Ugrás a tartalomhoz

Általános állattenyésztés

Bodó Imre, Dinnyés András , Farkasné Bali Papp Ágnes, Fésüs László, Hidas András, Holló István, Horvainé Szabó Mária, Komlósi István, Kovács András, Lengyel Attila, Mihók Sándor , Nagy Nándor, Polgár J. Péter, Szabó Ferenc , Szabóné Willin Erzsébet, Tőzsér János

Mezőgazda Kiadó

Molekuláris genetikai markerek

Molekuláris genetikai markerek

A rekombináns DNS-módszerek megjelenésével nagyszámú DNS-polimorfizmust fedeztek fel, amelyek markerként használhatók. A DNS-markerek a hagyományos markereknél hatékonyabban alkalmazhatók mivel nagyobb számban állnak rendelkezésre és kiterjedt polimorfizmust mutatnak.

A DNS-markerkutatások nagymértékben felgyorsultak az ún. polimeráz láncreakció (PCR) felfedezése nyomán (MULLIS és FALOONA, 1987). A módszerrel egy adott DNS-szakasz in vitro sokszorosítható, a kiválasztott DNS-szekvenciájával megegyező másolatok képződnek.

A legáltalánosabban használatos molekuláris genetikai (DNS) markerek a mikroszatellitek. Meghatározásuk annak a néhány bázispár ismétlődésének számbeli változékonyságán alapul, amelyek két, csak egy-egy adott genomrészletre jellemző szekvenciarészlet között helyezkednek el (a mikroszatelliteket szokásos II. típusú markereknek nevezni).

Az I. típusú markerekről vagy direkt géntesztekről azokban az esetekben beszélünk, amikor egy adott gén kromoszómán belüli helye pontosan ismert, a megfelelő DNS-szakasz, izolálható, klónozható, illetve szekvenálható.

A DNS-markerek segítségével a korábbinál hatékonyabb szelekció végezhető, a különféle megközelítések összefoglaló megjelölése a markerek segítségével végzett szelekció (marker assisted selection, MAS).

A molekuláris genetikai markervizsgálatok alkalmazása az állattenyésztésben

Direkt géntesztek (I. típusú markerek)

A direkt géntesztek bármely testszövetből izolált DNS-ből elvégezhetők, azonnal az állat megszületése után (ha kell magzatból vagy embrióból is), bármely ivar esetében.

E vizsgálatok különleges értéke abban áll, hogy nagyon korán nyújtanak információt a szelekció számára.

Az alkalmazási lehetőséget egy konkrét példán keresztül mutatjuk be.

Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (BLAD). Egy autoszomális gén recesszív mutációja által kiváltott öröklődő betegség. A beteg borjakban károsodik a fertőzésekkel szembeni védekező mechanizmus. Különbséget tudunk tenni a normális (TL) és a receszív mutáns allélt hordozó (BL) egyedek között.

A mutációt homozigóta formában hordozó egyedeknél a fehérvérsejtek fertőzés esetén nem tudnak átjutni az érfalon a gyulladásos szövetekbe. A BLAD tehát az immunrendszer elégtelen működését eredményezi, nem fertőző, örökletes hátterű betegség.

A BLAD homozigóta állapot letális. Ha egy tehenészetben fertőzőbetegség üti fel a fejét, a receszív mutáns BLAD allélra homozigóta borjak az elsők között hullanak el. Szélsőséges esetben a BLAD homozigóta borjak a szervezetükben jelenlévő és normális körülmények között problémát nem okozó mikroorganizmusoktól is megbetegedhetnek és elpusztulhatnak.

A BLAD beteg borjak többsége egyéves kor elérése előtt elhullik, ismétlődő gyulladásos megbetegedések következtében. Némelyek akár kétéves korukig is életben maradhatnak, de a fejlődésben visszamaradottak és szervezetükben állandósulnak a gyulladásos folyamatok. A legtöbb esetben a BLAD diagnosztizálására nem kerül sor, csupán a kártétel nyilvánvaló.

A beteg vagy BL egyedek mind az Osborndale Ivanhoe nevű bikával vagy annak leszármazottjaival álltak rokonságban. A PCR-RFLP génteszt (lásd később) birtokában az USA-ban megvizsgálták az 1952-ben született Osborndale Ivanhoe és néhány, vele rokonságban álló mesterséges termékenyítő elit holstein-fríz bika spermiumeredetű DNS-mintáit (mélyhűtött ondóból) és azokat BL típusúnak találták. Azt, hogy a pontmutáció az Osborndale Ivanhoe-ban vagy valamelyik ősében következett-e be, talán sohasem fogjuk megtudni.

A mutáns BLAD allél világméretű gyors elterjedését az okozta, hogy a nagy tejhozamot örökítő heterozigóta elit bikákat, illetve ivadékaikat és a tőlük származó spermát (és embriókat) a világ szinte valamennyi holstein-fríz és feketetarka állományában széles körben használták.

Ugyanez történt az USA-ban is, ahol holstein-fríz tehenek mintegy 10%-a rokonságban áll az Osborndale Ivanhoe-val vagy vele szorosan rokon elit bikákkal (pl. Penstate Ivanhoe Star és Carlin-M Ivanhoe Bell).

A mutációt hordozó (BL) egyedek az egyes holstein-fríz állományokban eltérő gyakorisággal fordulnak elő (6.5. táblázat).

6.5. táblázat - BL genotípus gyakorisági értékek holstein-fríz-állományokban

Vizsgálati anyag

n

BL (%)

Forrás

Tenyészbikák, USA

2024

14,1

KEHRLI és mtsai., 1992

Tehenek, USA

1553

5,8

KEHRLI és mtsai., 1992

Tenyészbikák, Dánia

108

26,66

JÖRGENSEN és mtsai., 1993

Egyéb bikák, Dánia

147

14,78

JÖRGENSEN és mtsai., 1993

Nőivarú állatok, Dánia

99

46,69

JÖRGENSEN és mtsai., 1993

Tenyészbikák, Lengyelország

205

3,41

GRZYBOWSKI és mtsai., 1994

Holstein-állományok, Németország

263

13,00

DUESMANN és mtsai., 1994

Tenyészbikák, Oroszország

10

0,00

KIRILENKO és GLAZKO, 1995

Holstein-borjak, Franciaország

1,00–6,00

BOICHARD és mtsai., 1995

Tehenek, Franciaország

5,00

BOICHARD és mtsai., 1995

Holstein-állományok, Ukrajna

199

3,01

KOSTETSKIJ és mtsai., 1996

Tenyészbikák, Argentína

104

2,88

POLI és mtsai., 1996

Tehenek, Argentína

950

1,79

POLI és mtsai., 1996

Tenyészbikák, Oroszország

56

0,00

JAKOVLEV és mtsai., 1996


Megjegyzés:

BL egyedeket Japánban (TAJIMA és mtsai., 1993) és Észtországban (LÜPSIK és mtsai., 1995) is találtak, az előfordulási gyakoriságot a szerzők nem közölték.

Tejelő tehenészetekben a választás utáni időszakban bekövetkező borjú elhullások képezik az egyik fő veszteségforrást. A különféle gyulladásos és hasmenéses tünetek igazi kórokozóit az esetek nagy részében nem lehet meghatározni. Holstein-fríz tenyészetekben a háttérben a BLAD jelenléte mindig feltételezhető. A receszív mutáns BLAD allélnek a fajtából történő eltávolítása a rendelkezésre álló gén-teszt birtokában könnyűfeladat. A több kutatócsoport által módosított eredeti PCR-RFLP módszer lehetővé teszi a BL egyedek gyors azonosítását. A BLAD diagnosztikai vizsgálat költsége a tenyészállatok egyedi értékéhez és a BLAD kártétel mértékéhez képest nem magas (6.1. ábra).

6.1. ábra - A BLAD lókusz PCR termékének elektroforetikus elválasztási mintája emésztés után. 1 csatorna: Emésztetlen PCR termék. 2–4 csatorna: Tagl-el emésztett BLAD fragment, homozigóta egyedek normál alléllal. 5. csatorna: Tagl-el emésztett BLAD fragment, heterozigóta terhelt bika. 6. csatorna: 100 bázispár DNS standard

kepek/6.1.abra.png


Mikroszatellitek (II. típusú markerek)

A mikroszatellitek alkalmazásának lehetőségét egy juhtenyésztési példán mutatjuk be.

A callipyge gén (CLPG). 1983-ban egy farmon az Amerikai Egyesült Államok Oklahoma államában született egy rendkívüli izmoltságot mutató dorset fajtájú kosbárány. Az izom hipertrófia különösen a farizmok esetén volt szembetűnő, de kisebb mértékben a hátizmokban is. Amikor a kossal normális izomzatú anyajuhokat termékenyítettek, az izomhipertrófia számos ivadékban kimutatható volt.

Később igazolták ebben egyetlen autoszomális gén szerepét. Az izomhipertrófia kialakításában szerepet játszó gén elnevezése callipyge (calli = (csoda)szép, pyge = far), jelölése CLPG. A gén két allélja a CLPG (mutáns) és a clpg (normális). COCKETT és mtsai. (1994) a CLPG gént a juh 18. kromoszóma telometriás szakaszára (a terminális régióhoz közel) lokalizálták a szarvasmarha 21. kromoszómáján található mikroszatellitek segítségével.

COCKETT és mtsai. (1996) a CLPG gén öröklődését tovább vizsgálva juh és szarvasmarha mikroszatellitek felhasználásával négy genotípus, illetve két fenotípus létezését igazolták:

genotípus

fenotípus

CLPGP/clpgM

(CN)

callipyge

CLPGP/CLPGM

(CC)

normális

clpgP/clpgM

(NN)

 

clpgP/CLPGM

(NC)

 

P = apai allél, M = anyai allél,

C = mutáns allél, N = normális allél

Az anyai (M) mutáns allél (CLPGM) inaktív, jelenlétében az apai mutáns allél (CLPGP) is inaktiválódik. Ez a jelenség a poláris overdominancia.

A feltételezett CLPG gén eddig nem került azonosításra, így I. típusú marker sem áll rendelkezésre a könnyű és gyors in vitro diagnosztizálás céljára (génteszt), ami a gén tenyésztési felhasználását megkönnyítené. A 18. kromoszómán a CLPG gén feltételezett pozíciójához közeleső területen az elmúlt évek során számos szarvasmarha és juh mikroszatellitet lokalizáltak.

Legújabban, az eddigi eredményeket is felhasználva, LIEN és mtsai. (1999) publikálták a juh 18. kromoszóma érintett területének kapcsoltsági térképét, amely magába foglalja a CLPG gént is (6.2. ábra). A bemutatott kapcsoltsági térkép birtokában a CLPG génhordozó juhok azonosíthatók, de nem 100%-os pontossággal. További, a CLPG génhez közelebbi markerekre van szükség a lókusz pontos lokalizálásához és a PCRRFLP génteszt kidolgozásához.

6.2. ábra - A 18. juhkromoszóma callipyge szakaszának kapcsoltsági térképe. A térképen hat mikroszatellit lókusz látható (LIEN és mtsai. nyomán, 1998)

kepek/6.2.abra.png


A far és a hosszú hátizom hipertrófiája eredményeként a callipyge fenotípussal rendelkező juhok hústermelési mutatói lényegesen jobbak, mint normális társaiké.

Callipyge fenotípusú bárányok vágott testében a combizmok mennyisége átlagosan mintegy 15%-kal, a karaj és lapocka mennyisége pedig mintegy 5, illetve 3%-kal nagyobb. A vágott felek zsírtartalma kb. 4 százalékkal kisebb. A vágási hozam átlagosan 5%-kal jobb.

QTL-vizsgálatok

Haszonállatainkban a hagyományos szelekciós eljárásokkal évente 1–3% genetikai előrehaladás érhető el. A hagyományos szelekcióeljárások alkalmazásának számos biológiai korlátja van, egyes tulajdonságok csak az egyik ivarban vagy bizonyos életkorban mérhetők, gyakran igen költséges módszerekkel.

A genetikai markerek viszont bármely ivarban és életkorban meghatározhatók, nem befolyásolja azokat a környezet és bármikor azonosíthatók. Minél közelebb van a marker a teljesítményt meghatározó génekhez (QTL, quantitative trait loci), annál kisebb a rekombináció esélye.

A genom kapcsoltsági térképek képezik a marker használat alapját (Marker Assisted Selection, MAS). A kishatású gének térképezése igen bonyolult, így jelenleg valószínűtlennek tűnik, hogy a hagyományos szelekciót a MAS teljes mértékben felváltja.

Napjainkban szinte valamennyi haszonállatfajban folynak kiterjedt QTL-vizsgálatok. Számos bíztató kezdeti eredmény született, elsősorban szarvasmarha és sertés esetén, de általános érvényű, minden populációban egyaránt érvényes összefüggéseket nem írtak le.

A kapott marker-QTL kapcsolatok általában család, vonal vagy állomány specifikusnak bizonyultak. Ennek az lehet a magyarázata, hogy az ún. egygénes tulajdonságok vizsgálatával szemben a QTL vizsgálatokban egy olyan DNS szakasz markerét keressük, amely egynél több olyan gént tartalmaz, amelyek egy adott termelési tulajdonságot alakítanak ki.

A molekuláris genetikai vizsgálatok egyéb alkalmazási területei

A vércsoportokhoz és a biokémiai polimorfizmusokhoz képest, a DNS-markerek rendkívül nagy számuk és az egyes lókuszok kifejezettebb polimorfizmusa miatt, magasabb szinten és hatékonyabban alkalmazhatók az állattenyésztés számos területén:

• populációk genetikai szerkezetének vizsgálata,

• beltenyésztett vonalak homozigozitásának vizsgálata,

• populációk beltenyésztettségének becslése,

• őshonos (génrezerv) állományok fenntartása,

• származás-ellenőrzés,

• állományok és fajták közötti genetikai távolság becslése,

• keresztezési programok (heterózistenyésztés) tervezése,

• állateltulajdonítási peres ügyek tisztázása.

Egy speciális alkalmazási területről külön kell szólni, ez a markerek segítségével történő génátvitel (marker-assisted introgression, MIS). Markerrel rendelkező ismert hatású gének, MIS segítségével, gyorsabban átvihetők egyik fajtából, állományból vagy vonalból a másikba.

Szabadalom és licencproblémák

A molekuláris genetikai (DNS) markerek, ha azok gazdaságilag fontos tulajdonságot érintenek, csaknem mindig szabadalmi bejelentés alá kerültek vagy kerülnek. A szabadalmi oltalom nemcsak a géndiagnosztikai vizsgálatok elvégzésére vonatkozik, hanem keresik annak lehetőségét is, hogy az ilyen szelekció eredményeként született állatok után licencdíjat állapítsanak meg.

A fentiek értelmében, a MAS-t alkalmazó programokban, számolni kell az esetenkénti magas licencdíjakkal is. Ez az oka, hogy a kutatók állandó sürgetése ellenére, sok tenyésztési programban a MAS nem kerül alkalmazásra. A genomelemzés, messze nyúló jelentősége miatt, az állattenyésztésben minden bizonnyal nemzetközi méretű, széles körű átrendeződést fog eredményezni. Ennek alkalmazásából hazánknak sem szabad kimaradni.

Lehetséges, hogy a MAS-t nem alkalmazók átmenetileg mentesülnek a nagynak tűnő kiadásoktól, később viszont sokkal többet kell fizetniük, a MAS segítségével mások által előállított kimagasló értékű tenyészállatokért, illetve az azoktól származó spermáért és embriókért.