itt a hím a homo (2n, ZZ) és a tojó a heterogametikus (2n, ZW) ivar.

Bővebb információt adnak a különböző kromoszómasávozások, ezeket pontosabb és differenciáltabb diagnosztizáláshoz és kutatási célból alkalmazzuk. A magasabb rendű gerincesek genomja sajátos kettős tagozódást mutat, ami citológiai szinten is kimutatható bizonyos kezeléseket követően a kromoszómák hosszában jelentkezőváltakozó festődési intenzitású szakaszok formájában. Az így jelentkező G- (kezelés után Giemsa-festés, 6.5. ábra), Q- (előkezelés nélkül az előzőhöz hasonló fluoreszcens quinacrin-festődés) és R- (kezelés után az előzőkkel nagyjából ellentétes, reverz festődés) sávmintázatok az egyes kromoszómapárokra jellemzőek, ami lehetővé teszi azok azonosítását és a kromoszómán belüli, illetve kromoszómák közötti átrendeződések kimutatását.

6.5. ábra - Sertéskan G-sávos kariotípusa (HIDAS A., 1996)

kepek/6.5.abra.png


A C- (centroméra-, 6.6. ábra) és az N- (nukleoluszorganizáló régió) sávok egyes kromoszómák (pl. ló X), polimorfizmusok és átrendeződések felismerésében segítenek.

Molekuláris citogenetikai eszközök (in situ DNS-hibridizáció): A kétszálú DNS egy-egy egymást kiegészítő, komplementer szálra bontható, amelyek azután specifikusan újra egyesíthetők (renaturálhatók).

Amennyiben az egyik szálat jelzett specifikus DNS-próbával hibridizáljuk (fluoreszcens in situ hibridizáció: FISH), akkor a próbának megfelelő komplementer szakasz jelenléte és kromoszómában elfoglalt helye kimutathatóvá válik. Egyszerre több eltérő jelölésű próba is alkalmazható. A sávozással kombinálva ezzel a módszerrel a hibridizációs jeleket bizonyos kromoszómák konkrét régióihoz rendelhetjük (fizikai géntérképezés).

A molekuláris citogenetika korszerű eszköztárának köszönhetően ma már nem kell feltétlenül osztódó szövetekből metafázisos kromoszóma-preparátumokat készíteni, hanem megfelelő DNS-próbákkal, próba keverékkel más osztódási stádiumokban lévő sejtmagvakban is kimutathatók a kromoszómák számbeli, esetleg szerkezeti elváltozásai is (interfázisos citogenetika).

Kromoszóma-polimorfizmusok és rendellenességek

A „normál kariotípus”-tól való eltérések két csoportját aszerint különböztetjük meg, hogy jelenlegi ismereteink szerint hátrányos következményekkel járnak-e vagy sem, de az elkülönítés egyes esetekben vitatott lehet. Viszonylag gyakoriak az Y-kromoszóma eltérő méretű és alakú változatai és az aktív genetikai információt nem tartalmazó C-sáv pozitív régiók eltérő méretű változatai (6.6. ábra).

6.6. ábra - Sertés C-sávos metafázisa (a 15. és 16. kromoszómák polimorf változatai; HIDAS A., 1996)

kepek/6.6.abra.png


A polimorf változatok sporadikus előfordulásúak, vagy a fajon belül egyes csoportokra jellemzőek (alfaj-polimorfizmusok, „chromosomal races”).

Egyes esetekben bizonyított, másokban feltételezhető, hogy a különböző kariotípusú fajok/alfajok keresztezése révén létrehozott heterozigóta hordozóknál kiegyensúlyozatlan gén- és kromoszómakészletű haploid sejtek és embriók jöhetnek létre, amelyek elhalása gazdasági kárt okozhat!

A kromoszóma-rendellenességek hátrányosak (embrionális veszteségek, többszörös fejlődési rendellenességek, csökkent szaporaság, meddőség) vagy más fajokban (pl. egér, ember) ismert analógiák alapján annak tekinthetők.

A kromoszóma-rendellenességek csoportosítása

1. Számbeli rendellenességek

Euploidia (a teljes kromoszómakészlet száma tér el a normál diploidtól):

Haploidia (1n, parthenogenezis, ivarsejtekben és hereméhekben normális!)

Poliploidia (tri-, tetra-, hexa- stb. ploidiák = 3n, 4n, 6n stb.).

A triploidok diploid petesejtből vagy dispermiából eredhetnek.

Aneuploidia (egyes kromoszómák száma tér el a normál kettőtől)

Triszómia (2n+1)

Monoszómia (2n-1)

Autoszómális és gonoszómális (pl. X0, XXX, XXY, XYY) heteroszómiák

2. Strukturális rendellenességek (kromoszómatörések után)

Deléció: kiesés (a kromoszóma egy részének elvesztése).

Duplikáció: megkettőződés.

Inverzió: egy kromoszómarész 180˚-os rotációja.

Pericentrikus: a centroméra is a megfordult szakaszban van, a kromoszóma alakja változhat.

Paracentrikus: a centroméra nem érintett, a kromoszóma alakja nem változik. Gyűrű-kromoszóma: A telomérák elvesztése után a kromoszóma gyűrűvé zárul. Transzlokációk: egyes szakaszok kromoszómák közötti átrendeződése. Reciprok transzlokáció: két kromoszóma részeinek kölcsönös cseréje.

Centrikus fúzió vagy Robertson-transzlokáció. Valójában az „egykarú” akrocentrikus kromoszómák speciális reciprok transzlokációja, amelynek során két nem homológ kromoszóma törése a centroméra közvetlen közelében történik. A létrejövő (szub)metacentrikus kromoszóma két egykarú kromoszóma centromérnél történő fúziójának tűnik (6.7. ábra), C-sávozással új mutációk esetében lehet di- vagy monocentrikus, a régi eredetű öröklődőknél jellemzően monocentrikus. A párhuzamosan képződő másik transzlokácós kromoszóma igen apró, jelentéktelen mennyiségű genetikai anyagot hordoz és igen hamar elvész a sejtosztódások során, így a kromoszómaszám csökken.

Tandem transzlokáció: egy akrocentrikus kromoszóma egy másik kromoszóma telomerikus végéhez csatlakozik, a kromoszómaszám csökken.

Inszerció: egy kromoszómarész beépülése egy másik kromoszóma intersticiális részébe.

Komplex transzlokáció: kettőnél több kromoszóma, illetve azok részei szerepelnek a változásokban.

3. Vegyes kariotípusok (különböző kariotípusú sejtek ugyanabban az egyedben)

Mozaicizmus: egy zigótából későbbi mutációk révén alakul ki.

Kimérizmus: több zigótából származó sejtek keveredése révén jön létre.

Elsődleges: implantáció előtt vagy alatt történik (két ikerpetesejt egy zónában, vagy sarkitest-termékenyülés, esetleg két hólyagcsíra egyesülése az implantáció során, mikromanipulációval létrehozott mesterséges kimérák).

Másodlagos: implantáció után (a placenták ereinek összenövése révén, pl. a szarvasmarha freemartin-szindrómája esetében).

Harmadlagos: születés után (pl. a daganatsejtek természetes átoltása a kutya nemi szervi daganata, a Sticker-szarkóma eseteiben vagy mesterségesen vérátömlesztés, csontvelő- és szervátültetések révén).

4. Eltérő kromoszómális és küllemi ivar

Fordított nem: 2n, XX hím álhermafroditák (herék és hím küllem). Öröklésmenete háziállatokban általában autoszomális recesszív, de emberben és egérben lehet X-hez kötött domináns is (YX mini-transzlokáció).

Tesztikuláris feminizáció: 2n, XY, hasűri herék, női küllem. Az X-kromoszómán lévő génmutáció miatt a sejtek androgénre érzéketlenek.

XY-gonád diszgenézis: 2n, XY, az előzőhöz hasonló, de kevéssé differenciált hasűri gonádok, női küllem.

Funkcionális alapon spontán és öröklődő rendellenességeket különböztetünk meg, ezek példáit az egyes, gazdasági fontosságuk sorrendjében felsorolt fajoknál említjük.

Szarvasmarha. Fajra jellemző kromoszómaszáma 2n = 60. A kariotípus kirakása sávozás nélkül nem lehetséges, mivel az 58 akrocentrikus autoszómából áll, míg az X-kromoszóma nagy szubmetacentrikus, az Y-kromoszóma pedig polimorf: a legtöbb európai eredetű fajtában szubmetacentrikus (a charolais-ben és a hegyi tarkákban nagyobb, másokban, így a magyar szürkében, maremmanban, holstein-frízben és fehér-kék belgában kisebb), a jerseyben metacentrikus, míg a zebu alfajban jellemzően akrocentrikus.

A kariotípusban esetleg előforduló metacentrikus autoszómák már közvetlen mikroszkópos megfigyeléssel is nagyon feltűnőek, így a fajban talált centrikus fúziók magas arányának technikai oka is lehet. Az 1/29 centrikus fúzió (6.7. ábra) volt az első háziállatban leírt öröklődő kromoszóma-rendellenesség, amelyet világszerte több mint 70 fajtában megtaláltak, ezért feltételezik, hogy már az őstulokban is jelen lehetett. A 70-es években indultak meg egyre több országban a rutinvizsgálatok, amelyeket az állatok magas egyedi értéke mellett a mélyhűtött sperma általános használata és nemzetközi forgalma is indokolttá tett. A hordozók külleme, súlygyarapodása és laktációs termelése meghaladja az átlagot, ami a csökkent szaporasággal fennálló negatív korrelációkkal magyarázható és rendellenességre történő szelekciót eredményezhet! Hazai vizsgálataink szerint a heterozigótahordozó tenyészbikák spermájának mennyisége, laboratóriumi minősítése, mélyhűthetősége és fertilitása nem mutatott eltérést. Svédországban fiatal szelektálatlan bikáknál csökkent fertilitást írtak le, de ennek mértéke jelentősen kisebb volt, mint a nőivarban. A heterozigótahordozók borjaik felében örökítik a kiegyensúlyozott terheltséget. A nőivarú magyar tarka hordozók 30%kal gyakrabban ivarzottak vissza, ciklusuk hossza normális volt. A két ivar közötti eltérést a hím és a női meiózis eltérő menete és a sokmillió ondósejt, illetve azok előalakjai közötti szelekció magyarázhatja. Hordozó szülőktől származó kiegyensúlyozatlan kromoszómakészletű blasztocisztákat találtak, de a vetélések aránya nem nőtt meg, ami korai implantáció előtti veszteségekre utal. Az 1/29 transzlokáció elterjedésében szerepet játszott, hogy a látszólagos előnyök miatt a hordozók nagyobb eséllyel váltak tenyészbikává és bikanevelő tehénné. Tenyészállatokkal és mélyhűtött spermával számos esetben került be további fajtákba és országokba. Magyarországra bizonyítottan a maremman, bajor tarka, montbeliard, svéd vörös-fehér, blonde d’Aquitaine és charolais fajtákkal importáltuk. A mesterséges termékenyítésben használt bikákat 1975 óta vizsgáljuk, a strukturális kromoszóma-rendellenességek hordozóit tárolt spermájukkal együtt selejtezik, így azóta a borjak csak anyjuktól örökölhettek rendellenességeket, amelyek gyakorisága generációnként feleződött. A magyar szürke szarvasmarhába egyetlen egy 1971-ben importált maremman bikával került be a rendellenesség, mintegy ezer állat vizsgálatával és mindkét ivarú hordozók selejtezésével az 1970-es évek végére elvégeztük a mentesítést.

6.7. ábra - 1/29 centrikus fúzió (Robertson-transzlokáció) maremman × magyar szürke bikában (KOVÁCS A., 1984)

kepek/6.7.abra.png


Annak is technikai oka lehet, hogy a fajban viszonylag kevés reciprok transzlokációt közöltek. Az amerikai borzderes fajtában talált 1/8/9 komplex ciklikus transzlokáció (a három kromoszóma eltérő méretű telometrikus részei körbe cserélődtek) mindkét ivarban a fertilitás óriási mértékű csökkenésével járt, így beavatkozás nélkül sem válhatott volna gyakorivá.

A szarvasmarha jellegzetessége, hogy az ikrek közötti placenta összenövések révén hemopoetikus őssejtek és hormonok jutnak át, így a vegyes ivarú ikerpárok tagjainak limfocita osztódásaiban az esetek 94%-ában XX/XY kimérizmus mutatható ki. Az ilyen üszők csaknem kivétel nélkül meddők (freemartin-szindróma), míg a bikák normális fertilitásúak lehetnek. Ha a vegyes ivarú ikervemhesség a bika-magzat korai elhalása miatt rejtve marad, az üsző limfocitának kromoszómavizsgálata diagnosztikai és kórjóslati értékű.

Az ivari kromoszómák számbeli rendellenességei szarvasmarhában rendkívül ritkák.

Sertés. Fajra jellemző kromoszómaszáma 2n = 38. A kromoszómapárok többségének egyedi azonosítása konvencionális festéssel is könnyű és a szerkezeti átrendeződések is viszonylag könnyen felismerhetők. Talán ezért van, hogy ebben a fajban írták le a legtöbb reciprok transzlokációt. Általában nem okoz küllemi eltérést, mivel a diploid genetikai anyag dózisában nem történik változás. Az ondó szokásos laboratóriumi vizsgálatai sem utalnak rendellenességre, de az alomszám mintegy a felére csökken. A jelenség oka az, hogy a meiózis során a reciprok transzlokációban érintett kromoszómapárok szegregációja a Mendel-szabályok szerint kiegyensúlyozatlan genetikai állományú gaméták képződéséhez is vezet. Ezek részvétele általában zavartalan a termékenyülésben, de olyan kiegyensúlyozatlan génállományú embriókat képeznek, amelyek korán elhalnak. A jelenség súlyosabb következménye, hogy a transzlokációs, rendellenes kromoszómák kiegyensúlyozott kombinációban örökítve nem zavarják sem az embrionális, sem a későbbi egyedfejlődést, így átörökíthetők, sokszorosíthatók a következőgenerációkban. Ennek annál is inkább megvan a veszélye, mert könnyen kontraszelekció alakulhat ki, ugyanis a kisebb almok egyedei jobb küllemük és súlygyarapodásuk révén eséllyel kerülhetnek továbbtenyésztésre! A kontraszelekció veszélye különösen ott magas, ahol a szelekcióban nem fektetnek kellőhangsúlyt a szaporaságra és/vagy nem végeznek alomkiegyenlítést. A gyakorlatban sűrűn előforduló kevert spermás termékenyítés is segítheti a rendellenesség felszaporodását az állományokban. A jelenség gyakorlati súlyát mutatja, hogy a rutinszerűen ellenőrzött, csökkent alomszámot mutató tenyészkanok 50%-ában sikerült különféle reciprok transzlokációkat kimutatni. Sertésben viszonylag gyakori az autoszomális recesszív öröklésmenetet követő fordított nem. A rejtettheréjű hím álhermafroditák gyakorlati körülmények között nehezen ivartalaníthatók, társaikat ugrálják, húsuk az ivari szag miatt csökkent értékű. Az esetek gyakorisága az ilyen utódok apjának és anyjának selejtezésével csökkenthető.

. Fajra jellemző kromoszómaszáma 2n = 64. A kariotípus felállítása igen nehéz, ugyanis a kromoszómák magas száma mellett sok a kisméretű alak. Ez lehet az oka, hogy igen kevés autoszomális rendellenességet írtak le. Írországban egy rendellenes viselkedésű csikóban 17-es triszómiát írtak le, a FISH alapján kiderült, hogy ez a kromoszóma megdöbbentő azonosságot mutat az ember 21-esével, így az eset a Down-kór megfelelőjének tekinthető.

Az elsődlegesen meddőkancák mintegy a fele 63, X0 kariotípusú, az első hazai esetet 2002-ben ismertették. Az X-monoszómia emberben is hasonló gyakorisággal fordul elő (Turner-szindróma). Az ilyen kancák az átlagnál kisebb termetűek, inaktív petefészkük sima felületű, ivari ciklusuk nincs (elsődleges meddőség). Ez a rendellenesség könnyen megállapítható, ugyanis a megfigyelhető kromoszómaszám csak 63. Az autoszomális monoszómiák súlyos következményekkel (embrionális elhalás, többszörös fejlődési rendellenességek) járnak, ezért szinte bizonyos, hogy a meddő kancák 63-as kariotípusa X-monoszómiát jelent. C-sáv technikával a ló kariotípusában egyedül az X-kromoszóma mutat kettő, a szokásos centromérikus mellett még egy sávot a hosszú karon, ami kétségtelenné teszi a diagnózist.

Lóban leírták a tesztikuláris feminizációt (tfm) és XY-gonád diszgenézist is. A tfm recesszív génjét a heterozigóta-hordozó termékeny XX+-kancák örökítik, homozigóta kanca és hordozó mén nincs (6.9. táblázat).

6.9. táblázat - A tesztikuláris feminizáció öröklésmenete

X

Y

X

XX (normális kanca)

XY (normális mén)

X+

X+X (hordozó kanca)

X+Y (meddőkanca)


Az állatorvosi klinikai munkát kiegészítve az értékes állatok kromoszómavizsgálata megerősítheti a diagnózist és döntő lehet a kórjóslat felállításában, megelőzheti az X0-kancák felesleges kezelési és termékenyítési költségeit és segítheti az öröklődő tesztikuláris feminizációtól való mentesítést.

Juh. Fajra jellemző kromoszómaszáma 2n = 54. A kariotípus annyiban tér el a szarvasmarháétól, hogy a 3 legnagyobb kromoszómapár meta-, míg az X-kromoszóma akrocentrikus, az Y pedig apró pontszerű. A kromoszómák interkaláris sávozással mutatott mintázata igen nagy homológiát mutat a szarvasmarháéval. A kétkarú kromoszómák karjaiban is jól felismerhetők a szarvasmarha megfelelő egykarú kromoszómái. A kromoszóma-rendellenességek ritkák. Az Új-Zélandon talált három különböző centrikus fúzióval kapcsolatosan nem észlelték a fertilitás csökkenését, míg a Németországban leírt reciprok-transzlokáció esetében ez kifejezett volt. Néhány meddő hipogonádiás kosban az emberi Klinefelter-szindrómának megfelelő55, XXY eseteket is leírtak.

Kecske. Fajra jellemző kromoszómaszáma 2n = 60. Autoszómái a szarvasmarháéihoz, gonoszómái a juhéihoz hasonlóak. Néhány öröklődő centrikus fúziót is leírtak, de a faj specifikus problémája a szarvatlansággal kapcsoltan öröklődőfordított nem. A szarvatlanság a többi kérődzőhöz hasonlóan dominánsan öröklődik és P- (polledness-)génje itt is az 1. kromoszómán, de a rokon fajoktól eltérő lókuszon található. A P- és a recesszív sxr- (sexreversal-)gének szétválását több ezer állaton egyszer sem észlelték, ami azonosságukkal vagy igen szoros (közvetlen) kapcsoltságukkal magyarázható. Szarvatlan kecskefajta nincs, mert a létrehozására megkezdett kísérletek a második generációtól egyre halmozódó hím álhermafroditák miatt világszerte kudarcba fulladtak. A rendellenesség kártételei a sertésnél ismertettekkel azonosak. Gyakorlati tanács: ne párosíts szarvatlant szarvatlannal!

Baromfifélék. A madarak kariotípusára jellemző, hogy az emlősökéhez képest sejtenként kb. feleannyi genetikai anyag szerveződik jóval nagyobb számú kromoszómába. Általában a madár kariotípusok 70–80 közötti diploid kromoszómaszámmal épülnek fel. Ezek közül általában csak 5–8 pár kromoszóma vizsgálható (makrokromoszómák), míg a többi a fénymikroszkóp felbontóképességének határáig folytonosan csökkenő méretű, többnyire meghatározhatatlan alakú, azonosíthatatlan mikrokromoszóma. A baromfifélék csekély egyedi értékkel és rövid termelési ciklussal bírnak, ezért egyedi vizsgálatuk nagyobb számban ritkán történt. Ennek megfelelően igen kevés kromoszóma-rendellenességet írtak le, részben kísérletekben indukált mutációk révén fellépett transzlokációkat. Érdekes jelenség azonban, hogy ellentétben az emlősökkel, elég jól tolerálják a triploidiát. Az ilyen egyedek gyakran megérik a felnőttkort, ivaruk hím, vagy interszex az ivari kromoszómakészlettől függően, de meddők.

Mivel a baromfifélék embriói igen könnyen hozzáférhetőek, ezek kromoszóma rendellenességeiről jóval több információnk van, mint az emlősökéről. Az embriókban előforduló rendellenességek nagyrészt számbeli eltérések. Elsősorban az anyai meiózis hibájából (diploid petesejt) eredő triploidia, a szám feletti (termékenyítésben részt nem vevő) ondósejtek osztódásából kialakuló haploid sejtvonal megjelenése az embrió alakításában és a rendellenes sejtosztódásokból képződő tetra- vagy poliploid sejtvonalak a leggyakoribb rendellenességek, amelyek az esetek nagy részében igen korai (1–4 napos keltetési idő) embrióelhalást okoznak (6.8. ábra). Gyakoriságuk 1–15% lehet a keltetett tojások arányában és genetikai meghatározottságot mutat, a húsra szelektált vonalakban nagyobb (8–15%), tojó vonalakban kisebb (1–4%). Érdekes módon a tojásrakás beindulásakor jóval nagyobb arányban képződnek rendellenes kariotípusú embriók, mint a tojóciklus későbbi szakaszaiban, vagy a második tojóidőszakban. Feltehetően a tyúk ivarérése körüli endokrin változások okozzák a nagyobb gyakoriságot.

6.8. ábra - A házityúk normális diploid (balra) és triploid kariotípusú sejtosztódása (HIDAS A. felvétele)

kepek/6.8.abra.png


Domesztikációkutatás

A különböző fajok citogenetikai összehasonlítása értékes információkkal szolgál. Már a hagyományos festés is meglepőadatokat eredményezett, a vizsgálati módszerek tovább finomodtak a sávtechnikák, majd a molekuláris citogenetika (zoo-FISH) bevezetésével. Az emberi és állati kromoszómák nagy szegmensei meglepő azonosságot mutatnak, így az emberi géntérképezés előrehaladása meggyorsítja a haszonállatokét is, mert a humán próbák egy része azok preparátumain is használható.

Haszonállataink egyes rokonai eltérő kariotípusuk alapján nagy valószínűséggel kizárhatók az ősök sorából:

A mongóliai vadló (Equus przewalskii) több mint 100 egyedénél egységesen 66 kromoszómát és a házilóban ismeretlen C-sáv polimorfizmusokat is találtak. A háziló kariotípusa valamennyi vizsgált fajtánál – a mongol házilónál is – 64 kromoszómából áll. Egyedül az iráni kaszpi miniatűr lovak között találtak néhány 65-ös egyedet, amelyek kariotípusa a csökkent fertilitású Przewalski × háziló F1 hibridekével azonos.

Ez a gyenge szaporaságú fajta küllemileg nem hasonlít a Przewalski-lóra, lehet hogy

párhuzamos evolúció történt? A legkorábbi háziló leleteket Mongóliától és Kínától nyugatabbra (Ukrajna, Türkmenisztán és Kazahsztán területén) találták, az ottani vadlovak azóta kihaltak.

A háziszamár kariotípusa (2n = 62) azonos az afrikai vadszamarak két megmaradt, szomáli és núbiai alfajáéval. Az onáger (2n = 56) és a többi ázsiai félszamár (Equus hemionus alfajok) kariotípusa ettől jelentősen eltér és a háziszamárral létrehozott hibridjeik terméketlenek. A csonttani eltérésekkel együtt mindez teljesen kizárja az ázsiai félszamarak szerepét. A suméroknak a fennmaradt ábrázolások szerint voltak szelíd onagerei, de a háziló ezeket később kiszorította.

Az F1öszvérek kromoszómaszáma 63 és jellemzően meddők. Néhány termékeny kancáról írtak, ezek közül három kínai esetet genetikai vizsgálatokkal is meggyőzően bizonyítottak.

A házisertés kromoszómaszáma valamennyi vizsgált fajtában, így a mangalicában is 38, míg a vadsertések alfaj-polimorfizmusokat mutatnak. A legtöbb Sus scrofa alfaj kromoszómakészlete a házisertésével azonos, míg az európai Sus scrofa scrofa és a kazahsztáni S. s. nigripes esetében két különböző centrikus fúzió eredménye. A diploid érték 36. Jugoszláviában, a Szovjetunióban, Ausztriában és Lengyelországban hibrid zónákat is leírtak, ahol 36, 37 és 38-as kromoszómaszámú egyedek vegyesen fordultak elő.

Feltételezik, hogy a sertést két génközpontban, Délkelet-Ázsiában és Kelet-Európában, Nyugat-Ázsiában domesztikálták, ahol ma is 38-as kariotípusú alfajok élnek. Egyes hibrid-konstrukciókba a vadsertést is bevonják, ilyenkor célszerű lenne 38-as egyedeket és esetleg délebbi, nem szezonális szaporodású alfajt választani.

A házijuh kromoszómaszáma minden vizsgált fajtacsoportban (rövid farkú, hosszú farkú, zsírfarkú és zsírfarú) 54. Az ázsiai vadjuhok közül a nyugat-ázsiai vörös vadjuh (ázsiai muflon, Ovis orientalis) kariotípusa ezzel azonos, közeli rokonságuk régészeti (a legkorábbi házijuhleleteket Észak-Irak területén találták), csonttani és immungenetikai alapon is bizonyított. A Ciprus, Szardínia és Korzika szigeteken található muflonok feltehetően a domesztikáció kezdeti fokáról visszavadult populációk. Az argálik (O. ammon alfajok) kromoszómaszáma 56, az arkáloké (O. vignei alfajok) pedig 58, így valószínűleg nem ősei a házijuhoknak. Az amerikai vadjuhok (O. canadensis) földrajzi alapon sem lehetnek a házijuh ősei, mellyel csak ritkán keresztezhetők, mert immunológiai összeférhetetlenség miatt általában elvetélik a hibrideket. Érdekes, hogy kariotípusuk azonos a házijuhéval, amit párhuzamos kromoszóma evolúcióval magyaráznak.

Az ázsiai vadbivaly (Bubalus arnee) alfajai között 50-es és 48-as kariotípusúak is ismertek. A házibivalyok kariotípusa kétféle: a nyugati fajtacsoporté („river buffalo”) 50, a kelet-ázsiaié („swamp buffalo”, vagy kerabau) pedig 48 kromoszómából áll. A különbség oka tandem-transzlokáció, ennek és a morfológiai eltérések (szarvállás, testarányok, színek) alapján feltételezhető, hogy két helyen két külön alfajt domesztikáltak. Délkelet-Ázsiában az utóbbi harminc évben milliós nagyságrendben keresztezik a kerabaut indiai murrah bikákkal. A 49-es kromoszómaszámú F1 állatoknál jelentős heterózis mutatkozik a hús-, a tej- és az erőtermelésben. A haszonállat-előállítás indokolt lehet, de a későbbi generációkban a szarvasmarha 1/29 transzlokációjához hasonlóan a heterozigóták csökkent szaporaságával kell számolni!

A szarvasmarhában az Y-kromoszóma alfaj és fajta-polimorfizmusát már ismertettük. Az afrikai házimarhák eredetileg az európaiakkal rokonok, a púpos „szanga” fajták keletről bekerült zebuk, az Y-kromoszómák tanúsága szerint főleg bikák hatására alakultak ki.

A házilúd és a kínai hattyúlúd 4. kromoszómájának alaki eltérése megerősíti, hogy azok két külön vad őstől (Anser anser és A. cygnoides) származnak. Ezt a polimorfizmust hazánkban és Lengyelországban egyszerre fedezték fel és nem találtak problémát a hibrid eredetű előforduló heterozigótáknál (6.9. ábra) kubáni fajtában

6.9. ábra - A 4. kromoszóma polimorfizmusa kubáni lúdban

kepek/6.9.abra.png


A citogenetika alkalmazása a biotechnológiában

Mivel az emlősöknél a hímivar a heterogametikus (2n, XY), a haploid ondósejtek 50%-a nő (1n, X), 50%-a pedig hímivarú (1n, Y). A két gonoszóma eltérő mérete miatt a nőnemű ondósejtek több DNS-t tartalmaznak. Johnson és mtsai. az USA-ban DNS-specifikus fluoreszcens festés után áramlásos citométerrel végzett mérés és szortírozás után 95%-os tisztaságú X- és Y-ondósejt populációkat állítottak elő és eljárásukat szabadalmaztatták. Az ilyen termékenyítő anyagokból a várt arányban születtek a hím és nőnemű utódok (szarvasmarha, nyúl, sertés). A probléma az, hogy az előállítás mennyiségi szempontból korlátozott és az ondósejtek termékenyítőképessége csökken, amelyeknek a gyakorlati igénynek megfelelően még a mélyhűtésen is át kell esniük. A kis Y-kromoszómájú bikák spermája alkalmasabb lehet az elkülönítésre, amelynek arányát még az egyes autoszómák C-sáv polimorfizmusai is befolyásolhatják. Az X- és Y-ondósejtek szortírozására beállított üzemmódban csak azok teljes DNS-tartalmát mérik, így egyes kromoszóma-rendellenességek zavart okozhatnak (a komplex transzlokációt hordozó bika kezeletlen ejakulátumaiban az ondósejtek 75%-át nőivarúnak mérték).

Az áramlásos citometria az egyes normális és abnormális kromoszómák felismerésére és szortírozására is alkalmas. Az így vagy mikromanipulációval izolált identikus kromoszómák és azok részeinek DNS-e PCR-technikával in vitro sokszorosítható és jelölésével specifikus próbák állíthatók elő. A DNS-próbák egy része más fajokon is használható, így a szarvasmarha X- és Y-ondósejtek azonosítására jakból készítettek kettős jelölésű koktélt.

A DNS bizonyított mennyiségi eltérése alapján a kétféle ondósejt között méreteik (térfogat, fejfelület), súlyuk és fajsúlyuk (a DNS nehezebb a fehérjéknél), sebességük és élettartamuk (a nőivarúak lassúbbak lennének, de tovább mozognának) eltéréseit is valószínűsítették.

Feltételezik az Y-hoz kötött (H-Y és más) felületi antigéneket, de ezek specifikus kimutatását, illetve az Y-ondósejtek specifikus immobilizását csak néhány amerikai (USA, Brazília) csoport írta le, eredményeiket máshol nem tudták megerősíteni. Centrifugálással nem értek el eredményt (LINDAHL, FOOTE és mtsai.). Ülepítéssel nyúlon és szarvasmarhán az NSZK-ban (BHATTACHARYA, SCHILLING), az NDK-ban (KNAACK) és Magyarországon (IVÁNCSICS ) 2/3 rész bika, illetve üszőarányt értek el a felső, illetve az alsó frakciók felhasználása után, de az eredmények ismételhetősége bizonytalan volt. SARHADDI, IVÁNCSICS és GERGÁTZ juhokon ennél valamivel kisebb eltérésekről számoltak be.

A bármely módszerrel végzett elkülönítési kísérletek ma már nem csak termékenyítéssel, de áramlásos citometriával, illetve az X-, illetve Y-kromoszómákra specifikus fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) is ellenőrizhetők. A két ivari kromoszóma együttes FISH-jelöléséről szarvasmarhán elsőként 1998-ban egy hazánkban tartott konferencián számoltak be (HAS-SANANE és mtsai.).

RÉVAY és mtsai. a módszert élő/elhalt és akroszóma festéssel kombinálva kidolgozták a spermiumok ivararányának és minőségének együttes ellenőrzését (6.10. ábra). A keneteken az élő X-és Y-bikaondósejtek fejfelületében nem találtak eltérést.

6.10. ábra - Az X- és Y-kromoszómák felismerése bikaondósejtekben fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH). (RÉVAY és mtsai., 2001)

kepek/6.10.abra.png


Az embriószexálásban a kromoszómavizsgálatok (hagyományos preparálás és FISH) háttérbe szorultak, mert a PCR-nél drágábbak és lassúbbak, több sejtet igényelnek, és értékelési arányuk is alacsonyabb.

A kromoszómavizsgálatok döntőjelentőségűek a mesterségesen létrehozott különböző XX/XY, illetve fajkimérák ellenőrzésében. Tarkowski 8-sejtes embriók fúziójával XX/XY egereket hozott létre, amelyek hímek voltak és ondósejtjeik az XY-sejtvonalból származtak. Kimérákat már sejtvonalakból is létrehoztak. NAGY ANDRÁS csoportja Torontóban a kétsejtes egérembriókat két sejtjük elektrofúziójával tetraploidizálta, így azok sejtjei később csak az extraembrionális szövetek (placenta) kialakulásában vehettek részt és az utódok a világon először a bevitt tenyésztett diploid sejtekből születtek. Alacsonyabb rendű állatokban a növényekhez hasonlóan olyan változások is indukálhatók, amelyek emlősökben és madarakban azok életével vagy szaporodásával összeegyeztethetetlenek.

A triploid halak (lazac, tilápia) és kagylók (ausztráliai osztriga) termelése meghaladja a diploidokét. Hazánkban a világon elsőként hoztak létre hormonkezeléssel olyan termékeny 2n, XX hím pontyot, amelynek minden utóda nőstény lett. Ennek gyakorlati jelentősége lehet, mert a nőstények ivarérése később következik be, így súlygyarapodásuk kedvezőbb.