Ugrás a tartalomhoz

Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia

dr. Medveczky István, dr. Rusvai Miklós, dr. Varga János, dr. Tuboly Sándor

Mezőgazda Kiadó

3. fejezet - Virológia

3. fejezet - Virológia

Általános virológia

A vírus fogalma

A vírusok a mikroorganizmusok sajátos csoportját alkotják. Felépítésük, szaporodásmódjuk alapvetően eltér a többi élőlényétől. Általában kisebbek, mint a többi mikroorganizmusok, méretük vírustípustól függően 20–300 nanométer (nm) között van. Mivel nagyságuk a fénymikroszkóp feloldóképességének határa alatt van, csak elektronmikroszkóppal láthatók. Nevüket is egy tudományos tévedésnek köszönhetik: mivel kicsiny méretükből adódóan áthatolnak a baktérium-visszatartó szűrőkön, kezdetben toxinnak vélték őket (virus: méreg lat.); korpuszkuláris természetük csak később igazolódott. Manapság a szűrhetőség már nem tekinthető a vírusok jellemző tulajdonságának, egyrészt mivel kiderült, hogy vannak baktériumok is, amelyek a baktériumszűrőkön átjutnak (pl. a mycoplasmák), másrészt mivel napjainkban már olyan kis pórusméretű szűrők is előállíthatók, amelyeken a vírusok is fennakadnak.

A vírusok jellemzése a fertőzőképes víruspartikula, a virion tulajdonságai alapján történik. A vírus (virion) a magasabbrendű, sejtes élőlényektől az alábbi tulajdonságokban tér el:

• csak egyféle nukleinsavat (RNS-t vagy DNS-t) tartalmaz. Ezek víruscsaládtól függően szimpla szálú vagy dupla szálú formában egyaránt előfordulhatnak. A genetikai információ hordozója tehát a vírusok esetében egy- és kétszálú DNS, illetve egy- és kétszálú RNS lehet, szemben a magasabb rendű élőlényekkel, amelyekben az információ mindig kétszálú DNS formájában tárolódik.

• Megsokszorozódással szaporodik, növekedni és osztódni nem képes. A vírusoknak ugyanis nincs saját energiaszolgáltató és fehérjeszintetizáló enzimrendszerük, sőt többnyire a nukleinsav replikálódásához szükséges enzimkészletük is hiányos. Ezért a vírusok obligát sejtparaziták: élő sejtekbe jutva a fertőzött sejt enzimrendszerét használják saját szaporodásukhoz, gyakran a sejt saját anyagcseréjének a rovására. A fertőzött sejtek által termelt extracelluláris virion sem növekedésre, sem osztódásra nem képes. A fentiekből következik, hogy a vírusoknak két megjelenési formája van: az egyik, amikor génparazitaként a gazdasejt biokémiai folyamataiba beavatkoznak (ebben az állapotban vegetatív vírusnak nevezzük őket), a másik pedig az e folyamatok révén létrejött, a gazdasejttől független fertőző részecske a virion. Egyetlen virion 103–106 utódvirion előállítását is indukálhatja egy sejten belül, ezt a szaporodási módot ezért megsokszorozódásnak (vírusmultiplikációnak) is nevezzük.

A vírusok igen széles körben elterjedtek: izoláltak már vírusokat baktériumokból, gombákból, protozoonokból, növényekből és az állatvilág minden csoportjából a puhatestűektől az ízeltlábúakon át a gerincesekig. Állatorvosi szempontból a halakat, madarakat és emlősöket megbetegítő vírusok a legfontosabbak (ilyenek pl. a pontyok tavaszi hasvízkórjának, a baromfipestisnek, a ragadós száj- és körömfájásnak, a veszettségnek a vírusa stb.). Ugyanakkor azt is tudnunk kell, hogy a vírusok többsége nem okoz betegséget (ezek az ún. orphan vírusok) csakúgy, mint ahogy a baktériumok túlnyomó többsége is apathogen. Jelen tudásunk szerint azonban hasznos vírusok nincsenek (szemben pl. az élelmiszeriparban használt baktériumokkal vagy az emésztésben fontos szerepet betöltő bélbaktériumokkal).

A vírusok eredete

A vírusok eredete jelenleg még tisztázatlan, de valószínű, hogy a vírusok többféle módon alakultak ki.

A bonyolultabb felépítésű vírusok (pl. poxvirusok) a sejt degradációja révén alakulhattak ki: a parazita sejt annyira leegyszerűsödött, hogy elveszítette önállóságát. Élettelen környezetben nem képes szaporodni: információt tárol, de annak átadására csak élő sejtbe jutva képes.

Az egyszerűbb vírusok a sejt valamelyik, genetikai utasítást hordozó részéből alakulhattak ki, így pl. az RNS tartalmú vírusok egy része mRNS molekulákból, az egyszerűbb DNS-vírusok kromoszómatöredékekből stb. Ez az elmélet nem magyarázza a szimpla szálú DNS-t, a dupla szálú RNS-t és a negatív irányítottságú szimpla szálú RNS-t tartalmazó vírusok eredetét, mivel ilyen nukleinsav- formációk a sejtben nem fordulnak elő. (Ez a vírus szempontjából nagy előny, hiszen így a fertőzött sejt megfelelő enzimek híján nem tudja a vírust lebontani.) Feltételezik, hogy ezek más vírusok nukleinsav-replikációs folyamatának köztes termékei, vagy ma már nem létező élőlények sejtjeiből származnak.

A gazdasejtek és az azokat fertőző vírusok nukleinsavának szerkezete (riboszómakötő helyek száma, egyes génszakaszok bázissorrendje stb.) között felismerhető hasonlóság is támogatja a fenti elképzelést, vagyis azt, hogy a vírusok különböző módon, de a szaporodásukat segítő sejtekből származnak.

A vírusok szaporítása

A vírusok okozta fertőző betegségek kórjelzéséhez (vírusdiagnosztika), a vírusok tulajdonságainak vizsgálatához (vírusanalitika) és az oltóanyag-termeléshez stb. szükség van a vírusok mesterséges elszaporítására. Mivel e kórokozók obligát sejtparaziták, a vírusszaporítás csak élő sejtekben történhet. Erre a célra mesterségesen fertőzött kísérleti állatok, embrionált tojások és in vitro sejttenyészetek használhatók.

Vírusok szaporítása kísérleti állatokban

Napjainkban elsősorban állatvédelmi, de gazdaságossági és szakmai szempontok miatt is ez a módszer szinte teljesen kiszorult a vírusok szaporításának eljárásai közül. Kísérleti, diagnosztikai és oltóanyag-ellenőrzési célból jelenleg is rendszeresen végeznek kísérleti állatoltásokat, de ezekben az esetekben a vírus elszaporítása nem cél, hanem csak eszköz a szükséges eredmények elérése érdekében. Jelenleg Magyarországon vírustermelés céljából csak két, más módszerrel még nem szaporítható vírust, a nyulak haemorrhagiás betegségének vírusát és a sertéspestis elleni immunizálásra használt vakcinavírus-törzset szaporítják ily módon (mindkettőt nyulakban).

Vírusok szaporítása embrionált tyúktojásban

Embrionált tyúktojásokat (56. ábra) főleg korábban, a szövettenyészetek széleskörű elterjedése előtt alkalmaztak vírusszaporítás céljából, de ez a technika még ma is rendszeresen használatos a virológiai munkálatok során bizonyos vírusok izolálása és vakcinatermelés céljából egyaránt.

56. ábra - Vírusok szaporítása embrionált tyúktojásban. Az embrionált tyúktojás szerkezetének és a choroallatois hártyára történő oltásnak a sematikus rajza

kepek/56abra.png


A szikhólyag fala, a chorioallantois- és az amnionhártya, valamint maga a csirkeembrió olyan szövetekből épül fel, amelyek egyes vírusok elszaporítására alkalmasak. Tojásban való vírusszaporításhoz lehetőleg SPF (Specific Pathogen Free-specifikus kórokozóktól mentes) állományból származó, fehér héjú, jól átvilágítható tojásokat célszerű alkalmazni. A tojásoltás munkafázisai a következők:

• lámpázással meggyőződünk arról, hogy az embrió él-e, megfelelő fejlettségi stádiumban van-e, és megközelítő helyeződéséről is tájékozódunk; ez segítséget nyújt az oltás irányának és mélységének helyes megválasztásához,

• mivel a tojáshéj mikroorganizmusokkal szennyezett lehet, a tojás héját az oltás területén fertőtleníteni kell (pl. jódtinktúrával).

A tojáshéj átfúrása oltólándzsával vagy vastag injekciós tűvel történik. Amennyiben nagyobb héjdarab eltávolítása szükséges, akkor fogászati fúróval vágjuk körül a megfelelő nagyságú területet.

A tojás oltása többféleképpen történhet, mivel a különféle vírusok az embrionált tyúktojás különböző részeiben találják meg a szaporodásukhoz legjobban megfelelő környezetet. A különböző oltásokhoz eltérő ideig keltetett tojásokat használunk:

• Chorioallantois-hártyára történő oltáshoz 10–13 napos tojás alkalmas. Ez a módszer alkalmazható pl. poxvirusok vagy herpesvirusok szaporítására. A vírus elszaporodását a membránon jelentkező diffúz homály vagy göb (pock) jelzi. A göbök morfológiája (a pock nagysága, esetleges gyulladásos kísérőtünetek, vérzéses vagy elhalásos jellege stb.) egyes vírusok esetében jellemző eltéréseket mutat (pl. a tehénhimlő vírusa vérzéses, a tyúkhimlő vírusa kezdetben proliferatív, majd necrotisaló pockokat képez).

• Allantoisüregbe és amnionüregbe történő oltáshoz 9–12 napig keltetett tojásokat használunk. Ily módon szaporíthatók pl. az influenzavirusok, a baromfipestis, és a fertőző bronchitis vírusa. A vírus először az üreget határoló membrán sejtjeiben szaporodik, később bejut az embrióba is. Az allantois- vagy amnionfolyadékba kiszabaduló, hemagglutináló tulajdonságú vírusok jelenléte hemagglutinációs próbával bizonyítható.

• Szikzsákba történő oltásra az 5–7 napig keltetett tojások alkalmasak, így szaporítható pl. a csirkék fertőző agy- és gerincvelő-gyulladásának vírusa. (Ezzel a módszerrel chlamydiák, rickettsiák is tenyészthetők.)

• Viszonylag ritkán alkalmazzák (pl. a bluetongue vírusának szaporítására) az intravénás tojásoltást, ilyenkor a tojáshéj alatt futó nagy erek valamelyikébe juttatjuk a vizsgálati anyagot.

A tojáshéjon ejtett nyílást, a fertőződés elkerülése érdekében, általában olvasztott paraffinnal lezárjuk.

Ezután az oltott tojásokat inkubáljuk, vagyis visszahelyezzük a keltetőgépbe, és tovább keltetjük. A továbbiakban az embriókat naponta lámpázással ellenőrizzük. Ha jelentkeznek az egyes vírusokra jellemző elváltozások vagy az embrió elpusztul, akkor a tojásokat felbontjuk és a kialakult tünetek (pl. törpenövés, torzfejlődés), vagy a tojásfolyadékok hemagglutinációja alapján győződhetünk meg a vírusszaporítás eredményességéről. (Ha az oltást követő első napon belül pusztulnak el az embriók, az mechanikai sérülés vagy szennyeződés következményének tekinthető.)

Vírusok szaporítása sejt- és szövettenyészetekben

A virológia fejlődésében fordulópontot jelentett az in vitro sejttenyésztési technika kidolgozása. Szövettenyészeteket vagy sejtkultúrákat akkor kapunk, ha a szervezetből frissen kivett szervek apró darabkáit vagy azok különálló sejtjeit in vitro körülmények között életben tartjuk és szaporítjuk. A szövettenyésztési technika rutinszerű alkalmazása akkor vált lehetővé, amikor az antibiotikumok és a gombaellenes szerek már rendelkezésre álltak a baktériumok, valamint a gombák elszaporodásának megakadályozására.

A kezdeti kultúrák éles ollóval vagy szikével apróra vágott túlélő szervdarabok voltak (pl. Carrel-féle explantált tenyészet). Ezeket embriókivonat és tyúkplazma keverékével az üvegedény felületére ragasztották, tápfolyadékkal fedték és így tartották életben. Túlélő szervdarabkákat vakcinatermelésre is használtak. Így pl. a ragadós száj- és körömfájás elleni vakcina készítésére használják az ún. Frenkel-módszert. Ehhez nagyméretű keverőtartályokban szarvasmarha-nyelvhám darabkákat tartanak életben tápfolyadék segítségével, és ezekben szaporítják a vírust.

A virológiai technikában jelenleg legkiterjedtebben az egyrétegű sejttenyészet használatos. A módszer lényege, hogy sterilen kivett szervek apróra vágott darabjait híg tripszinoldatban emésztjük (57. ábra). Ha az enzimkezelés kíméletes, akkor a sejtek elválnak egymástól anélkül, hogy károsodnának. Így az emésztés során sejtszuszpenziót kapunk, amelyet a tripszinhatás felfüggesztése céljából jéggel hűtött edényben gyűjtünk, majd kíméletesen centrifugálunk. A tripszinoldatot leöntjük, és a leülepedett sejteket előzetes sejtszámolás után tápfolyadékban reszuszpendáljuk, amely a szaporodásukhoz szükséges anyagokat tartalmazza. A tenyésztésre szánt sejtszuszpenzió sűrűségét általában 200–300 000 sejt/ml értékre állítjuk be. A tápfolyadék különféle sók (szükség esetén aminosavakkal gazdagított) pufferolt oldatából áll (pl. Hank’s MEM, RPMI 1640), amely fehérjeforrásként 5–15% borjúsavót is tartalmaz. A baktériumok és gombák szaporodásának megakadályozása érdekében a tápfolyadékot antibiotikumokkal és antimycotikumokkal egészítjük ki. A sejtszuszpenziót különféle steril edényekbe (Roux-palackba, kémcsőbe, Petri-csészébe stb.) adagoljuk, és a tenyészeteket 37°C-os termosztátban inkubáljuk. Néhány órán belül a sejtek az üvegre tapadnak és megkezdődik szaporodásuk. A szomszédos sejtek hártyájának érintkezése kiváltja az ún. kontakt gátlást, és a sejtszaporodás leáll, ezért az ép, egészséges sejtek a felületen egyetlen rétegben szaporodnak addig, míg egymással összeérnek. Így egyrétegű sejttenyészetet kapunk, amely egyenletesen bevonja az üvegedény falát, és így a sejtek állapota kis nagyítású mikroszkóppal ellenőrizhető. Ekkor a tápfolyadékot ún. fenntartó folyadékra (pl. Earle’s MEM) cseréljük, amely tápanyagokban szegényebb, csupán a sejtek életben tartását szolgálja.

57. ábra - Egyrétegű sejttenyészet készítése

kepek/57abra.png


Az állati szervdarabkákból ily módon közvetlenül előállított tenyészeteket nevezzük elsődleges vagy primer kultúráknak. Primer tenyészetek szinte minden faj számos szervéből készíthetők, de legalkalmasabbak a hámsejtekben gazdag szervek (vese, here, pajzsmirigy stb.). Minden vírus esetében ismernünk kell annak sejtspektrumát, vagyis azokat a sejttenyészet-féleségeket, amelyekben az adott vírus szaporodni képes. Ekkor nem csupán az állat faját, hanem a szervet is figyelembe kell venni, amelyből a tenyészetet készítjük. Általánosságban azok a szervek a legalkalmasabbak egy adott vírus szaporítására, amelyekben az in vivo körülmények között is szaporodik. Sikerrel használhatunk azonban más szerveket is, pl. sok faj vesetenyészete egész sor vírus szaporítására alkalmas. Vírusizoláláskor (lásd később) mindenképpen ajánlatos különböző tenyészetek párhuzamos oltása, mivel egy adott faj különböző szerveiből származó sejteknek a fogékonysága eltérő lehet (pl. az I. és II. alcsoportba tartozó bovin adenovirusok szaporíthatósága borjúvese-, illetve borjúhere-tenyészetekben).

Ugyancsak a vírusizolálás esélyeit növeli az ún. kokultúrák alkalmazása is. Ilyenkor a fertőzésre gyanús állatból származó szerv darabkáit egészséges állatból származó szervdarabkákkal együtt emésztjük tripszinoldattal, így olyan sejttenyészetet kapunk, amely vírussal fertőzött és egészséges sejteket egyaránt tartalmaz. Más esetekben a fertőzött állatból származó szervdarabokat vagy perifériás fehérvérsejtek szuszpenzióját adják a sejttenyészethez. Az eljárás lényege az, hogy a fertőzött sejtekben termelődő víruspartikulák elszaporodására a közvetlen környezetben fogékony sejtek állnak rendelkezésre.

A primer kultúrákat vagy közvetlenül felhasználjuk, tehát vírussal oltjuk, vagy másodlagos kultúrákat (szubkultúrákat) készíthetünk belőlük. Az utóbbi esetben a primer kultúra sejtjeit az üveg faláról tripszinnel „leemésztjük”, centrifugáljuk, majd újabb tápfolyadékban reszuszpendálva újabb üvegedényekbe adagoljuk, melyek falán a sejtek pár nap alatt ismét egyrétegű tenyészetet alkotnak. A másodlagos tenyészetnek számos előnye van, pl. az, hogy ily módon egy szervből kiindulva a sejtek ismételt „leemésztésével” és szaporításával (további „szubkultúrázásokkal”) heteken át friss sejttenyészetek birtokába jutunk. Ezáltal egyrészt a tenyészetek mennyiségét növelhetjük, másrészt a szubkultúrák általában minőségileg is jobbak, simább, egyöntetűbb réteget alkotnak. A primer (és szekunder) sejttenyészetek előnye, hogy általában fogékonyabbak a vírusfertőzésre, mint a többszörösen passzált sejtek, hátrányuk viszont az lehet, hogy eleve fertőzve lehetnek valamilyen vírussal vagy mycoplasmával, amellyel a szervet szolgáltató állat fertőzve volt. Ezért igényesebb munkák céljára csíramentes (gnotobiotikus) vagy legalább SPF állatok szerveit használják szövettenyészetek készítésére. A sejttenyészet fentiekben ismertetett, ismételt átoltásával (passzálásával), szaporításával permanens tenyészetek vagy sejtvonalak nyerhetők. A feladat azonban általában nem ilyen egyszerű. A tenyészetek zöme ugyanis néhány átoltás után elveszti eredeti jellegét, pl. a fibroblast jellegű sejtek előbb-utóbb túlnövik a hám jellegűeket. A vírusok zömének ez nem kedvez, a tenyészet egyre kevésbé alkalmas a vírusok szaporítására. Ezért permanens sejtvonalakat általában sejtklónozással állítanak elő. Ehhez egyetlen sejt utódait igyekeznek izolálni. Sikeres izolálás esetén így genetikailag homogén sejtpopulációt nyernek (58. ábra). E sejtek utódai nem csupán egyöntetűek, hanem szaporodóképességük is megfelelő. Ma már a virológiában nagyon sok permanens sejtvonalat használunk. Közülük számos állati eredetű. Ilyenek pl. a PK–l5 (sertésvese-) és az MDBK (borjúvese-) sejtvonalak.

58. ábra - Sejtklónozás

kepek/58abra.png


A sejtvonalak használata lényegesen kényelmesebb, mint a primer és szekunder kultúráké, mert nem kell állandóan friss szervekről gondoskodni és azokat feldolgozni. Ezért a vakcinakészítéshez szükséges vírusszuszpenzió egy részét is sejtvonalakon készítik. Számos előnyük mellett a sejtvonalaknak több hátrányos tulajdonságuk is lehet, pl. kevésbé fogékonyak bizonyos vírusfertőzésekre és így kevésbé alkalmasak a vírusok izolálására, másrészt eredetileg fertőzöttek lehetnek valamilyen, esetleg onkogén vírussal. (Permanens tenyészetek ugyanis viszonylag egyszerűen állíthatók elő daganatos szövetekből, ilyen többek között a méhszájdaganatból előállított HeLa sejtvonal vagy a hörcsögvesetumorból származó BHK–21 sejtvonal.) Mindez egyrészt közvetlenül veszélyes lehet (élővírusos vakcinák készítéskor), másrészt pedig tovább ronthatja a sejtvonal érzékenységét a szaporításra szánt vírussal szemben.

A sejtvonalak használatát megkönnyíti, hogy azok mélyhűtve tárolhatók, vagyis a sejtek folyékony nitrogénben akár évekig is megőrzik életképességüket.

A nagy szaporodóképességű sejtvonalak lehetővé teszik, hogy ma tömegtermelés céljára az ún. szuszpenziós tenyészeteket használjuk. Ennek lényege, hogy a sejteket nem hagyjuk letapadni az edény falára, hanem állandó keveréssel szuszpenzióban tartjuk azokat. Így lényegesen több sejtet tudunk adott méretű tankokban fenntartani, anyag-, energia- és helytakarékossággal erőteljesen növelhetjük a vírustermelés gazdaságosságát. A módszert üzemi méretekben többek között a ragadós száj- és körömfájás vakcinájának készítésére használják. Előfordulhat, hogy olyan sejteket kell nagy tömegben elszaporítanunk, amelyek csak szilárd felületre tapadva képesek osztódni és életben maradni. Ilyenkor alkalmazzuk az ún. mikrokarrier tenyészetet, amelynek lényege az, hogy a sejteket apró műanyag golyócskák (pl. Cytodex) felületére hagyjuk tapadni, majd ezeket a golyócskákat tartjuk szuszpenzióban, állandó keveréssel.

A vírusok tisztítása és koncentrálása

A vírusok szerkezetének és molekuláris összetevőinek vizsgálata legtöbbször a különböző vírusszaporítási eljárásokkal nagy mennyiségben előállított, majd megfelelő módszerekkel tisztított és koncentrált vírusszuszpenzió felhasználásával történik. A vírusanalitikai vizsgálatoknak mindig mikrobiológiailag tiszta, más vírusokkal vagy baktériumokkal nem szennyezett vírusszuszpenzióból kell kiindulniuk, szemben a víruskimutatás céljára történő vizsgálatokkal (lásd később).

Az alkalmazható tisztítási és koncentrálási eljárásokat alapvetően a kérdéses vírus kémiai és fizikai ellenálló képessége határozza meg.

Az első lépés rendszerint a sejtekben lévő virionok kiszabadítása a szuszpenzió ismételt lefagyasztása majd felolvasztása útján, mechanikai homogenizálással, ultrahangos kezeléssel vagy kémiai anyagok (pl. detergensek) segítségével. A szuszpenziót ezután alacsony fordulatszámon (3000–5000 g) centrifugáljuk. Ilyen nehézségi erő mellett a sejttörmelék leülepszik, a virionok pedig a felülúszóban maradnak, és így elkülöníthetők az üledéktől. A vírustartalmú folyadék tovább is tisztítható szűrők segítségével, amelyekkel a visszamaradt és a kérdéses vírusnál nagyobb részecskék kiszűrhetők. Az előbbiek szerint előkészített vírusszuszpenzió általában túl híg, ezért a továbbiakban a víruskoncentrálás valamelyik módszerét kell alkalmaznunk.

A legegyszerűbb, de a legkevésbé kíméletes eljárás az, ha a virionokat a szuszpenzióból alkohollal vagy ammónium-szulfáttal kicsapatjuk, majd kisebb mennyiségű pufferoldatban reszuszpendáljuk.

Ugyancsak célravezető lehet, ha a virionokat valamely felülethez adszorbeáltatjuk, majd kisebb térfogatban eluáljuk. Erre legalkalmasabb az affinitás kromatográfiás eljárás: az adott virionra specifikus ellenanyagokkal konjugált műanyag gél oszlopokon átbocsátjuk a vírusszuszpenziót, amelyből a szilárd fázishoz kötött ellenanyagok megkötik a virionokat. Megfelelő pufferoldat alkalmazásával az antigén-ellenanyag kötődés bontható, ily módon a virionok az oszlopról leoldhatók (59. ábra). Az alumínium-hidroxidgél vagy a kalcium-foszfát szemcsék spontán módon is megkötik a virionokat (ez a kötődés azonban nem specifikus, mint az affinitás kromatográfiás eljárásnál), majd megfelelő pH-érték mellett azok kisebb térfogatú oldatban eluálhatók. A vörösvérsejtekhez spontán kötődő (hemagglutináló) vírusokat e tulajdonságukat felhasználva is koncentrálhatjuk. Az elúció ez esetben enzim hatására jön létre.

59. ábra - Vírustisztítás és -koncentrálás affinitás kromatográfiás eljárással

kepek/59abra.png


Ultraszűrők alkalmazása esetén a vírustartalmú folyadék olyan csőrendszerben kering, melynek falán meghatározott átmérőjű (a koncentrálni kívánt vírusnál kisebb) pórusok vannak. A csövecskékben nagy nyomás alatt cirkuláló vírusfolyadékból a kisebb molekulák (víz, ionok, kisméretű szerves molekulák) a csövek falán át elhagyják a rendszert, a vírus pedig kis térfogatra besűrűsödve a rendszer belsejében marad. Elvében hasonló, de a túlnyomás helyett az ozmotikus nyomáskülönbséget használja fel a dializálás, amikor is a koncentrálni kívánt vírusszuszpenziót féligáteresztő falú (semipermeabilis) zsákba tesszük, amelyet valamilyen hidrofil anyag (pl. polietilénglikol) hiperozmotikus oldatába helyezzük. A víz és a kis molekulájú anyagok a zsák pórusain át távoznak, a víruspartikulák és a nagy molekulájú anyagok a zsákban koncentrálódnak.

A vírustisztítás és -koncentrálás leggyakrabban alkalmazott, legcélravezetőbb és legkíméletesebb módszere az ultracentrifugálás. E művelet során nagy fordulatszámú, 25–50 ezer g előállítására alkalmas ultracentrifugákat használunk.

A legegyszerűbb ultracentrifugálási művelet a pelletizálás, amikor a vírusszuszpenzióból a részecskéket a centrifugacső aljára ülepítjük. Az eljárás során a szuszpenzióban levő korpuszkuláris szennyező elemek (mitochondriumok, lysosomák, chromosomák stb.) is leülepszenek, ezért ez az eljárás az igényesebb vizsgálatokhoz szükséges tiszta víruspopuláció előállítására nem alkalmas.

Az ún. gradiens ultracentrifugálás esetén a centrifugacsőbe, a vírus úszósűrűsége alapján meghatározott sűrűségű szacharóz- vagy sóoldatot (Cs2SO4, CsCl) mérünk, és erre rétegezzük a vírusszuszpenziót. A centrifugális erő hatására a cukor- vagy sóoldatban koncentrációgradiens alakul ki, vagyis a csőben felül hígabb, lefelé egyre sűrűbb oldatot kapunk. A virionok az úszósűrűségüknek megfelelő rétegben helyezkednek el. Ez az egyensúlyi állapot csak hosszabb ideig tartó centrifugálás eredményeképpen alakul ki, de ez az idő preformált gradiens alkalmazása esetén rövidíthető. Ilyenkor a centrifugálás előtt a centrifugacsőbe változó töménységű (alulra töményebb, majd egyre hígabb) cukor- vagy sóoldatot rétegezünk, és így meggyorsítjuk a koncentrációgradiens kialakulását.

A vírusok a gradiens ultracentrifugálás végén opaleszkáló zónák formájában különülnek el a centrifugacsőben. Ha a vírusszuszpenzió centrifugálása során több csík jelenik meg, akkor ez vagy azt jelenti, hogy többféle vírust tartalmazott a szuszpenzió (hiszen minden vírus a rá jellemző sűrűségű rétegben alkot csíkot), vagy ugyanannak a vírusnak komplett és inkomplett partikulái (lásd később) alkotnak több csíkot. Ez utóbbi esetben az inkomplett virionok alkotják a felső, kisebb úszósűrűségű csíkot, mert belőlük a virion legnehezebb alkotórésze, a nukleinsav részben vagy egészen hiányzik (60. ábra).

60. ábra - Vírustisztítás és -koncentrálás gradiens ultracentrifugálással (inkomplett és komplett virionok)

kepek/60abra.png


A gradiens ultracentrifugálás végén a centrifugacső alját megfúrjuk, és a lassan kicsöpögő szuszpenziót rétegek szerint kémcsövekbe gyűjtjük (frakcionáljuk), vagy a csövek oldalát megfúrva leszívjuk a megfelelő réteget. Az opaleszkáló csíkokat tartalmazó frakciókat elkülönítve koncentrált, tiszta és egységes víruspopulációkat nyerünk. Ezeket a sótól vagy cukortól dializálással megtisztítjuk, majd analitikai módszerekkel vizsgáljuk.

A vírusok morfológiája

Vírusmorfológiai vizsgáló módszerek

A víruspartikula morfológiai sajátosságai csak az elektronmikroszkóp felfedezése után váltak vizsgálhatóvá, noha azt, hogy a vírusok részecske természetűek (nem pedig toxinmolekulák) és e részecskék megközelítő méretét már a különböző pórusméretű szűrőkkel végzett tanulmányok bebizonyították. Az azóta eltelt idő alatt az elektronmikroszkópos technikák fejlődésével számos olyan módszert dolgoztak ki, amelyek alkalmazhatók a virológiai vizsgálatok során is: részben a morfológiai tulajdonságok tanulmányozására, részben diagnosztikai célból.

A vírusmorfológiai vizsgálatok során leggyakrabban a negatívkontraszt- technikát alkalmazzák (61. ábra), melynek lényege, hogy a vírusszuszpenziót foszforvolfrámsav, uranil-acetát vagy más kontrasztanyag oldatával kezeljük, és a mintát elektronmikroszkóp mintafelfogó rácsára (grid) szárítjuk. Ezek az anyagok a fehérjékhez nem kötődnek, ezért száradás közben a részecskék kidomborodó felszíni képleteiről „lefolynak”, a mélyedéseket pedig „kiöntik”. Az üres (inkomplett) virionokba is behatolnak, és kitöltik annak belsejét. Az üregeket, mélyedéseket kitöltő kontrasztanyag, vastagságától függően, eltérő módon szórja, illetve nyeli el az elektronsugarakat, így a vírusok felületéről negatív kontraszt kép nyerhető. E módszerrel a vírusok felszíni struktúrája részletesen tanulmányozható, de ez a módszer használható a tisztított, koncentrált vírusszuszpenziók tisztaságának ellenőrzésére is, a további biokémiai, vírusanalitikai vizsgálatok előtt.

61. ábra - Negatívkontraszt-EM technika

kepek/61abra.png


Az elektronmikroszkópos vizsgálatok egy másik, igen gyakran alkalmazott módja az ultravékony metszetek készítése. A sejteket fixáljuk, speciálisan beágyazzuk, majd ultravékony metszeteket készítünk, és ezeket elektronelnyelő festékekkel (volfrám- vagy urániumsókkal) kezeljük, majd elektronmikroszkóppal vizsgáljuk. E metszetekben a vírusok keresztmetszeti képét és a sejtben a vírusszaporodás során jelentkező változásokat tanulmányozhatjuk.

A vírusárnyékolás módszere ma már ritkábban használatos, de korábban a vírusok (főleg az ún. ikozahedrális virionok) alakjának pontos meghatározása során fontos szerepet játszott (62.ábra). Az eljárás lényege, hogy az elektronmikroszkópos membrán felületén levő mintára oldalirányból, légüres térben, meghatározott szögben arany-, palládium- vagy platinapárát juttatunk elektromos tér segítségével. Ezt különböző szögekből megismételhetjük. Az elektronmikroszkópos készítményen ezután nemcsak a részecske felülnézeti képe, hanem az „árnyék” révén oldalnézeti vetülete is tanulmányozható, ezáltal segítve a részecske alakjának pontosabb megismerését.

62. ábra - Vírusárnyékolás

kepek/62abra.png


Vírusmorfológia

A virionok alakja és nagysága rendkívül változatos, de ennek ellenére felépítésükben közös vonások is megfigyelhetők. A virionpartikula belsejében található a nukleinsav mag (core), melyet az ún. pleomorf vírusok kivételével fehérjékből álló tok (kapszid) vesz körül (63. ábra). A kapszid homológ fehérje építőkövekből, morfológiai egységekből épül fel. Egyes vírusok esetében ezek szorosan kapcsolódnak a nukleinsavszálhoz, ebben az esetben nukleokapszidról beszélünk. Néhány víruscsalád esetében a kapszidot sejt eredetű, lipid természetű, de a vírusgenom által kódolt fehérjeelemeket is tartalmazó burok (peplon, envelop) veszi körül, melyen felületi képletek, nyúlványok (peplomerek) lehetnek.

63. ábra - A virionpartikula (adenovirus) szerkezete. A római számok az egyes struktúrpolipeptidek sorrendjére utalnak a poliakvilamid gélben végzett elektroforézist követően

kepek/63abra.png


Egyes vírusok (pl. a dohánymozaik-vírus) fehérje egységei spontán épülnek össze; ehhez a vírusnak nem kell külön genetikai információt szállítania. A vírusok zömében azonban a virion-összeépülés igen komplikált, számos vírusgén által szabályozott folyamat. A bonyolult összetételű farkos bakteriofágoknál pl. legalább 30 gén irányítja az összeépülést.

A nukleokapszid változatos formákat ölthet, az eltérő alakoknak megfelelően beszélünk a virion szimmetriaviszonyairól. Ennek alapján a következő alapformákat különíthetjük el:

A helikális szimmetria szerint felépülő virionok (64.ábra) kapszidja olyan, mint egy belül üres cső, amelyet spirális vonalban (helikálisan) futó nukleinsavszál mentén rendeződő identikus, protein vagy glükoprotein természetű szerkezeti egységek alkotnak. Ha az egységek közötti kötések azonos erősségűek, akkor a kapszid merev, egyenes (pl. a dohánymozaik betegség virionjában), ha eltérő erősségűek, akkor a kapszid hajlított (orthomyxo-, paramyxo-, rhabdovirusok). E vírusok esetében a hajlékony nukleokapszid felcsavarodik vagy szabálytalan gombolyagot képez és a korábban említett lipid természetű burokkal körülvéve, megközelítőleg gömbölyű képletet alkot. A klasszifikációs érték tehát a nukleokapszidszál átmérője, de a látszólagos vírusméret szemléltetése érdekében általában a burokba zárt víruspartikula átmérőjét szoktuk vírusméretként megadni.

64. ábra - Helikális szimmetriájú virion

kepek/64abra.png


Az ikozahedrális (kubikális, köbös) szerkezetű vírusok ikozahedron (ikozaéder) alakúak. Ezt a téridomot húsz egyenlő oldalú háromszöglap határolja, szimmetriaviszonyait az 65.ábra szemlélteti.

65. ábra - Az ikezahedron képe élközéppontos, lapközéppontos és tengelyszimmetrikus vetületben

kepek/65abra.png


A korábban említett szerkezeti egységek e vírusok kapszidjában az ikozaéder felületének megfelelően rendeződve alakítják ki a kapszidot, a nukleinsav mag (core) ennek belsejében található. A fehérje szerkezeti egységek vírusonként jellegzetes kapszomerekbe rendeződése, csoportosulása határozza meg a víruskapszid jellegzetes képét (66.ábra). A picornavirusok fehérjeegységei pl. 60 trimert képeznek, a parvovirusok esetében 12 pentamert és 20 hexamert alkotnak, a calicivirusok jellegzetes csésze alakú képletekből álló felszínét dimerekbe rendeződött fehérjeegységek alakítják ki.

66. ábra - Kapszomerek felépítése (trimerek, penta- és hexamerek, dimerek)

kepek/66abra.png


Burok megfigyelhető bizonyos ikozahedrális szimmetriájú víruscsaládok esetében is (herpesvirusok, retrovirusok, afrikai sertéspestis vírusa stb.).

A binális szimmetriájú partikulákban az előző két szimmetria alapelemei keverednek. A farkos bakteriofágok (T-fág) teste helikális, tehát cső alakú, és ezen egy hosszirányban kissé megnyúlt ikozahedrális fej ül (67. ábra).

67. ábra - Binális szimmetriájú virion

kepek/67abra.png


A komplex virionok egyik eddig ismertetett szimmetriával sem jellemezhetők, kapszomerek, illetve fehérje alegységek sem figyelhetők meg a szerkezet tanulmányozása során. A hagyományos értelemben vett fehérjekapszid szerepét itt egy bonyolult felépítésű, fehérjéből, glükoproteinekből és lipid természetű anyagokból álló komplex „tok” tölti be. Ez a forma jellemző a poxvirusokra (68.ábra).

68. ábra - Komplex szimmetriájú virion

kepek/68abra.png


A pleomorf vírusoknak szintén nincs hagyományos értelemben vett kapszidjuk, a genetikai információt hordozó nukleinsavat itt kapszid nem, csupán a korábban említett, egyes helikális és ikozahedrális vírusok esetében is megfigyelhető, lipid eredetű burok veszi körül. Ilyen pl. az ún. pleomorf fágok és az arenavirusok felépítése.

A vírusok kémiai összetétele és vizsgáló módszerei

A virion esszenciális alkotórésze a nukleinsav és a fehérje. A burkos és a komplex szerkezetű vírusok ezenkívül lipideket és szénhidrátokat (glükoproteineket) is tartalmaznak.

Nukleinsavak

A vírusok genetikai információja az élővilágban egyedülálló módon nemcsak DNS, hanem RNS formájában is tárolódhat, de minden vírus csak egyféle nukleinsavat tartalmaz. A vírusok genomja általában haploid, kivétel a retrovirusok csoportja, ennek tagjai diploid genommal rendelkeznek. A vírus-DNS vagy -RNS víruscsaládtól függően lehet egyszálú vagy kétszálú, illetve alakja szerint lineáris vagy gyűrűszerűen záródó (cirkuláris). A vírusnukleinsavak molekulatömege a DNS-vírusok esetében 1 és 200 millió, az RNS-vírusok esetében 2 és 16 millió dalton szélső értékek között lehet. A nukleotidok száma meghatározza, hogy adott nukleinsav mennyi információt képes tárolni. Az egy meghatározott fehérje kódolására képes nukleinsavszakaszt a vírusok esetében is génnek nevezzük, és a gén itt is az egy-egy aminosav beépülését kódoló bázishármasokból (tripletekből) épül fel.

A nukleotidsorrend szintén meghatározó a vírusok esetében. Egyes egyszálú RNS-vírusok nukleotidsorrendje olyan, hogy a fertőzött sejt riboszómája közvetlenül le tudja olvasni. Ha óvatos kezelésekkel megtisztítjuk az egyéb vírusalkotóktól, akkor ezeknek az – mRNS-hez hasonlóan 5’–3’ irányban leolvasható – ún. pozitív szálú RNS-vírusoknak (pl. picornavirusok, coronavirusok) a nukleinsava fertőzőképes, vagyis sejtbe juttatva önmagában is megindítja a vírusszaporodás folyamatát. Ezzel szemben a 3’–5’ irányban értelmezhető, ún. negatív szálú RNS-vírusok (pl. orthomyxovirusok, rhabdovirusok) tisztított, fehérjementes nukleinsava nem fertőző, az általa hordozott információ a sejt számára nem hozzáférhető, mivel ilyen nukleinsavak a sejtben nem fordulnak elő, így annak enzimkészlete nem képes a genetikai kód lefordítására. Ehhez szükség van az ilyen vírusok fehérjekészletében megtalálható enzim természetű fehérjékre (RNS dependens RNS polimerázokra) is.

A vírusgenomot a DNS-vírusok és több RNS-víruscsalád esetében egyetlen nukleinsavszál alkotja, de bizonyos RNS-vírusok genomja szegmentált, több (2–12) különálló szálból áll (reo-, birna-, orthomyxovirusok stb.).

A vírusokban esetenként nem vírusspecifikus nukleinsav is kimutatható: a papovavirusokba gyakran a gazdasejt nukleinsavdarabjai is bekerülnek, az arenavirusokba riboszómák (RNS) épülnek be, a retrovirusok onc és src génjeinek egy része is gazdasejt eredetű (lásd később). Ugyanakkor az is gyakori, hogy a vírus-összeépülés során a virionból a nukleinsav részben vagy egészben kimarad (inkomplett vagy defektív partikulák), az ilyen virion fogékony sejtbe jutva természetesen képtelen a szaporodásra.

A vírusnukleinsavak vizsgálata

A vírusgenetikai vizsgálatok kiindulási anyaga a korábbi fejezetben leírtak szerint előállított, tisztított és koncentrált vírusszuszpenzió. A további vizsgálatok során a vírusszuszpenziót proteázokkal, detergensekkel és fenollal (vagy ezek különböző kombinációjával) kezelve a nukleinsavról eltávolítják a fehérjéket.

A kiszabadított, tisztított nukleinsav elektronmikroszkópos vizsgálatával megállapítható, hogy az lineáris vagy cirkuláris szerkezetű.

Enzimemésztési próbákkal meghatározható a nukleinsav fajtája: a DN-áz, illetve RN-áz enzimek csak a megfelelő nukleinsavat emésztik.

A DNS-vírusok genetikai vizsgálata során legelőször általában a vírusgenom fizikális térképezését végzik el. Ekkor a tisztított nukleinsavat restrikciós endonukleázokkal kezelik. Ezek olyan bakteriális eredetű enzimek, melyek a nukleinsavszálon egy adott, 4–7 bázispárból álló szakaszt felismernek, és a DNS-t ezen a ponton hasítják. A vírusgenom így meghatározott számú fragmensre esik szét attól függően, hogy ez a specifikus bázissorrend hány alkalommal fordul elő a DNS-szálon. A nukleinsavfragmenseket ezután agarózgélben elektroforetikusan futtatják. Megfelelő időpontban az elektroforézist leállítják és az agarózlemezt etídium-bromid-oldattal kezelik, így a nukleinsavfragmensek helyeződése láthatóvá válik. A fragmensek kiindulóponttól mért távolsága és azok molekulatömege között fordított az arány, a fragmensek tömege ezért megfelelő molekulatömeg-markerek (ismert tömegű fragmensek) egyidejű futtatásával meghatározható. Részleges enzimemésztéssel (az enzimhatás korai felfüggesztésével) azt is meg lehet állapítani, hogy mely fragmensek helyeződnek egymás mellett (ilyenkor ugyanis nem minden hasítási pontnál vágódik a genom). Így végül minden fragmens nukleinsavszálon elfoglalt helyét meg lehet határozni. Ez a folyamat a genom fizikális térképezése. Mivel jelenleg már több mint 150 restrikciós endonukleáz ismert, a megfelelő enzim kiválasztásával valamely vírus DNS-szála szinte tetszés szerinti helyen hasítható. A vírusok közötti genetikai különbség így kimutatható, mert megfelelő enzim alkalmazása után még közel rokon vírusok esetében is különböző fragmensek képződnek, és ez eltérő DNS-elektroforetogram (DNS-térkép) kialakulásával jár. A vírusok azonosításában és osztályozásában, a járványtani nyomozásban egyre nagyobb szerepet kap a nukleinsav-térképezés (69. ábra).

69. ábra - Vírusnukleinsav-térképezés (dr. Benkő Mária felvétele). Az egyes sávokban restrikciós enzimmel kezelt vírusnukleinsav-fragmensek elektroforetikus képe látható. Az elektroforetogram azonossága a vizsgált vírusminták azonosságát valószínűsíti (pl. az 1. és 3., valamint a 7. és 9. minta

kepek/69abra.png


A vírusgenomból adott nukleinsavszakaszok ún. ragadós végű fragmenseket (70. ábra) produkáló restrikciós enzimekkel kivághatók.

70. ábra - „Ragadós végű” fragmensek

kepek/70abra.png


A ragadós végű fragmensek baktérium plazmidjába (élesztőgombába, eukaryota sejtbe) ültethetők úgy, hogy a plazmidot ugyanannak az endonukleáznak a segítségével felnyitjuk és a vírusnukleinsav-szakaszt ezen a hasítási helyen a plazmidba illesztjük. Ez a folyamat a nukleinsav-klónozás (71. ábra).

71. ábra - Nukleinsav-klónozás

kepek/71abra.png


A plazmidot a baktériumsejtbe visszajuttatva az ily módon átalakított baktérium szaporodása során az adott vírus-DNS szakaszt is nagy mennyiségben termeli, és így a hagyományos eljárásnál (szövettenyésztés, vírusszaporítás, vírusnukleinsav-tisztítás) gyorsabban és kevesebb költséggel termelhető vírus-DNS. Ez a DNS vagy a belőle készített fragmensek többek között az analitikai és a diagnosztikai célból végzett nukleinsav-hibridizációs próbákban használhatók fel.

A nukleinsav-hibridizációs eljárás alapja az, hogy a DNS-szálon egymással szemben helyezkedő, komplementer nukleinsavszálak mesterséges szétválasztásukat követően „megtalálják” egymást, és újra kialakítják a dupla láncot. A vírusazonosítás, illetve a különböző vírusgenomok összehasonlító vizsgálata során az egyik vírus DNS-t vagy annak baktériumokkal termeltetett, klónozott szakaszát 32P izotóppal megjelöljük (próba), majd a másik vírus DNS-ét nitrocellulóz filterhez kötve hőkezeléssel hosszában szétválasztjuk, és az így denaturált nukleinsavhoz hozzáadjuk az izotóppal jelölt mintát. Lehűlés közben ismét kialakul a kettős nukleinsavszál. Amennyiben a vizsgálandó vírus-DNS és a próba-DNS komplementer, akkor a kialakuló kétszálú DNS egy részébe az izotóppal jelölt próba-DNS épül be. Ismételt mosással a nem kötődött próba-DNS eltávolítható. A visszamaradó radioaktivitás (amit ma a legtöbb helyen autoradiográfiás eljárással mutatnak ki) a két vírus közötti azonosságot, illetve rokonságot jelzi (72. ábra).

72. ábra - Nukleinsav hibridizációs eljárás

kepek/72abra.png


Próbaként nemcsak DNS, hanem mRNS is alkalmazható, hiszen egy adott génszakaszról készült mRNS-kópia is komplementere a megfelelő DNS-szálnak. Az izotóp használatával járó nehézségek és veszélyek kiküszöbölése érdekében újabban különböző enzimekkel jelölt próba-nukleinsavakat is használnak hibridizáció során. A kötődést ebben az esetben nem radioaktivitás, hanem színreakció jelzi. A diagnosztikai célból végzett nukleinsav-hibridizációs eljárásokról később lesz szó.

A fentiekben ismertetett hibridizációs technika alapfeltétele a DNS szálakat szétválasztó hőkezelés. Az ilyen vizsgálatokat tehát a 100 °C-os hőkezelést elviselő közegben, nitrocellulóz- vagy nylonfiltereken kell végezni, ezért hívják az eljárást gyakran filterhibridizációs eljárásnak. Az agarózgél közegből, amelyet a vírusanalitikai vizsgálatoknál a nukleinsavfragmensek szétválasztására legtöbbször alkalmaznak, a hibridizáció előtt diffúzió segítségével vihetők át az elkülönített fragmensek a nitrocellulóz vagy nylonfilterre (Southern-blot technika).

Az ún. heteroduplex technika is a hibridizáció során ismertetett jelenséget, a kettős DNS hőkezelésre bekövetkező reverzibilis denaturációját, felnyílását használja ki. A két különböző vírus hosszában felnyitott, majd lehűlve egyesülő DNS-éből kialakult, kevert kettős DNS-szálat (heteroduplexet) itt elektronmikroszkóppal vizsgálják. Ahol a két szál komplementer, ott az elektronmikroszkópos képen egységes szálként jelenik meg, a nem komplementer szakaszok viszont egymástól elválnak, hurkot képeznek (ún. D-loopot). Ezzel a két vírus genomján elektronmikroszkópos felvételeken a homológ és heterológ szakaszok hossza és helyeződése is megállapítható (73. ábra).

73. ábra - Heteroduplex technika

kepek/73abra.png


Ez a módszer génlokalizációra is alkalmas, ha a DNS szál és a róla másolódott mRNS szál elegyét hőkezeljük. A felnyíló DNS szálhoz a lehűtés során hozzátapad a mRNS molekula, ahhoz a génszakaszhoz, amely a transzkripció során az adott mRNS templátjául szolgált. A DNS komplementerszála ilyenkor már nem tud visszatapadni, mert a szabad nukleotidokat az adott szakaszon az mRNS foglalja el. A hurokképződés (R-loop) ebben az esetben is elektronmikroszkóppal figyelhető meg.

A vírus-DNS-nukleotidsorrend meghatározása során a kettős DNS-szálat hosszában hőkezeléssel szétválasztják, a szimpla szálú DNS-t jelölik (pl. izotóppal vagy fluoreszkáló festékkel), majd a nukleinsavoldathoz szabad nukleotidokat (adenin, guanin, citozin, timin), szintetikus oligonukleotid „primer” szálat, polimeráz enzimet és az egyik nukleotid didezoxi-változatát adják (pl. didezoxi-adenint, ddA). Az oldat lehűlésekor az oligonukleotid primer szál hozzátapad a komplementer vírus-DNS-hez, a polimeráz enzim pedig a primerről kiindulva elkezdi felépíteni a szabad nukleotidokból a szimpla szálú DNS komplementerszálát. Random módon vagy dezoxi-adenint vagy didezoxi-adenint épít be a komplementer szálba a templátként szolgáló szál timidin nukleotidjaival szemben. A dezoxi-adenin beépítése esetén a láncépítés folytatódhat, a didezoxi-adenin után azonban megszakad a szál, mert erről a molekuláról hiányzik a következő nukleotid kapcsolódásához szükséges -OH csoport. Vagyis aszerint, hogy hányszor és hol fordul elő timidin a templátként szolgáló szálon, különböző hosszúságú komplementer szállal kiegészült DNS-molekulapopulációk képződnek, melyek mind didezoxi-adenin-molekulával végződnek. Egyidejűleg ugyanezt a reakciót három másik reakcióelegyben is elvégzik, de ezek a három másik nukleotid egyikének didezoxi variánsát tartalmazzák. A négy minta párhuzamos elektroforézisével négy egymással párhuzamos sávban a különböző hosszúságú fragmensek elkülöníthetők és a nukleotidsorrend leolvasható (74. ábra és 75 ábra).

74. ábra - A vírus-DNS-nukleotidsorrend meghatározásának sematikus rajza

kepek/74abra.png


75. ábra - Nukleotidsorrend meghatározáshoz használt poliakrilamid gél fényképe (dr. Benkő Mária felvétele)

kepek/75abra.png


Az RNS-vírusok esetében az ún. RNS-ujjlenyomat technika segítségével történik a nukleinsav vizsgálata. Ekkor a megfelelő RNS-t hasító enzim (pl. Tl ribonukleáz, ribonukleáz-A) a nukleinsavszálat egy-egy meghatározott nukleotid (pl. minden uracil) mellett elvágja. Mivel ezek az enzimek nem nukleotidcsoportokat, hanem egyes nukleotidokat ismernek fel, a nukleinsavszálat több helyen hasítják, és kevesebb nukleotidból álló fragmenseket képeznek (oligonukleotidok), mint a restrikciós endonukleázok a DNS-vírusok esetében. Az oligonukleotidokat kétdimenziós poliakrilamidgél-elektroforézissel szétválasztják. A legyezőszerűen szétterülő pontokból kialakuló oligonukleotid-kép ugyanúgy jellemző egy adott RNS-vírusra, mint a DNS-vírusokra a fragmenstérkép.

Az RNS-vírusok genomjának vizsgálatához igen gyakran alkalmazzák a reverz transzkriptázos konverziót, ilyenkor a genomként szolgáló RNS-ről reverz transzkriptáz enzimmel DNS-szálat másolnak. Ezt a DNS-másolatot (ún. cDNS-t) használják a hibridizációs vizsgálatokhoz, a nukleotidsorrend meghatározásához, klónozáshoz, restrikciós endonukleázos analízishez, mert ezek az eljárások csak dupla szálú DNS vizsgálatához használhatók.

A vírusfehérjék szerepe és felosztása

A virion szerkezetének a nukleinsavak mellett a fehérjék is alapvető komponensei. Szerepük többféle lehet, így többek között meghatározzák a virion alakját, enzimként szerepelnek a vírusszaporodás folyamataiban stb. A virion fehérje-összetétele jellemző az adott vírusra.

A vírusfehérjék alapvetően két csoportra oszthatók. A struktúrproteinek a virion felépítésében vesznek részt, a nem strukturális fehérjék (pl. az ún. korai fehérjék, egyes enzimek és különböző prekurzor fehérjék) pedig csak a vírusszaporodás bizonyos fázisaiban termelődnek, tehát csak a vegetatív vírusban (a fertőzött sejtben) vannak jelen, a virionba nem épülnek be. Ez utóbbiaknak csak genetikai kódja található meg a virion nukleinsavában.

A virion struktúrproteinjeit tovább oszthatjuk külső fehérjékre és core-proteinekre. A külső fehérjéknek alapvető szerepe van a fogékony sejtekhez való adszorpcióban, a vírus antigén természetének és a kapszid szimmetriaviszonyainak meghatározásában, továbbá védik a vírusgenomot a környezet inaktiváló hatása ellen.

A virion belsejében levő fehérjék (core-proteinek) általában a nukleinsavhoz kapcsolódnak és annak védelmében játszanak szerepet. A virion enzim természetű struktúrproteinjeinek többsége is a core-ban található, ezek többnyire a vírusszaporodás folyamán játszanak szerepet (lásd később).

Fehérjevizsgáló módszerek

A vírusfehérjék vizsgálatára leggyakrabban a poliakrilamid gélben végrehajtott elektroforézist alkalmazzák. A korábban leírtak szerint tisztított és koncentrált preparátumot nátrium-lauril-szulfáttal (SDS, sodium dodecyl sulphate) és merkaptoetanollal kezelik, ezáltal a diszulfidhidak és a hidrogénkötések felszakadnak, a vírusalkotó fehérjék lineáris polipeptid láncokra esnek szét. Az ily módon feltárt fehérjék megfelelő pH-viszonyok mellett elektroforetikus térben egységesen a pozitív sarok felé vándorolnak, a molekulatömegük által megszabott sebességgel. Megfelelő idejű futtatás után az elektroforézist leállítva és a fehérjéket megfelelő eljárásokkal (pl. ezüst-nitrátos festéssel) láthatóvá téve az azonos molekulatömegű fehérjék a kiindulóponttól azonos távolságra találhatók. A megtett út és a molekula tömege itt is fordított arányban van. Egy adott vírusra éppúgy jellemző az így kapott polipeptidkép, mint az endonukleázos emésztés után a DNS-fragmensek elektroforetogramja.

A vírusok antigénszerkezetének, fehérje-összetevőinek vizsgálatára használják a monoklonális ellenanyagokat is. Ezeket mesterségesen előállított hibridomasejtekkel termeltetik. Az eljárás során a vizsgálni kívánt vírussal, illetve annak meghatározott fehérjéjével egereket immunizálnak, majd a megfelelő szintű immunitás kialakulása után ezek lépét eltávolítják. A lépből az ellenanyag-termelésért felelős B-lymphocytákat kiszabadítják és a sejtszuszpenzióhoz lymphoid tumorból származó myelomasejteket kevernek. Polietilénglikol hatására a sejtek cytoplasmamembránja összeolvad, sejtfúzió jön létre. A kialakuló tetraploid hibridsejtek mindkét szülősejttől örökölnek tulajdonságokat: a lépsejttől az ellenanyag-termelő képességet, a myelomasejttől pedig a korlátlan szaporodóképességet (76. és 77. ábra). A hibridsejtek (a B-lymhocytákhoz hasonlóan) rendelkeznek továbbá egy enzimmel (hypoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz, HPRT), melynek segítségével át tudják alakítani a hipoxantint, amely az ilyen enzimmel nem rendelkező myelomasejtek számára toxikus.

76. ábra - Hibridomasejt-előállítás folyamata

kepek/76abra.png


77. ábra - Hibridomasejt mikroszkópos képe (A: egy B-lymphocytából és egy myelomasejtből, B: két lymphocytából és két myelomasejtből összeolvadt hibridomasejt)

kepek/77abra.png


A hibridsejtek klónozásával olyan, egy-egy hibridomából származó sejtvonalak (klónok) különíthetők el, melyeknek sejtjei egyetlen epitop ellen termelnek ellenanyagokat (monoklonális ellenanyagok). A megfelelő ellenanyagok kiválasztásával egyrészt a korábbiaknál specifikusabb és gyorsabb diagnosztikai próbák dolgozhatók ki, másrészt a vírusok fehérjeszerkezetének, a vírusneutralizáció mechanizmusának, a vírusok rokonsági viszonyainak stb. vizsgálatára nyílik lehetőség.

Lipidek

A burkos vírusok tömegének 30–35%-át kitevő lipidtartalmú külső burok sejt eredetű, a kiszabaduló víruspartikula a szaporodási ciklus végén a gazdasejt különböző membránrendszerein áthatolva és azokból egy darabot „kiszakítva” jut a burokhoz. Ezért a burok lipidösszetétele mindig a gazdasejtéhez hasonló (foszfolipid és koleszterol). A lipidmembránba azonban mindig beépülnek vírusspecifikus proteinek és glükoproteinek is, ezeket a membránhoz mirisztil-csoportok (kovalensen kötött zsírsavak) rögzítik.

A komplex szerkezetű poxvirusok kapszidjában vírusspecifikus lipidek vannak, melyek összetétele a gazdasejt membránkomponenseitől eltér. Az afrikai sertéspestis vírusának ikozahedrális kapszidjában is találhatók vírusspecifikus lipidkomponensek, de a külső burok e vírusok esetében is sejteredetű.

Szénhidrátok

A virionban a nukleinsavban található ribózon vagy dezoxiribózon kívül szénhidrátok elsősorban a burkos vírusok peplomerjeiben (felszíni membránfehérjéiben) fordulnak elő, glükoproteinek formájában. Hidrofób részük a lipidmembránba ágyazódik, glükozilált hidrofil részük pedig kifelé irányul. A komplex szerkezetű poxvirusok „magjában” is kimutatható glükoprotein.

A vírusok szaporodása (multiplikációja)

A már eddig megismert és az újonnan jelentkező vírusos betegségek elleni küzdelemben kulcsfontosságú a vírusok szaporodási stratégiájának minél részletesebb megismerése.

A vírusok parazita életmódjukat kizárólag a gazdasejtben történő szaporodásuk (multiplikációjuk) során valósítják meg, amelynek központi lépésére utalva, a folyamatot gyakran replikációnak is nevezik.

Minden vírus szaporodási stratégiája lényegében három lépésből áll

• behatolás a sejtbe (lehetőség a parazitizmusra),

• a multiplikáció módja (a genetikai parazita életmód megvalósítása),

• a sejtből való kijutás lehetősége (alkalom a terjedésre, az újabb parazitizmusra).

Ezeket a feladatokat a vírusok hat különböző lépésben valósítják meg (78. ábra). Ennek során a vírusnak először meg kell találni azokat a sejtfelszíni struktúrákat, ahol kapcsolódni tud a sejthez (adszorpció), majd ahol behatolhat a cytoplasmába (penetráció). A cytoplasmába jutott vírusnak alkalmassá kell tenni genetikai információját a replikációra, ezért legelőször meg kell szabadulnia a vírusgenomot körülvevő fehérjéktől (lemeztelenedés). Az utódvirionok létrehozásához különböző replikációs, transzkripciós és transzlációs stratégiákat kell alkalmazni, attól függően, hogy milyen típusú nukleinsav tárolta a vírus genetikai információját és hogy a replikáció a sejtmagban vagy a cytoplasmában jön-e létre (makromolekulák szintézise). Az utódvirionoknak az összeépülés után meg kell találni a módot a sejt elhagyására (kiszabadulás), ami különösen nehéz feladat a baktériumokat és a növényi sejteket megtámadó vírusok számára. A sikeresen végrehajtott szaporodási stratégia eredménye a fertőzés.

78. ábra - Vírusok szaporodásának lépései (magyarázat a szövegben)

kepek/78abra.png


A szaporodási stratégia legfontosabb lépéseit magába foglaló eklipszis (napfogyatkozás) elnevezést eredetileg a pathomorphológusok alkalmazták arra a szaporodási szakaszra, amikor elektronmikroszkópos vizsgálattal nem látták a sejtben a vírus struktúráját. Virológiai értelemben az eklipszis, az első mRNS szintézisétől az első utódvirion megjelenéséig tart. A vírusok szaporodási ciklusában az eklipszis a leghosszabb szakasz, melynek időtartalma DNS-vírusoknál átlag 5–15 óra, RNS-vírusoknál pedig 3–10 óra (79. ábra).

79. ábra - Vírusok szaporodási ciklusa

kepek/79abra.png


Adszorpció

Az adszorpció egy specifikus kapcsolat a sejtmembrán bizonyos fehérjéi (receptor) és a virion egyes felszíni, adszorpciós fehérjéi (antireceptor) között. Annak ellenére, hogy a vírus a sejtmembrán teljes felszínén képes „landolni”, a sejtbe történő behatolás csak azokon a membránrészeken keresztül valósulhat meg, ahol lehetőség nyílik erőteljes, stabil receptor – antireceptor kapcsolatra (80. ábra).

80. ábra - Az adszorpciós fehérjék speciális elhelyeződése

kepek/80abra.png


Az adszorpció rendszerint a sejtek és a virionok véletlenszerű ütközésével indul meg, amit a két lépésben zajló fizikokémiai folyamat követ. Az első lépés során reverzíbilis kapcsolat alakul ki a véletlenszerűen találkozó receptor- és antireceptormolekulák között. Ez a kapcsolat csak akkor jöhet létre, ha a környezetben elegendő kation van jelen ahhoz, hogy semlegesítse az azonos negatív töltéssel rendelkező receptor- és antireceptormolekulák között jelen levő elektrosztatikus erőt. A második lépésben a folyamat irreverzíbilissé válik, a fehérjemolekulák közötti kémiai kötéseknek köszönhetően.

A evolúciós események során kialakult receptormolekulák szinte kivétel nélkül a sejt felszínén helyezkednek el és többnyire glükoproteinek. Csak azok a vírusok képesek megfertőzni a sejtet, amelyek az adszorpciós fehérjéjüknek megfelelő receptormolekulát megtalálják a sejtmembránon. Ezért a fertőző vírus sejt, illetve fajspecificitását valójában a receptormolekulák jelenléte határozza meg. Az „egy vírus – egy receptor” kapcsolat mellett különösen az egy családba tartozó vírusok között megvalósulhat az „egy receptor – több vírus” modell is. Adott receptor- molekulából általában 104–105 példány található a sejt felszínén. A receptorfehérjék genetikai kódját több vírus esetében azonosították (pl. a 19. emberi kromoszóma kódolja a poliovírus, a 3. pedig a herpesz szimplex vírus receptor fehérjéit). A receptormolekulák genetikai kódja a legtöbb esetben már a magzati életben kifejeződik, és ez teszi lehetővé adott vírusok magzatkárosító hatását. Ugyanakkor ismertek olyan eseteket is, amikor a receptorfehérjék csak bizonyos körülmények között jelentek meg annak ellenére, hogy genetikai kódjuk jelen volt a kromoszómában. (pl. az ember vesesejtjei nem tartalmaznak receptort a fertőző gyermekbénulást okozó poliovirussal szemben, ugyanakkor a humán veséből készült egyrétegű sejtkultúrák felszínén kifejeződnek).

A genetikailag kódolt specifikus vírusreceptorok mellett a sejtmembránon található komplement és hormonreceptorok is több vírus számára biztosítanak adszorpciós lehetőséget (pl. HIV–CD4-receptor, veszettség vírus–acetilkolin-receptor, vaccinia vírus epidermalis növekedési faktor, EGF-receptor).

Az antireceptormolekulák általában a vírus kapszidjában vagy a burkában helyezkednek el, ugyanakkor egyes vírusoknál speciális nyúlványokon találhatók (80. ábra.)

Amíg a sejtreceptorok kémiai szerkezete és térbeli helyzete viszonylag stabil, addig egyes vírusok éppen az adszorpciós fehérjéik (antireceptor) változtatásával biztosítják túlélésüket a természetben (pl. orthomyxovirusok, HIV). Több vírus esetében a jelentős evolúciós előnyt jelentő gazdafajváltás is az adszorpciós fehérjék sikeres megváltoztatására vezethető vissza (pl. a macska pánleukopénia vírusa így adaptálódott a kutyához és a nyérchez vagy a kutya szopornyica vírusa a fókákhoz és a delfinekhez).

Az adszorpciós fehérjékhez kötődő ellenanyagok lehetetlenné teszik az adszorpciót, így megakadályozzák a sejt fertőződését. Ezért az adszorpciós fehérjék doménjeinek változtatása az immunrendszerrel szemben is előnyhöz juttathatja a vírust.

A legtöbb vírus esetében az adszorpció a sejttel való találkozás után egy órán belül irreverzíbilissé válik. Ha ezt a kapcsolatot kémiai vagy fizikai módszerekkel megszakítjuk, az antireceptormolekulák sérülése miatt a vírus elvesztheti adszorpciós és fertőzőképességét. Az orthomyxovirusok ugyanakkor rendelkeznek egy speciális enzimatikus hatású felszíni fehérjével is (neuraminidáz), ami úgy oldja fel az adszorpciós kapcsolatot, hogy az antireceptormolekulák (hemagglutinin) épségben maradnak (80. ábra). Ezért a vírusnak ismételt lehetősége adódik az adszorpcióra és a fertőzésre.

Az adszorpció kialakulása után azonnal kezdetét veszi a penetráció.

Penetráció

A penetráció energiaigényes, kizárólag élő sejtben végbemenő, gyors folyamat. A ragadós száj- és körömfájás vírusa a 3 percen belül lezajlódó penetrációhoz, 37 °C-on 96 000 kJ/mol aktivációs energiát igényel. (Az adszorpció kialakulásához elegendő 24 000 kJ/mol energia még 2–4 °C-on is, de ezen a hőmérsékleten nem történik penetráció) az energiatermelő folyamatok lelassulása miatt.

A penetráció módját meghatározza a virion struktúrája és a sejt típusa, valamint a koncentrációs tényezők alakulása. A penetráció eddig megismert általános és alternatív formáit elektronmikroszkópos és membránkémiai módszerekkel derítették fel.

A penetráció általános formái

Transzlokáció. Az adszorbeálódott virion előtt megnyílik, majd áthatolás után újra összezárul a sejtmembrán. A „csapóajtó mechanizmus”-ként is emlegetett transzlokációt elsősorban a nem burkos, ikozahedrális szimmetriájú virusok veszik igénybe. A picornavirusok kapszidja a transzlokáció során elveszti ikozahedrális szerkezetét, és egy amorf, RNS-fehérjekomplexként hatol át a sejtmembránon (81. ábra).

81. ábra - A penetráció általános formái (magyarázat a szövegben)

kepek/81abra.png


Endocytosis (viropexis). A sejtek táplálkozásuk során adott makromolekulákat, a receptorhoz kötött endocytosissal kebelezik be. A viropexis során az adszorbeálódott vírus, ezt a lehetőséget használja ki, mivel mérete még a bekebelezhető tartományba esik. Az adszorbeálódott vírus mögött a sejtmembrán lefűződik és a vírus, sejtmembránnal körülvett vesiculumként (endosoma), a cytoplasmába jut. Ezzel a vírustartalmú vesiculummal a sejt lysosomája hamarosan fuzionál. Az így kialakult phagolysosomában kezdetét veszi a dekapszidáció. A nem burkos vírusok döntő többsége viropexissel jut a sejtbe.

A burkos vírusok viropexise abban különbözik a nem burkos vírusokétől, hogy itt a vírusburok is lefűződik, miközben fuzionál az endosoma sejt eredetű membránjával (81. ábra). A burkos vírusok közül elsősorban a herpesz- és poxvirusok használják az endocytosist a penetrációhoz.

Membánfúzió. A membránfúziót kizárólag burkos vírusok vehetik igénybe. A folyamat során a vírus burka egyesül a sejt membránjával, és ezért kizárólag a nukleokapszid lép be a cytoplasmába. A membránfúziót a vírus indukálja, a burokban helyeződő fúziós proteinjei (F) révén. A fúziós fehérjék működésének mechanizmusát még nem tisztázták. A paramyxovirusok és egyes herpesvirusok membránfúzióval jutnak be a sejtbe (81. ábra).

A penetráció alternatív formáit elsősorban a baktériumok és növények vírusai alakították ki, mivel a sejtfalon összehasonlíthatatlanul nehezebb az áthatolás, mint az állati sejtek membránján.

A penetráció alternatív formái

• A T-bakteriofágok nyaki részében összehúzódásra képes fehérjemolekulák találhatók. A fág adszorpciója után a farki végben levő lizozim enzimek lyukat vágnak a baktériumsejt falába, majd a fág nyaki részében található fehérjék hirtelen összehúzódnak, és szinte „belövik” a fág nukleinsavát a baktérium cytoplasmájába.

• Néhány ribofág szellemes módon, a baktérium sejtfal nélküli részén, a sex-fimbrián keresztül hatol be a baktériumba. A ribofág csak a sexfimbriával rendelkező baktériumokat képes megfertőzni, ezért ezt a fertőződési formát a „baktériumok nemi betegségének” is nevezik.

• A növényi vírusok a sejtfal sérülésein (pl. rovarszúrás, -harapás, metszés) keresztül, közvetlenül hatolnak a sejtbe.

Dekapszidáció (uncoating)

A cytoplasmába jutott vírus számára létkérdés, hogy genomját vagy legalábbis a korai fehérjéket kódoló génszakaszokat minél gyorsabban alkalmassá tegye a transzkripcióra. Ennek érdekében a vírusnak meg kell szabadulnia a nukleinsavat körülvevő és védelmet nyújtó nukleokapszid fehérjéktől. A dekapszidáció során ezt a feladatot a cytoplasmában található proteolitikus enzimek közül feltételezhetően a lysosomális enzimek végzik el. A vírusburok vagy endosomamembrán emésztésében feltételezhetően az intracelluláris proteázoknak jut kulcsszerep.

A dekapszidáció ugyanakkor komoly veszélyt is jelenthet a vírusnak, ha a védőfehérjéktől megszabadított genomja megsérül vagy áldozatul esik a nukleáz enzimek emésztő hatásának. Ennek elkerülésére a vírus számos stratégiát alkalmaz.

Több ikozahedrális vírus esetében bizonyították, hogy a dekapszidáció soha sem teljes, és a transzkripció már akkor megindul, amikor a vírus még csak néhány kapszidproteinjét vesztette el. A sejtmagban szaporodó DNS-vírusok csak így biztosíthatják nukleinsavuk számára, hogy épségben jussanak be a sejtmagba, ahol transzkripciójuk és replikációjuk zajlik.

A cytoplasmában szaporodó poxvirusok egy ún. „vetkőztető (uncoating) enzimet” kódolnak, amely kíméletesen fejezi be a sejtenzimek által megkezdett, meglehetősen agresszív dekapszidációt.

A picornavirusok már az adszorpciót követő struktúraváltozás során elvesztik két kapszidproteinjüket (V2, VP4), és maradék fehérjéik ezúton válnak különösen fogékonnyá a proteolytikus enzimekkel szemben. Ennek eredményeképpen a vírus-RNS már néhány perc alatt szabaddá válik nemcsak a transzkripcióra, de a nukleáz enzimek számára is. Ez a versenyhelyzet kényszeríti a picornavirusokat a rendkívül gyors szaporodásra.

A T-bakteriofágok teljes dekapszidációja már a penetráció során megtörténik, mivel a fág csak a nukleinsavát juttatja be (lövi be) a cytoplasmába.

Makromolekulák szintézise

A vírusok többsége az élővilágban egyedülálló formákban tárolja a genetikai információt (DNS/1, RNS/1, RNS/2), ezért speciális replikációs és transzkripciós stratégiákat kellett kifejlesztenie ahhoz, hogy a makromolekuláit szintetizálni tudja a prokaryota és eukaryota sejtekben (82. ábra).

82. ábra - Dupla szálú DNS-vírusok (DNS/2) makromolekuláinak szintézise (Lomniczi (1978) után módosítva). Magyarázat a szövegben

kepek/82abra.png


Ezt a feladatot a nukleinsav-szintézist végző replikáció, valamint a fehérjeszintézist irányító transzkripció és transzláció során hajtja végre. Habár ezek az események közel azonos időben zajlanak, mégis funkcionálisan három, jól elkülöníthető szakaszra bonthatók: korai transzkripció (mRNS-szintézis) és transzláció (fehérjeszintézis), genomreplikáció (nukleinsav-szintézis), késői transzkripció (mRNS-szintézis) és transzláció (fehérjeszintézis).

A korai transzkripció és transzláció már az eklipszis fázisban elindul, és ennek során a vírus előállíttatja a sejttel azokat a korai fehérjéket, amelyekre még a vírusgenom replikációja előtt szüksége van. Keletkezésük időbeli eltérése alapján megkülönböztetünk azonnali korai (immediate early) és késleltetett korai (delayed early) fehérjéket. Ezek a korai fehérjék olyan vírus által kódolt enzimek, amelyek egyrészt gátolják a sejt saját fehérje- és nukleinsav-szintézisét (represszorfehérjék), másrészt segítik a vírusgenom replikációját (pl. a vírus által kódolt nukleinsav polimerázok is ekkor szintetizálódnak). Több vírus esetében bizonyították a korai fehérjék primer szerepét is. A korai fehérjék nem épülnek be az utódvirionokba. Feladatuk a vírusgenom replikációjához szükséges körülmények megteremtésével véget ért.

A vírusgenom replikációja során a „szülő” nukleinsavról mint templátról szintetizálódnak az utódvirionok genomjai. A szintézist a HDV, a papovavirusok és a parvovirusok kivételével a vírus által kódolt polimeráz (replikáz) enzimek végzik. (A parvovirusok pl. a sejt illetve más vírus replikáz enzimét használják fel.)

A vírusreplikáz enzimek specificitása teszi lehetővé, hogy a cytoplasmában szaporodó vírusok (poxvirusok, afrikai sertéspestis vírusa, RNS-vírusok) is szintetizálni tudják nukleinsavukat. Az eukaryota sejtekben a replikációs mechanizmus ugyanis kizárólag a magban található.

A vírus által kódolt replikáz enzimek közös tulajdonsága, hogy nagyságrenddel gyorsabbak, „agresszívabbak” a sejt replikáz enzimeinél. A vírusok ezáltal jutnak, többnyire behozhatatlan előnyhöz a sejttel szemben a makromolekulák szintéziséért vívott harcban.

A késői transzkripció és transzláció során szintetizálódnak az utódvirionok struktúrfehérjéi és azok az enzimek (pl. transzkriptázok) amelyeket adott vírusoknak készen, a nukleokapszidba csomagoltan kell szállítani a fogékony sejtekhez, ahol szaporodási feltételeiket majd megtalálják.

Eukaryota sejtekben a transzkripciós események kizárólag a sejtmagban zajlanak, amelynek során a sejt által kódolt transzkriptáz (DNS/2-mRNS-polimeráz) enzim mRNS-t szintetizál a mintát adó kromoszomális DNS pozitív száláról. A vírusok közül kizárólag a sejtmagban szaporodó vírusok (herpesz-, adeno-, papova-, hepadna-parvovirusok) használhatják ezt a stratégiát. A sejt cytoplasmájában szaporodó vírusok a saját genomtípusuknak megfelelő transzkripciós enzimkészletet fejlesztettek ki, melyet a (+)RNS-vírusok kivételével nemcsak kódolva, de készen is kénytelenek magukkal vinni. A cytoplasmában ugyanis nincs lehetőség a transzkripcióra. A (+)RNS vírusok genomját a sejt riboszómája mRNS-nek fogadja el, ezért a vírusgenomról közvetlenül szintetizálódhatnak a fehérjék.

Szimpla szálú RNS-vírusoknál nehéz élesen szétválasztani a replikációt és a transzkripciót, mivel mindkét folyamatnál RNS-dependens RNS-polimeráz végzi a szintézist.

Minden vírus, a gazdasejt ribosomáit, tRNS-eit és transzlációs-poszttranszlációs mechanizmusát használja fel fehérjéinek szintéziséhez (transzláció).

Bizonyos vírusfehérjék transzláció utáni glükolizációja és foszforilációja (poszttranszláció) a gazdasejt fehérjéinél alkalmazott módszerekkel történik, többnyire a sejtenzimek irányításával. A herpesvirusok fehérjéinek foszforilációját a vírus által kódolt protein kináz enzim végzi el. A vírusfehérjék glükolizációja a sejtmembránokon zajlik. A magas mannóztartalmú glükoproteinek, a maghártya és a Golgi-rendszer membránjában szintetizálódnak.

A vírusok által alkalmazott különböző replikációs, transzkripciós és transzlációs stratégiák jellegzetességeit a Baltimore-féle genetikai rendszer csoportosítása alapján tárgyaljuk (12. táblázat).

12. táblázat - Baltimore-féle genetikai rendszer

A Baltimore-féle genetikai rendszerek és az azokat képviselő víruscsaládok

A rendszer osztályai

I.

II.

III.

IV.

V.

VI.

kettős szálú

DNS-vírusok

egyszálú

DNS-vírusok

dupla szálú

RNS-vírusok

pozitív, szimplaszálú RNS-vírusok

negatív, szimplaszálú RNS-vírusok

DNS közvetítőt

használó

RNS-vírusok

papova-

adeno-

herpes-

irido-

pox-

* Parvo-

** Cirko-

*** Hepadna-

Reo-

(Birna-)

Astro-

Picorna-

Calici-

Toga-

Corona-

Toro-

Flavi-

Orthomyxo-

Paramyxo-

Rhabdo-

+Arena-

+Bunya-

Filo-

Retro-

* lineáris DNS +Ambiszenc RNS

**cirkuláris DNS

***részlegesen duplaszálú DNS


Dupla szálú DNS-vírusok (DNS/2)

A legtöbb dupla szálú DNS-vírus (herpes-, adeno-, papovavirus) replikációja és transzkripciója a sejtmagban, míg néhányuké (pox-, afrikai sertéspestis vírusa) a cytoplasmában zajlik. A sejtmagban szaporodó DNS/2 vírusok kódolva szállítják és használják virális replikáz (DNS/2-DNS/2 polimeráz) és transzkriptáz (DNS/2-mRNS polimeráz) enzimeiket annak ellenére, hogy a sejt által kódolt enzimeket is felhasználhatják. A „szülő” vírus korai transzkripcióját, éppen a sejt által kódolt transzkriptáz enzimek végzik el. Transzláció előtt a policisztronos mRNS-t a vírus enzimei monocisztronos részekre vágják (82. ábra).

A cytoplasmában szaporodó DNS/2-vírusok ugyancsak kódolják a replikáz és transzkriptáz enzimet. A korai transzkripciót a vírus által készen szállított transzkriptáz enzim végzi el, mivel a sejt cytoplasmájában ez az enzim nem fordul elő. A poxvirus genomjáról monocisztronos mRNS-ek szintetizálódnak.

Szimpla szálú DNS-vírusok (DNS/1)

A szimpla szálú DNS-vírusok replikációja és transzkripciója a sejtmagban történik.

A replikáció alapfeltétele, hogy a vírus dupla szálú DNS-sé (a replikációhoz szükséges templáttá) alakítsa át genomját.

A Parvoviridae család vírusai ezt a feladatot kétféle módon oldják meg. Egyrészt a sejtmagba bejutott + és - irányítottságú szimpla nukleinsavszálak, ha elég közel kerülnek egymáshoz, „spontán összeépüléssel” létrehozzák a DNS/2-genomot (dependovirus, densovirus). Másrészt a negatív irányítottságú DNS- szálaknak (parvovirus) lehetőségük adódik a komplementációra az ún. „kifoltozódásra”. Erre az „önmagába visszaforduló” szimpla szál struktúrája ad lehetőséget. (A genom két vége visszahajlik, így valójában csak egy viszonylag kis szakasz marad egyszálú formában.) A „kifoltozódás” során erre az egyszálú szakaszra egy komplementer pozitív szál szintetizálódik, és kialakul a replikáció templátját adó dupla szálú vírusgenom. Ezt a folyamatot a sejt enzimei (DNS-DNS polimeráz) végzik el, mivel a parvovirusok, nem kódolnak virális replikáz és transzkriptáz enzimet. Ez az oka annak, hogy replikációjukhoz különösen igénylik az osztódó sejteket, melyek „S” fázisában nagymértékben felszaporodnak a replikációt és a transzkripciót irányító enzimek (83. ábra).

83. ábra - Szimpla szálú DNS-vírusok (DNS/1) makromolekuláinak szintézise (parvovirus)

kepek/83abra.png


A parvovirusok egy csoportja (dependovirusok) a herpesz- és adenovirusok polimeráz enzimeit használja fel. Ezek a vírusok hiába alakították ki spontán összeépüléssel a kettős DNS-szálat, szaporodni csak akkor képesek, ha a sejtben egyidejűleg herpes- vagy adenovirus is jelen van.

A hepadnavirusok cirkuláris genomjának kb. 50%-a egyszálú DNS. A hepadnavirusok genomjának „kifoltozását” és cirkuláris formába történő alakítását, a vírus által kódolt és készen szállított DNS-polimeráz enzim végzi (Hepatitis-B vírus) a sejt magjában. A replikációt és a transzkripciót is virális enzimek irányítják. A cirkuláris formába átalakított hepadnavirus genom pozitív száláról egy genom hosszúságú ún. „hosszú transzkript” (+RNS) és több un. „rövid transzkript” szintetizálódik. A „rövid transzkriptek” egy részéről „korai fehérjék” (enzimek), más részéről „késői fehérjék” (struktúrproteinek) szintetizálódnak. A „hosszú transzkript” becsomagolódik az időközben elkészült struktúrproteinekből összeépülő még „éretlen (immature)” nukleokapszidba és elhagyja a sejtmagot. Amikor a +RNS-t tartalmazó nukleokapszid a cytoplasmába ér, a vírus által előállított reverz transzkriptáz enzimek erre a genom hosszúságú transzkriptre (+RNS-re), egy –DNS-szálat szintetizálnak, majd ezután a –DNS szál egy részére komplementer +DNS szálat építenek, így kialakul a csak részlegesen dupla szálú vírusgenom. Ezt követően befejeződik a nukleokapszid összeépülése is.

A szimpla szálú DNS-vírusok transzkripciós és transzlációs mechanizmusa megegyezik a sejtmagban replikálódó DNS/2-vírusoknál leírtakkal.

Pozitív szimpla szálú RNS-vírusok (+RNS).

A pozitív RNS-vírusok genomját a sejt riboszómája mRNS-nek fogadja el, ezért a genomról a dekapszidáció után megindulhat a korai fehérjék transzlációja, melynek eredményeként virális replikáz és transzkriptáz enzimek termelődnek.

A replikáció két lépésben zajlik. Először a pozitív RNS-szálra a replikáz enzim (+)RNS/(–)RNS polimeráz szintetizál egy komplementer negatív RNS-szálat és kialakul a replikációhoz szükséges kettős szálú intermedier templát (+)RNS/(–)RNS). Ennek negatív száláról ugyanez a replikáz enzim, mint (–)RNS/(+)RNS polimeráz most már pozitív RNS szálakat szintetizál (84. ábra).

A picornavirusok és flavivirusok esetében ezeknek a pozitív nukleinsav- szálaknak az egyik része az utódvirionok genomját alkotja, másik része policisztronos mRNS-ként a riboszómákhoz vándorol. A transzláció során keletkező policisztronos fehérjét a proteolytikus enzimek kész struktúrfehérjékre vágják.

84. ábra - Pozitív szálú RNS-vírusok (+/RNS) makromolekuláinak szintézise (magyarázat a szövegben)

kepek/84abra.png


Számos növényi és egyes állati vírusok pl. a toga- és coronavirusok, struktúrfehérjéik szintéziséhez, szakaszos transzkripcióval állítanak elő mRNS-eket.

Negatív szimpla szálú RNS-vírusok (–RNS).

A negatív irányítottságú vírus-RNS-genomot, a riboszóma nem fogadja el, így a vírusnak első lépésben mRNS-re kell szert tenni, hogy mind a transzkripcióra, mind a replikációra nyitott legyen. A negatív szálú RNS-vírusok ezért nemcsak kódolva, de a nukleokapszidba becsomagolva, készen is magukkal viszik a virális transzkriptáz enzimüket, amelyik a negatív szálú genomról mRNS-t másol.

A paramyxovirusok, és a rhabdovirusok genomjáról a transzkriptáz enzim két különböző úton, replikációs módban és transzkripciós módban másol mRNS-eket és replikációs RNS-t is. A két folyamat egy időben zajlik (85. ábra).

85. ábra - Negatív szálú RNS-vírusok (-RNS) makromolekuláinak szintézise(magyarázat a szövegben)

kepek/85abra.png


Replikációs módban, a szülő genom teljes hosszára egy pozitív szál másolódik (–)RNS/(+)RNS polimeráz és kialakul egy kettős szálú intermedier, amelynek pozitív száláról másolódnak az utódvirionok negatív RNS-genomjai, a (+)RNS/(–)RNS polimeráz enzim segítségével.

Transzkripciós módban a (–)RNS/(+)RNS polimeráz lemásolja a strukturfehérjéket és a kész transzkriptáz enzimet kódoló monocisztronos mRNS szakaszokat.

Dupla szálú RNS-vírusok (RNS/2)

A Reoviridae és Birnaviridae családok vírusai az egyetlenek a ma ismert élővilágban, amelyek genetikai információjukat dupla szálú RNS-ben tárolják. A dupla szálú RNS-vírusok genomja szegmentált, és mivel minden szegment egy-egy fehérjét kódol, a transzkripció során monocisztronos mRNS-ek szintetizálódnak. A makromolekulák szintézise az egyes genomszakaszok transzkripciójával indul, amit vírus által készen szállított transzkriptáz enzimek végeznek.

A transzkripció során keletkező korai mRNS-ek már akkor elhagyják a szülő viriont, amikor annak nukleokapszidját még csak részlegesen emésztették meg a sejt proteolytikus enzimei. (A részlegesen emésztett nukleokapszidot elhagyó mRNS-ek elektronmikroszkópos felvételeken „százlábú pók”-hoz hasonló struktúrát kölcsönöznek a virionnak.)

A „szülői” pozitív nukleinsav szál templátként szolgál azoknak a negatív szálaknak a szintéziséhez, amelyek az utódvirionok kettős genomját alkotják. Az utódvirionok kapszidjába beépülő genomszegmenteket a vírus által szintetizált fehérjék láncba kapcsolják, és ezt követően – a korai transzkripcióhoz szükséges transzkriptáz enzimmel együtt – becsomagolódnak a kapszidba (86. ábra).

86. ábra - Dupla szálú RNS-vírusok (RNS/2) makromolekuláinak szintézise (magyarázat a szövegben)

kepek/86abra.png


Pozitív szálú RNS-t DNS-re átíró vírusok (+RNS/DNS2)

A Retroviridae családba tartozó vírusok a makromolekulák szintézisét megindító korai transzkripció előtt egy speciális, ún. reverz transzkripciót hajtanak végre, amelynek révén (+)RNS-genomjukat DNS/2-genommá alakítják.

A reverz transzkripciót a virionba készen becsomagolt reverz transzkriptáz (visszafelé író transzkriptáz) enzim végzi el, három lépésben.

Az első lépésben az RNS-dependens DNS-polimerázként működő reverz transzkriptáz enzim szimpla szálú komplementer DNS-szálat szintetizál a vírus RNS-re. A szintézis megindításához tRNS-t használ primerként.

A második lépésben a vírus által készen szállított ribonukleáz-H enzim leemészti az RNS-t a cDNS-ről és („repair”) javítóenzim-ként működve kijavítja az új DNS szál hibáit.

A harmadik lépésben a DNS-dependens DNS-polimerázként funkcionáló reverz transzkriptáz enzim erre a DNS-szálra komplementer DNS-t szintetizál. Ily módon kialakul egy dupla szálú, lineáris „vírus”-genom, ennek mindkét végére egy-egy ún. hosszú terminális ismétlődő szakasz (long terminal repeat, LTR) kerül. A DNS/2-vírus genom ezután bejut a gazdasejt magjába, ahol cirkuláris formát vesz fel, és lehetősége adódik a sejt kromoszómájába történő integrációra.

Az integrálódott vírusgenomot provírusnak nevezzük. A provírus komplett és önálló transzkripciós egység, mivel az LTR régió tartalmaz egy promoter szakaszt (ami a transzkripció közvetlen megindításához szükséges) és egy szabályozó (enchancer) szakaszt (ami a transzkripció megerősítéséhez nélkülözhetetlen).

Az integrálódott vírusgenom provírusként, most már a sejt kromoszómájának szerves részévé válik, és róla a sejt transzkripciós enzimjei (DNS-dependens RNS- polimeráz) fognak vírus-mRNS-t szintetizálni úgy, mintha saját mRNS-t állítanának elő. Az így szintetizálódott vírus-mRNS-k akár 1%-át is kitehetik a sejt mRNS készletének. Mivel a retrovirusok nem kódolnak RNS-dependens RNS-polimeráz enzimet, a transzkripciót és a replikációt a gazdasejt RNS/RNS- polimeráz enzime végzi el, egyazon lépésben. A transzkripció során genom hosszúságú és annál rövidebb transzkriptek képződnek. A genom hosszúságú transzkriptek vírusnukleinsavként funkcionálnak, ezért kizárólag ezek csomagolódnak be a készülő nukleokapszidba. A rövidebb transzkriptek egy poliproteint szintetizálnak a riboszómákon, és ezek vágásával alakulnak majd ki a struktúrproteinek és a reverz transzkiptáz- valamint a ribonukleáz-H enzimek. Ezeket az enzimeket az újonnan szintetizálódó vírusok a vírusgenomhoz kapcsoltan magukkal viszik. A retrovirusok két példányban csomagolják be nukleinsavukat (diploidok) (87. ábra).

87. ábra - Pozitív szálú RNS-t DNS-re átíró vírusok (+/RNS/DNS/2) makromolekuláinak szintézise (magyarázat a szövegben)

kepek/87abra.png


A transzláció során szintetizálódnak azok a fehérjék is, amelyek a v-onc. génnel rendelkező retrovirusok esetében kialakítják a sejt daganatos transzformációját (lásd. onkogenitás fejezet).

A retrovirusok multiplikációs stratégiáját látva érthetővé válik, hogy ezek a vírusok miért nem használják ki a +RNS genom adta lehetőséget (mRNS-ként működik). A reverz transzkriptáz enzim ugyanis lehetővé teszi számukra a gazdasejt kromoszómájába történő integrálódást. Az integráció mint a latens fertőzés egyik formája, egyrészt rendkívül gazdaságos (hosszan tartó) túlélési lehetőséget biztosít a vírusnak, másrészt ily módon elkerülheti a cytoplasmában zajló replikáció és transzkripció veszélyeit.

A molekuláris biológiát forradalmasító és a centrális dogmán rést ütő reverz transzkriptáz enzim 1970-ben történő felfedezéséért H. Temin és D. Baltimore 1975-ben kapott orvosi Nobel díjat.

Virionok összeépülése

A nukleokapszid összeépülése (a retrovirusok) a genom-replikáció helyén történik. A DNS-vírusok nukleokapszidja a sejtmagban, az összes RNS-vírus és a két cytoplasmában szaporodó DNS-vírus (pox, afrikai sertéspestis vírusa) nukleokapszidja a cytoplasmában épül össze. A replikáció és az összeépülés helyének közelsége révén a vírus így próbálja minél gyorsabban védelem alá helyezni az utódvirionok nukleinsavát.

A nukleokapszid és a virusgenom egymásra találását a vírus által kódolt ún. nukleinsavszignál teszi lehetővé. Ez a jelző rendszer még akkor is kitűnően működik, ha a replikáció és a nukleokapszid-előállítás helye meglehetősen távol van egymástól (pl. több DNS-vírus nukleokapszidja a cytoplasmából jut be a sejtmagba, ahol a virusgenom replikációja zajlik (herpesz-, adeno-, parvo-, papillomavirusok).

A nukleokapszid összeépülése stratégiai fontosságú a vírus számára. A komplett (fertőzőképes) és az inkomplett (nem fertőzőképes) utódvirionok aránya ugyanis attól függ, hogy az összeépülés ideje alatt mennyi kész nukleinsav és nukleokapszid állt rendelkezésre. Ha kevés a nukleinsav, az elkészült nukleokapszidokba nem kerül vírusgenom, ezért inkomplett virionként hagyják el a sejtet. Ha kevés a nukleokapszid, az elkészült utódvírus-genomok nem találnak menedéket a nukleáz enzimek elől, és ezért megemésztődnek. Mindkét esemény zsákutca a vírus számára, amit a transzkripciós, transzlációs és replikációs folyamatok időbeli és koncentrációfüggő koordinálásával igyekszik elkerülni. Ennek a szabályozásnak a nehézségét jelzi, hogy egy átlagos vírusszaporodás során az inkomplett utódvirionok aránya megközelíti a 60–70%-ot.

A nukleokapszid-összeépülés megtörténhet úgy, hogy a kapszomerekből összeépülő üres nukleokapszidba (prokapszid) „becsúszik” a vírusgenom (A), illetve úgy, hogy a nukleokapszid fehérje egységei körbeépítik a vírusgenomot (B). Mindkét folyamatot a specifikus felépítő (scaffolding) fehérjék irányítják (88. ábra).

88. ábra - Vírusok nukleokapszidjainak összeépülése (magyarázat a szövegben)

kepek/88abra.png


Egyes vírusok a replikációs stratégiájukhoz nemcsak genetikailag kódolt, de működőképes „kész” enzimeket (transzkriptázokat) is kénytelenek biztosítani. Ezek az enzimek is az összeépülés során kerülnek be az utódvirionokba.

Burkos vírusok utódvirionjainak a nukleokapszidjai a sejtmembránokon történő áthaladás során tesznek szert burokra.

A vírusburok és a nukleokapszid összeépülése azokon a sejtmembránrészeken zajlik, amelyekbe már előzetesen – a transzlációt követően – beépültek a víruseredetű burokfehérjék (glükoproteinek) és amelyek belső felszínén már koncentrálódtak a mátrixproteinek is. A mátrixproteinek megerősítik a kapcsolatot a nukleokapszid és a burok között. A herpesvirusok még egy ún. belső burkot is felvesznek a maghártyán való áthaladás során; nagy mannóztartalma elengedhetetlen a membránfehérjék glükolizációjához. Ez a belső burok egyben egyedülálló védelmet is nyújt a nukleokapszidnak a cytoplasma proteolytikus enzimeivel szemben, a vírus kiszabadulásáig. A coronavirusok és a bunyavirusok burkaikat az endoplasmatikus retikulumhálózat és a Golgi-apparátus membránjaiból nyerik.

Virionok kiszabadulása a sejtből

Bizonyos esetekben az utódvirionok nem hagyják el a sejtet, hanem a sejttel együtt élnek, és csak a sejt halálakor vagy membránjának drasztikus sérülése esetén jutnak az extracelluláris térbe. Ezeket a vírusokat sejthez kötött, (cell-assosiated) vírusoknak nevezzük (pl. Gammaherpesvirinae).

Az utódvirionok a sejtet vagy aktív folyamattal, exocytosissal, bimbózással(budding), vagy a sejt lízisét követően passzív úton hagyják el.

A legtöbb nem burkos vírus aggregálódik az összeépülés helyén a cytoplasmában vagy a sejtmagban, és rendszerint egyszerre hagyják el a sejtet, amikor a sikeres vírusszaporodás következményeként kialakul a sejt lízise (pl. picornavirus) vagy a lassú degenerálódást követően a sejt halála (pl. parvovirus), illetve az apoptózisnak nevezett, programozott sejthalál (pl. adenovirus).

A burkos vírusok többsége bimbózással (budding) hagyja el a sejtet, az összeépülést követően. A bimbózás a sejtmembránnak mindig azokon a helyein következik be, amelyekbe már beépültek a vírus felszíni glükoproteinjei. Ezért a bimbózás már az összeépüléssel kezdetét veszi. Ez azért is fontos, mivel a fertőzött sejt membránja most már kitűnő célpont a szervezet immunsejtjei számára, a membránba integrálódott vírusfehérjéknek (antigéneknek) köszönhetően (89. ábra).

89. ábra - Vírusok kiszabadulása az eukaryota sejtből bimbózással (budding)

kepek/89abra.png


A bimbózás során az utódvirionok folyamatosan hagyják el a sejtet, és az ebből eredő membránkárosító hatás lényegesen eltér az egyes víruscsoportok között. Amíg a tógavirusok, paramyxovirusok és rhabdovirusok bimbózása gyors, fatális cytolysist eredményez, addig az arenavirusok és a retrovirusok kiszabadulása csak csekély mértékű, gyakran észrevehetetlen membránkárosodással jár.

Az alphaherpesvirusok és a paramyxovirusok membránkárosító hatásának eredményeként a szomszédos sejtekben membránfúzió, syncytium is kialakul. A syncytium membránalagútjaiban a vírus biztonságos lehetőséget kap a szomszédos sejtek közötti extracelluláris terjedésre anélkül, hogy az ellenanyagokkal találkozna a szervezetben.

A herpesvirusok esetében bizonyították, hogy különböző vírusfehérjék felelősek az intercelluláris, illetve az extracelluláris kiszabadulásért.

A kiszabadulás alternatív formái

Herpesvirusok szaporodása során előállhat olyan eset, amikor az utódvirionok phagocytosisa során a fertőzött sejt lizoszómái „szétrobbantják” magukat. Ezeknek az „öngyilkos lizoszómáknak” az emésztő enzimei most már a sejt lízisét is meggyorsítják.

A T-bakteriofágok egyik késői gén terméke, a lizozim enzim. Amikor az első fágok összeépülése megkezdődik, ezek a lizozim enzimek elkezdik emészteni a baktérium sejtfalát és a fágok nagy része az így kialakult sejtfalhiányokon keresztül hagyja el a baktériumot, mielőtt a lízis bekövetkezne.

Mivel in situ körülmények között, a növényi sejtben nem alakul ki lízis a vírusfertőzés hatására, a növényi vírusok az intercelluláris sejtfalkapcsolatokon keresztül terjednek sejtről sejtre. Ezzel magyarázható több növényi vírus „mozaikszerű levélkárosítása”, pl. a dohány-mozaikvirus által okozott elváltozás is.

A vírus és környezetének kölcsönhatásai

A vegetatív vírus számára a „környezet” az a sejt, amelyben szaporodik. A sejtet elhagyó virion környezetén azt a „miliőt” értjük, amely közvetlen hatással van a vírus létfeltételeire (a vírussal kapcsolatba kerülő másik vírus is környezeti tényezőnek tekinthető). Éppen ezért egy adott vírus életfeltételeit vizsgáló in vitro kísérletek eredményeit legtöbbször csak tájékozódó jellegűnek lehet tekinteni az in vivo-in situ körülményekre vonatkoztatva.

A vírust – más élőlényekhez hasonlóan – a környezet részéről állandó evolúciós kényszerhatás éri, ezért folyamatosan küzdenie kell a fennmaradásáért. Ez a küzdelem egyaránt zajlik térben és időben is. A térben zajló küzdelem célja a multiplikáció lehetőségének megteremtése egy vagy több faj sejtjeiben. Az időben zajló küzdelem célja a már megszerzett optimális életfeltételek megtartása, lehetőleg minél több ideig. A sikeres küzdelem valójában alkalmazkodást jelent a változó környezetei feltételekhez. Ennek a sikernek többnyire az a záloga, hogy változás áll be a vírus genotípusában és/vagy fenotípusában. Az alkalmazkodás tehát változás. Ebben a helyzetben függőségi viszonyok alakulnak ki a vírus és környezete között (13. és 14. táblázat).

13. táblázat - A vírus és környezetének függőségi viszonyai

Függőségi viszonyok

A

VÍRUS

a nukleinsav replikáció biokémiai következményei

B

VÍRUS–VÍRUS

más vírussal kerül kapcsolatba

C

VÍRUS–SEJT

a sejttel kerül kapcsolatba

D

VÍRUS–SZERVEZET

a szervezettel és az immunrendszerrel kialakuló kölcsönhatás

Függőségi viszonyok típusai

A ) mutáció

B) rekombináció

komplementáció

fenotípusos keveredés

interferencia

exaltáció

C) interferon

latens fertőzés

perzisztens fertőzés

onkogenitás

CPE (lyzis)

D) akut fertőzés

perszisztens fertőzés


14. táblázat - A vírusok geno- és fenotípusában bekövetkező változások

GENOM

FENOTÍPUS

öröklődő (ismétlődő esemény)

nem öröklődő (egyszeri esemény)

    

mutáció

1 genom

rekombináció

2 genom

komplementáció

(enzim)

 

fenotípusos keveredés

(fehérje)

  

interferencia

(enzim/fehérje)

vírus/virus

(génátrendeződés)

(szegmentátrendeződés)

vírus/sejt

(integráció)


Ezeknek a változásoknak az eredménye lehet előnyös, hátrányos vagy semleges mind a vírusra, mind a környezetre nézve. A vírusnak, mint parazitának, evolúciós szempontból az a leghasznosabb, ha a változás számára előnyt, a környezet számára pedig legalább semleges hatást biztosít. Ez az ideális állapot azonban rendkívül ritkán következik be (pl. latens fertőződés alatt).

A természetben a vírus és környezetének kölcsönhatását a folyamatos küzdelem jellemzi (ugyanis a környezetet ért hátrányos hatás újabb változtatásra kényszeríti a környezetet, ami ismételt kihívást jelent a vírusnak.).

Mutáció

A vírus genetikai anyagában bekövetkező nukleotid változást mutációnak nevezzük.

A természetben a mutáció állandóan zajló folyamat, melynek létrejöttét vagy a fenotípus változásain, vagy a genom analízise során észlelhetjük. A víruspopulációkban az egyedeket érő mutációk sokasága biztosítja azt a variabilitást, ami kulcsfontosságú a populáció fennmaradásához.

A mutáció lehetőséget teremt a vírusnak, hogy genotípusát és/vagy fenotípusát alkalmassá tegye új, előnyös környezeti kapcsolatokra, mint pl. a rekombináció, komplementáció, interferencia, de ugyanakkor nagy veszélyt is jelenthet, mivel elveszítheti az addig megszerzett evolúciós előnyét, ami pl. a letális vagy feltételesen letális mutációk során bekövetkezik.

A multiplikáció során egy „szülő” vírus több millió utódviriont hoz létre, többnyire rövidebb idő alatt, mint ami alatt a szaporodását biztosító sejt egyszer osztódna. A sejtgenomhoz viszonyítva ebben a nagy egyedszámú utódpopulációban a mutációk előfordulásának aránya nagyságrendekkel magasabb lesz, mivel a rendkívüli intenzitásra kényszerített víruspolimeráz enzim „tévedési aránya” is megnő.

Pontmutációk. A tévedés (átírási hiba) valójában hibás nukleotid beépítését jelenti, ami a pontmutációk leggyakoribb kialakulási módját okozza (15. táblázat).

15. táblázat - A vírusokban bekövetkező mutációk típusai és eredményei

Mutáció típusa

Folyamat a genomban

Eredmény a fenotípusban

Pontmutáció

1 nukleotidváltozás

változó

Sorozatos pontmutáció

több nukleotidváltozás

többnyire inaktív fehérje (L)

Szakasz kiesése (deléció)

nukleotidok esnek ki

fehérje nem alakul ki (L)

Szakasz betoldása (inzerció)

nukleotid épülhet be

fehérje nem alakul ki (L)

Visszamutáció

1 mutáns nukleotidot

újabb mutáció éri

nem észlelhető

Frameshift mutáció

eltolódás a transzláció leolvasó fázisában

fehérje inaktív (L) új variáns keletkezik (pl. RSV)

Szupresszor-mutáció

génszabályozás

felbomlik

változó (L)

Misszensz-mutáció

kódon változik

változó (más aminosav keletkezik)

Nonszensz-mutáció

kódon értelmetlen

fehérje nem alakul ki, inaktív

Néma mutáció

1 nukleotidváltozás

nem észlelhető

Feltételesen letális mutáció

kódon megváltozik

a fehérje csak bizonyos környezeti „feltételek” között aktív

Letális mutáció

kodon megváltozik

a fehérje vagy nem alakul ki.

vagy inaktív (L)

L= letális hatás


A sejt DNS-ének másolását végző polimeráz enzimek „tévedéseire” visszavezethető mutációk nagy részét a sejtmagban található ún. javítóenzimek (pl. ligáz) korrigálják, a megfelelő nukleotidok kicserélésével. Ezt a „javítómechanizmust” (proofreading) azok a vírusok is igénybe veszik, amelyek a sejtmagban végzik replikációjukat (DNS/2-, DNS/1-vírusok, a pox- és az afrikai sertéspestis vírusa kivételével). A replikáció hiánya miatt a cytoplasmában nincs javítómechanizmus, ezért az itt szaporodó vírusok nem tudják korrigáltatni a nukleinsav- polimerizáció során kialakult átírási hibákat (pontmutációkat).

Ezzel magyarázható, hogy a mutációk előfordulásának gyakoriságát kifejező mutációs ráta (átírási hiba/beépült nukleotid) a sejtben a legalacsonyabb (10-8 – 10-11), ennél magasabb a magban szaporodó DNS-vírusokban (10-5) és legmagasabb a cytoplasmában szaporodó RNS-vírusokban (10-3–10–4). Az RNS-vírusok esetében ez azt jelenti, hogy minden ezredik nukleotidbeépítésnél hiba történt (ami pl. a 11 kb. genommal rendelkező vesiculovirusok esetében azt eredményezi, hogy az utódvirionok között nem lesz két egyforma!).

A javító (proofreading) mechanizmuson kívül az ún. visszamutáció (back mutation) is segít az átírási hibák korrigálásában. Visszamutáció akkor fordul elő, ha az átírási hibát egy újabb mutáció éri, és szerencsés esetben ez az „eredeti” aminosav sorrend helyreállítását jelentheti.

Indukált mutációk. A környezeti hatásokra kialakuló mutációt indukált mutációnak nevezzük. Indukált mutáció létrehozható kémiai mutagénekkel, sugárzással, hőmérséklet-, pH-, ozmolaritásváltoztatással. Az indukált mutációk esetében a mutációs ráta elérheti a 10-2-10–3 értéket is (vagyis minden századik nukleotid beépítés hibás).

Deléciók és inzerciók. A vírus genomjában bekövetkezett mutáció érinthet egy nukleotidot (pontmutáció) vagy több nukleotidot is (sorozatos pontmutáció), valamint kiterjedhet kisebb-nagyobb összefüggő szakaszra is. A szakaszkieséssel járó mutációt deléciónak, a szakaszbetoldással járót inzerciónak nevezzük.

Ha a deléció a virulenciagéneket érinti, ún. deléciós vakcinatörzsekhez juthatunk, és éppen a delécióból adódóan nyílik lehetőség olyan diagnosztikai módszer kifejlesztésére, amelyik különbséget tud tenni a vakcinatörzs és a vad vírusok között. Ma már több vírus okozta betegség elleni mentesítési programban használnak ilyen deléciós vakcinákat (Aujeszky-betegség, IBR, klasszikus sertéspestis).

A deléciók és az inzerciók a vírusgenomban eltolják a transzláció normális leolvasó fázisát, és ez gyakran működésképtelen fehérjék keletkezését eredményezi (frameshift mutációk). A replikációs enzimeket érintő deléció vagy inzerció többnyire letális mutációhoz vezet. A delécióval elvesztett tulajdonság a mutáció javítómechanizmusaival nem állítható vissza (erre legfeljebb a rekombináció adhat lehetőséget). Az inzerció mindig valamilyen génszakasznak a kárára történhet, ami legtöbb esetben vagy a replikációs, vagy az adszorpciós képesség megszűnéséhez vezet (pl. sarcomát okozó vírusokban az „onc” gén a polimeráz enzim helyére épült be, ezért ezek a vírusok legtöbbször önállóan nem képesek szaporodni).

A mutáció élettani hatása (eredménye a fenotípusra) alapvetően attól függ, hogy a genom melyik génszakaszára lokalizálódott, de kifejeződését egyes esetekben meghatározhatja a genom többi génjének aktivitása is (szuppresszor mutáció).

A fenotípusban a mutáció vagy észlelhető élettani változást okoz, vagy eredményének nem lesz kimutatható élettani hatása (néma mutáció).

Az észlelhető elváltozás típusa alapján megkülönböztetünk misszensz (eltévesztett) és nonszensz (értelmetlen) mutációt. A missszensz mutáció egy bizonyos aminosavat meghatározó kodont egy másik aminosavnak megfelelő kodonra változtat át. Nonszensz mutáció során egy kodon úgy alakul át, hogy többé egyetlen aminosavat sem kódol. Az esetek többségében ez azt jelenti, hogy az aminosavkodon „stop” kodonra változik. Ha ez a stop kodon létfontosságú fehérje kialakulását hiúsítja meg, a mutáció letálissá válik.

Az észlelhető mutáció eredményét vagy a vírus élettani tulajdonságainak változásain keresztül és/vagy a vírusfehérjék analízise (pl. elektroforézis) során figyelhetjük meg.

Néma mutáció akkor fordulhat elő, ha a megváltozott triplet – a genetikai kód degeneráltsága miatt – nem hoz létre más aminosavat, vagy ha a mutáció „nem lényeges” aminosav kodonját érintette. A néma mutációk szekvenciaanalízissel felismerhetők és azonosíthatók.

A vírus legfontosabb élettani tulajdonsága a multiplikáció. Ha a multiplikációért felelős génekben kialakuló mutáció miatt a vírus szaporodása csak bizonyos környezeti feltételek között valósulhat meg, feltételesen letális mutációról beszélünk. Ezek közül legrészletesebben a hőérzékeny mutációkattanulmányozták.

Hőérzékeny mutáns (Ts, temperature sensitive) vírustörzsek esetében, a replikáció csak egy meghatározott hőmérsékleten mehet végbe, mivel a mutáció következtében más hőmérsékleten a polimeráz enzim működése gátolt. Hideg mutánsok esetében (pl. Vnukovo 32 veszettség elleni vakcinatörzs) a vírus-polimeráz enzim a testhőmérsékletnél alacsonyabb hőfokon (32 °C) aktív, ezért a szervezetben szaporodása gátolt.

Letális mutáció során a vírus szaporodása teljes mértékben blokkolt, ezérta letális mutánsok izolálása nehézségbe ütközik. A replikációs enzimek és/vagy az adszorpciós fehérjék inaktiválását okozó mutációk mindig letálisak.

A mutáció következtében kialakuló további észlelhető fenotípus- (tulajdonság-)változások közül a legfontosabbak:

Plakkmutánsok (pl. az Aujeszky-betegség vírusának virulens törzsei „nagy” plakkot, a K–61 vakcinatörzs ugyanakkor „kicsi” plakkot képez).

Gazdafajmutánsok (pl. macska parvovirusa mutáció révén adaptálódott a kutyához és a nyérchez),

Attenuált mutánsok (a virulens törzsekkel ellentétben, a szervezetben elszaporodva nem okoznak jelentős klinikai tünetekben megnyilvánuló megbetegedést).

A szervezetben szaporodó vírust és utódait az immunrendszer és a szöveti struktúra részéről olyan szelekciós nyomás éri, hogy még az életképes virionok sem jutnak el minden esetben a szaporodásukhoz nélkülözhetetlen célsejtekhez. Mivel laboratóriumi körülmények között ezek a szelektív hatások a kémcsőben nem érvényesülnek, a sejtkultúrákban szaporított vírusok közül a kevésbé életképes mutánsoknak is van esélyük a túlélésre. A sorozatos passzálások során ezért csökkenhet a vad vírustörzsek virulenciája vagy a szaporodóképessége. Ez a hatás tovább fokozható, ha a vírust „idegen” sejtben próbálják szaporítani (pl. lapinizálás, avinizálás). Ezeket a jelenségeket használják fel attenuált vakcinatörzsek előállítására is.

Vírus–vírus kapcsolatok

A továbbiakban részletezésre kerülő vírus–vírus kapcsolatok közös jellemzője, hogy kialakulásukhoz mindig szükség van egy sejtre is, ugyanis ezek a kapcsolatok kizárólag a vírusszaporodás valamelyik fázisában jönnek létre. Még abban a ritka esetben is, amikor csak egy vírus fertőz egy sejtet, a számos utódvirion óhatatlanul kapcsolatba kerül egymással. Ezért a vírus–vírus kapcsolatok döntően a rokonvírusok között fordulnak elő, bár elvétve nem rokon vírusok között is kialakulhat kapcsolat (pl. adenovirus és dependovirus között).

A vírus–vírus kapcsolat a genom (rekombináció) és a fehérjék szintjén (komplementáció, fenotípusos keveredés, exaltáció, interferencia) jöhet létre (14. táblázat).

Vírus–vírus kapcsolat a genom szintjén

Rekombináció

Amikor két vírus szimultán fertőz egy sejtet, a szintetizálódó utódvirionok nukleinsav szálai között, különböző genetikai rekombinációra nyílik lehetőség, úgymint: génátrendeződés, újrarendeződés, reaktiváció. A vírusnukleinsav és a sejtgenom közötti rekombinációk eredménye az integráció és a pseudovirus.

A rekombináció létrejöttének alapvető feltételei:

• egy sejtben legalább két vírusgenom (vagy 1 vírus- és 1 sejtgenom) legyen jelen egymáshoz közel,

• legalább 10–40 nukleotidhomológia legyen a nukleinsavakban,

• szegmentált genommal rendelkező vírusoknál a cserélődő nukleinsav-szegmentek azonosak legyenek.

Génátrendeződés (intramolekuláris rekombináció). Elsősorban rokon vírusok között létrejövő genetikai kapcsolat, melynek során a genomok akár 50–60%-a is kicserélődhet (herpesvirus). A génátrendeződés oka, hogy az egymáshoz közel kerülő két vírusgenom replikációja során a vírusreplikáz enzimek szálat tévesztenek, és „átugranak” a szomszédos nukleinsavszálra, ahol mit sem sejtve tovább folytatják az átírást. A folyamat eredményeként olyan utódvirionok jönnek létre, amelyek genetikai anyaga vegyesen tartalmazza a két „szülői” genom információját. Az esetek döntő többségében ez nem vezet új tulajdonságok megjelenéséhez, mivel a rekombinációban részt vevő genomok között is nagy volt az azonosság (ez tette lehetővé a száltévesztést) (90. ábra).

90. ábra - A rekombináció típusai (magyarázat a szövegben)

kepek/90abra.png


A génátrendeződés elsősorban DNS-vírusok között fordul elő, de kivételesen megfigyelték egyes RNS-vírusoknál is (ragadós száj- és körömfájás vírusa, poliovírusok).

Nem rokon vírusok között a nukleotidhomológia hiánya miatt nincs lehetőség a génátrendeződésre. Ez alól kivételt képez, az adeno- és papovavirusok (SV-40) között megfigyelt génátrendeződés.

Újrarendeződés (szegmentátrendeződés, reassortment). Az újrarendeződés nagy gyakorisággal fordul elő olyan rokon RNS-vírusok között, amelyek genomja szegmentált. Szegmentált genommal a következő szimpla és dupla szálú RNS-vírusok rendelkeznek: birna-, arenavirusok (2 szegment), bunyavirusok (3 szegment), orthomyxovirusok (8 szegment), reovirusok (10–12 szegment). A rekombinációhoz szükséges nukleinsavhomológia biztosítása érdekében csak azonos szegmentek cserélődhetnek ki. Mivel egy szegment többnyire egy gént kódol, ez a rekombináció igen jelentős változást okozhat a szegmentált vírusoknál, különösen az influenzás megbetegedésekért felelős orthomyxovirusoknál (90. ábra).

Az orthomyxovírusok virulenciájáért és fertőzőképességéért a vírus burkában található neuraminidáz (NE) és hemagglutinin (HA) fehérjék a felelősek, ezért minden olyan változás, ami az őket kódoló génszakaszokat érinti, rendkívül jelentős a vírus életében. Ezeket, a fenotípusban (HA, NE epitópok) is megjelenő változásokat két csoportra osztjuk. Antigénsodródás (drift) és antigéncsuszamlás (shift) (91. ábra).

91. ábra - Orthomyxovírusok rekombinációja (antigén csuszamlás)

kepek/91abra.png


Antigénsodródásról akkor beszélünk, ha az egymást követő vírusgenerációk HA és NE fehérjéket kódoló génszakaszában folyamatosan csak minimális változások keletkeznek, többnyire pontmutációk hatására. Ezzel a generációrólgenerációra bekövetkező, de kismértékű változással a vírustörzs (populáció) pillanatnyi előnyökhöz jut a környezettel (pl. az immunrendszerrel) szemben és ez biztosítja a törzs túlélését a természetben (szervezetben), nemegyszer az új törzs születéséig (az antigénsodródás pl. a lovak fertőző arteriitésének vírusainál olyan hatékony, hogy az egy sejtben keletkező utódvírusok minden egyes generációja más-más antigénszerkezettel rendelkezik, ezért az immunrendszernek nem jut elég idő semlegesítésükre).

Antigéncsuszamlás akkor következik be, ha hirtelen, egy generációváltáson belül, olyan mértékű változás érte a genomot, ami teljesen új HA és/vagy NE kialakulásához vezet. Az antigéncsuszamlás legtöbbször szegment-újrarendeződés hatására alakul ki és olyan új törzsek (szubtípusok) születését is okozza, amelyek a kontinensekre kiterjedő humán influenzafertőzésekért (pándemiákért) felelősek (ilyen jelentős mértékű szegment-újrarendeződés átlag 10 évenként következik be). Feltételezhetően a szegment-átrendeződés okolható a háziállatok (lovak, sertések, madarak) között időnként fellépő pándémiás influenzamegbetegedésekért is (91. ábra).

Az orthomyxovirusoknála szegment újrarendeződés, az emberi és állati vírustörzsek, valamint a különböző állatok (vadkacsa, sirály, fóka) vírustörzsei között is létrejöhet (ezért időnként a humán törzs „lemegy” egy állatba pl. sertésbe, kacsába, és annak az állatfajnak a saját orthomyxovirusával rekombinálódva új HA és NE antigénkészlettel visszatér).

Reaktiváció (kifoltozódás)

A reaktiváció az a rekombinációs folyamat, ami lehetőséget biztosít a vírusnak, hogy a korábbi mutációk vagy rekombinációk által sérült vagy evolúciós szempontból hátrányos genomszakaszát „kifoltozza” és az esetleges inaktív genomot újra (re!)aktiválja (90. ábra). A reaktivációnak két formája ismert: a keresztreaktiváció (marker rescue) és a többszörös reaktiváció.

Keresztreaktivációról akkor beszélünk, ha a két rokon vírus között lezajló reaktiváció olyan, többnyire letális vagy feltételesen letális mutációt javít ki, amelyik az egyik vírus meghatározott genetikai szakaszában (pl. restrikciósenzim- fragmentumban) fordult elő. Mivel vírustörzsek azonosításában a restrikciós fragmensek többnyire marker értékű szakaszok, a folyamatot markerkifoltozódásnak (marker rescue) is nevezik. A keresztreaktivációt nem rokon vírusok között is megfigyelték. A keresztreaktiváció révén, az eredetileg sérült genomú szülői vírus is örökítheti genetikai információját. Ez a jelenség gyakran fordul elő a pox- és orthomyxovirus-fertőzések során (90. ábra).

Többszörös keresztreaktiváció akkor fordul elő, ha két rokon vírustöbb, de nem azonos helyen sérült genomszakaszai kölcsönösen kicserélődnek (kifoltozódnak), és ennek eredményeként most már mindegyikük fertőző utódvírusokat hoz létre. Ez a vírus számára előnyös evolúciós lehetőség, ugyanakkor komoly veszélyt is rejt magában. Ha egy állatot rövid időn belül két különböző attenuált vakcinával oltunk, előfordulhat, hogy a más-más genetikai szakaszokon sérült (attenuálódott) vakcinatörzsek a keresztreaktiváció révén kifoltozódnak és virulens utódvirionokat hoznak létre, amelyek már súlyos, esetenként halálos kimenetelű megbetegedést okozhatnak (ennek elkerülésére a rövid időn belüli ismételt oltásnál lehetőleg ugyanazt a vakcinatörzset használjuk).

Vírus és sejt közötti rekombinációk

A multiplikáció során a sejtmagba bejutó vírusnukleinsavnak lehetősége adódik, hogy rekombinációs kapcsolatba lépjen a sejt genomjával.

Integrációnak nevezzük azt a folyamatot, amelynek eredményeként a vírus nukleinsava épül be a sejt genomjába. Az integrálódott vírust provírusnak nevezzük. A provírus nem azonos a szintén a sejt genomjában helyeződő endogén vírussal (az endogén vírusról nem képződnek virionok, míg a provírusról igen). Az integrációnak komoly szerepe van a latens fertőzések kialakításában (lásd. később).

Pseudovírus keletkezik akkor, ha sejtgenomszakasz épül be a vírus nukleinsavába. Ez többnyire letális a vírusra nézve.

Vírus–vírus kapcsolat a fehérje szintjén

A következő vírus–vírus kapcsolatok közös jellemzője, hogy a kapcsolat nem a gének, hanem a géntermékek (fehérjék) között jön létre, ezért a mutációval és a rekombinációval ellentétben ezek nem öröklődő, egyszeri események. A kapcsolatok egy része támogató jellegű, amikor a defektes vírus lehetőséget kap az életben maradásra (komplementáció, fenotípusos keveredés, pszeudotípus), más esetben viszont erőteljesen gátolt a kapcsolatban részt vevő valamelyik (többnyire a komplett) vírus szaporodása (interferencia) (14. ábra).

Komplementáció

A komplementáció során a kapcsolatban részt vevő defektív vírus a komplett vírus enzimeit használja fel szaporodásához. A komplementáció a defektív virionok túlélésének és fennmaradásának leggyakoribb eszköze.

Komplementáció rokon vírusok között. A Ts-mutáns (hidegmutáns) vírustörzsek polimeráz enzimje a feltételesen letális mutáció következtében testhőmérsékleten nem tud aktiválódni, csak pl. 32 °C-on. Ezért a Ts-mutánsok testhőmérsékleten nem szaporodnak. Ha ez a Ts-mutáns a sejtben kapcsolatba kerül egy replikálódó komplett rokon vírussal, akkor annak polimeráz enzimét felhasználhatja saját replikációjához. Ily módon a komplementáció biztosítja a hőmutánsnak azt a lehetőséget, hogy testhőmérsékleten is létrehozza utódait. Komplementációval két rokon vírushőmutáns is létrehozhat komplett utódvirionokat, ha kölcsönösen használják egymás polimeráz enzimét. Erre azonban csak akkor van lehetőség, ha a két hőmutáns enzimei más-más helyen sérültek.

Inaktivált virulens és élő avirulens rokon vírusok között is létrejöhet a komplementáció, ha egy időben vannak jelen a sejtben. Ennek feltétele, hogy az inaktiváció ne érintse a vírus adszorpciós fehérjéit, „csak” a multiplikációért felelős enzimeit (különben az inaktivált vírus nem tudna bejutni a sejtbe). Ebben az esetben a replikálódó élő avirulens vírus polimeráz enzimei, a genetikai rokonságnak köszönhetően, akadály nélkül szintetizálják az inaktivált vírus virulenciáért felelős fehérjéit is, aminek eredményeként a sejtben élő, virulens utódvirionok jönnek létre. Ezt a jelenséget a himlővirusok (poxvirusok) között figyelték meg, és ennek a felismerésnek köszönhető az a nemzetközileg elfogadott határozat, hogy virulens vírustörzsből nem szabad vakcinát készíteni.

Komplementáció nem rokon vírusok között. A Parvoviridae családba tartozó dependovirusok az adeno- és herpesvirusok polimeráz enzimeit használják fel saját replikációjukhoz, mivel genomjuk olyan rövid, hogy nem jutott hely a saját replikáz enzim kódolásához. Ennek a komplementációs lehetőségnek viszont az az ára, hogy a dependovirusok kizárólag az adeno- és/vagy herpesvirusok jelenlétében képesek életben maradni. A dependovirusokat támogató herpesz- és adenovirusokat korábban „helper (segítő)” vírusoknak nevezték, és a dependo (függő) elnevezés is a komplementáció jelenségére utal.

Fenotípusos keveredés

A fenotípusos keveredésről akkor beszélünk, ha az egy időben, egymás mellett replikálódó rokon vírusok olyan utódokat hoznak létre, amelyekben keverednek a szülők struktúrproteinjei, ugyanakkor genomjukban külön-külön, tisztán megőrizték az egyes szülők genetikai információját (92. ábra).

92. ábra - Fenotípusos keveredés, transzkapszidáció (magyarázat a szövegben)

kepek/92abra.png


A fenotípusos keveredés abban különbözik a komplementációtól, hogy itt nem enzimet, hanem strukturális fehérjét vesz át az egyik vírus a másiktól. A fenotípusos keveredés különleges jelentőségét az adja, hogy nem rokon vírusok között is gyakran előfordul (habár ezekben az esetekben az evolúciós kapcsolat kimutatható).

Az orthomyxovírussal és paramyxovirussal egy időben fertőződött sejtben olyan utódvirionok is keletkeznek, amelyek burkában keverten jelennek meg a két vírus burokfehérjéi. A Rous-szarkóma-vírus (RSV) multiplikációja során mindig egy madárleukózis-vírus (ALV) teljes burkát ölti magára, mivel saját burokfehérjéit nem tudja szintetizálni (a sarcoma kialakulását elősegítő sarc. gén ugyanis a burokfehérjéket kódoló génszakaszba épült be). A fenotípusos keveredésnek köszönhetően az RSV leukózisvirusként lép be a sejtbe, és sarcomavirusként hajtja végre annak malignus transzformációját.

A fenotípusos keveredés olyan egyedi felszíni struktúrát is érinthet, mint az adenovirusok fiberjei vagy kapszidjai. Két különböző típusú adenovirussal történő fertőzéskor az utódvirionok egy részében kevert típusú fiberek vagy kapszidok alakulnak ki.

A fenotípusos keveredés különleges formája a transzkapszidáció, amikor az utódvirion az egyik szülő vírus kapszidját és a másik szülő vírus genetikai állományát örökli. (Pl. poliovírus és coxsackievirus közös fertőzésekor kialakultak olyan utódvirionok, amelyek coxsackievirus kapszidot és poliovirus-genomot tartalmaztak. Hasonló jelenséget figyeltek meg humán adenovirus-fertőzés során is, amikor az egyes utódvirionok az adenovirus 2 szülői kapszidját és az adenovirus 7 szülői genetikai anyagát örökölték, 92. ábra).

Pszeudotípus

Pszeudotípus akkor alakul ki, ha kizárólag a burokfehérjék keverednek össze a burokban (pl. VSV+retrovirus).

Interferencia

Interferenciának azt a folyamatot nevezzük, amikor egy vírus adszorpcióját vagy replikációját egy másik vírus gátolja. Az interferencia három típusát ismerjük: adszorpciós interferencia,autointerferencia és heterológ interferencia. Az adszorpciós- és autointerferencia kizárólag a rokonvírusok, a heterológ interferencia a nem rokon vírusok közt jön létre.

Adszorpciós interferencia

Adszorpciós interferencia akkor alakul ki, ha a sejtfelszínre először érkező vírus a receptormolekulák lekötésével megakadályozza a következő vírus (vírusok) adszorpcióját. Az először érkező vírust ezért interferáló vírusnak nevezzük. A jelenség kizárólag szoros rokonságban álló vírusok között fordul elő, mivel az antireceptormolekulák legkisebb különbsége esetén a másodszorra érkező vírusnak már lehetősége nyílna az adszorpcióra olyan receptormolekulákon, amit az első vírus nem tudott lefoglalni. A jelenséget leggyakrabban ugyanazon vírus defektív és komplett partikulái között figyelték meg, amikor a sejtfelszínhez először érkező defektív (vagy inaktivált) vírusok megakadályozták a sejt felülfertőződését a komplett (pathogen) virionokkal.

Az adszorpciós interferencia ép, érintetlen adszorpciós fehérjéket igényel. Ezért egy inaktivált vírus kizárólag akkor képes interferenciára, ha az inaktiválás nem érintette az adszorpciós fehérjéket, csak a genomot (ezért tudja az UV fénnyel inaktivált baromfipestis-vírus megakadályozni az élő baromfipestis-vírussal történő felülfertőzést).

Az adszorpciós interferencia evolúciós szempontból mindenképpen hátrányos a vírusnak, mivel a defektív (inaktivált) partikulák nem tudnak multiplikálódni, ezért a fajfenntartás szempontjából zsákutcát jelentenek. A Rous-sarcoma-vírus (RSV) és a baromfileukózis-vírus (ALV) együttes fertőzésekor, ha az ALV előbb érkezik a sejtreceptorokhoz, az ALV-vel azonos burkot (antireceptor fehérjét) viselő RSV-nek nem lesz lehetősége az adszorpcióra, ami a pusztulását jelenti (itt kell drámai árat fizetnie az ALV-től komplementációval megszerzett burokfehérjékért).

A fertőző betegségek elleni védekezésben az adszorpciós interferenciát a javunkra fordíthatjuk. Ha pl. attenuált vakcinával oltjuk az állatot, az attenuált vakcinavírus és utódvirionjai lefoglalják a szervezet fogékony sejtjein levő receptorokat, ezért a vakcinázás után érkező „utcai” vírus nem tudja létrehozni a fertőzést. Ez az interferencia még tovább fokozható, ha az attenuált vakcinavírust, a fertőzés bemeneti kapujában levő sejtekre juttatjuk. Egyes herpesz- és coronavirusok elleni intranasalis vakcinázással a vakcina hatékonysága számottevően megemelhető az intramuscularis oltáshoz viszonyítva (pl. Aujeszky-betegség, macskák fertőző peritonitise).

Az interferencia addig érvényesül, ameddig az interferáló vakcinavírusok szaporodnak (adszorbeálódnak), és hatékonyságát az attenuált és utcai vírusok mindenkori mennyiségi viszonya szabja meg (a második vírusnak az adszorpcióhoz elméletileg elegendő egy szabad hely a sejtfelszínen található több tízezer receptorból).

Autointerferencia

Autointerferenciáról akkor beszélünk, ha vírus „saját” utódvirion társaival interferál. Ez a jelenség mindig sejten belül, a multiplikáció közben alakul ki a defektív és komplett utódvirionok között. A vírus multiplikációja során keletkező utódvirionok döntő többsége (nemegyszer 60–70%-a) inkomplett, defektív partikula lesz. Ezek az inkomplett virionok képtelenek a további multiplikációra, mivel esetükben a defektivitás a genomjuk sérülését vagy hiányát jelenti. A defektív virionok több módon gátolják a komplett viriontársak megszületését. A komplett vírussal szembeni mennyiségi előnyt kihasználva, saját maguk számára lefoglalják azokat a sejtorganellumokat, ahol a makromolekulák szintézise folyik. Ebben a folyamatban minden inkomplett virion részt vehet. Az interferencia további lehetőségével csak azok az inkomplett virionok élhetnek, amelyeknél a defektivitás a genom deléciójára vezethető vissza (vagyis rövidebb a nukleinsavuk).

Ezeket az interferenciára képes inkomplett vírusokat defektív interferáló (DI) partikuláknak nevezzük. Az elmondottakból következik, hogy nem minden defektív vírus képes interferálni, de minden interferáló vírus defektív. A DI partikulák egy része úgy valósítja meg az interferenciát, hogy „elhalássza” a közvetlen környezetében replikálódó komplett vírus polimeráz enzimjét, amivel saját inkomplett utódait szintetizáltatja. (Ennek eredményeként a fertőzött sejtben tovább növekszik az inkomplett utódvirionok száma.)

Erre feltételezhetően azért van lehetősége, mert a rövidebb nukleinsavszál (és annak lánczáró kodonja) nagyobb affinitást biztosít a polimeráz enzimhez, mint a komplett vírus hosszabb genomja. Ezért részesíti előnybe a replikáz enzim a DI partikulákat. Más DI vírusok az ép struktúrfehérjéket rabolják el a komplett vírusok elől (poliovírusok).

Az autointerferencia révén egyre nagyobb számban termelődő inkomplett vírusok a fertőzött sejt elhagyása után az adszorpciós interferencia lehetőségét is kihasználhatják, amivel tovább rontják a komplett virionok életben maradási esélyeit. Többek között ezért válhat a szervezet szintjén „önkorlátozóvá” egy vírusos betegség.

Heterológ interferencia

Heterológ interferencia rendszertanilag nem rokon vírusok között fordul elő, rendkívül ritkán. Az interferenciát kimutatták adenovirus és poxvirus együttes fertőzéskor, amikor a poxvirus gátolta az adenovirus szaporodását. A jelenség hátterében eddig még nem azonosított szuppresszor fehérjék szerepét valószínűsítik. A heterológ interferencia eltérő az interferon-indukció által létrehozott interferenciától.

Vírusexaltáció

Amikor két rendszertanilag különböző vírus egyszerre szaporodik egy sejtben, előállhat az az eset, hogy egymással szemben közömbösek (a másik multiplikációjába nem avatkoznak be), de együttes jelenlétükkel a sejt károsítását (CPE) fokozzák. Ezt a vírusexaltációnak nevezett jelenséget leírták in vitro és in vivo fertőzéskor is. A nem cytopathogen BVD- és sertéspestis-vírus sejtkárosító hatása sejtkultúrában felerősödött a baromfipestis-vírussal történt egyidejű fertőzés hatására. A majmokban szubklinikai megbetegedést okozó Coxsackie-vírus és poliovírus együttes fertőzéskor idegrendszeri tüneteket idézett elő.

Mivel evolúciós szempontból a parazitának nem kifizetődő a gazdasejt fokozott károsítása, a vírusexaltáció mindkét vírus számára hátrányt jelent.

Vírus–sejt kapcsolatok

Amikor a vírus találkozik egy sejttel, többféle kapcsolatrendszer alakulhat ki közöttük (93. ábra).

93. ábra - Vírus–sejt kapcsolatok (Lomniczi (1978) után módosítva)

kepek/93abra.png


A víruskapcsolatok közül az 1., 2., 3. pontban a sejt „győz” a vírus felett, a latencia (4. pont) egy átmeneti egyensúlyi állapotot jelent a sejt és a vírus között, az 5–6–7. pontban jelzett kapcsolatok viszont a vírus „totális győzelmét” jelentik (93. ábra). E kapcsolatrendszerek közül a továbbiakban azokat a lehetőségeket vizsgáljuk, amelyekben a vírus fertőzni tudja a sejtet (3–7.).

A vírus szempontjából a fertőzés lehet produktív amikor multiplikációját zavartalanul végrehajtja és ennek eredményeként új virionok képződnek, vagy lehet abortív, amikor a multiplikáció egy adott szinten megakad és ezért nem keletkeznek utódvirionok. Az abortív fertőzés a sejt szempontjából nem megnyugtató állapot, mivel a már elkészült vírusalkotórészek (fehérjék, nukleinsavak) zavart okozhatnak a sejt anyagcsererendszerében (94. ábra).

94. ábra - A vírusfertőzések típusai a sejt szintjén

kepek/94abra.png


A sejt szempontjából a fertőzés lehet elviselhető (tolerálható) vagy halálos (lítikus fertőzés). A tolerálhatóság mértéke attól függ, hogy a vírus milyen mértékű cytopathogén hatást fejt ki, illetve a sejt védekező rendszere (lizoszóma, nukleáz) milyen hatékonyan tudja megemészteni a vírusokat vagy alkotórészeiket.

A vírus–sejt kapcsolatokat in vitro körülmények között, egyrétegű szövettenyészetekben (többnyire klónozással homogénné tett sejtvonalakon) vizsgálják. Ezért ezek az események csak modell értékűek a szervezetben zajló fertőzések magyarázatára, ugyanis a szöveti kötelékben levő sejtek más-más felszíni struktúrával rendelkeznek, a károsodott sejtek egy része pótlódhat vagy funkcióját más sejtek átveszik, és ezen túlmenően a fertőzés kimenetelét (vagy létrejöttét) az immunrendszer nagymértékben befolyásolja. A szervezet szintjén a fertőzés eredménye attól is függ, hogy a vírusfehérjék toxikus hatása milyen típusú sejtet (létfontosságú szerv) érintett.

Interferonok

Az interferonok a sejt által kódolt mediátor fehérjék, amelyek a vírussal fertőzött sejtben aktiválódnak és gátolják (interferálják) a vírusok replikációját. Az interferon fehérjék fontos szerepet játszanak a sejtnövekedés, sejtdifferenciálódás és az immunreguláció szabályozásában. Evolúciós szempontból a vírusellenes hatás „másodlagos funkciónak” tekinthető, habár a sejt védekező rendszerében betöltött jelentősége vitathatatlan.

Az interferonok az eddig megismert leghatékonyabb biológiai anyagok közé tartoznak. Az interferon hatékony adagja 10-9 mg ! (Összehasonlításként: a tetanusz-toxinból az ember LD 50 10–1 mg). Az interferonok felfedezése is a vírusellenes hatás felismerésének köszönhető.

ISAACS és LINDEMANN 1957-ben megfigyelte, hogy az influenzavirussal fertőzött CAM sejtek szekretálnak egy olyan vegyületet, ami meggátolja (interferálja) a még fogékony CAM sejtek vírusfertőződését. Mivel azt gondolták, hogy az interferencia mediátorát találták meg, a szekretált fehérjét interferonnak nevezték el (azóta bebizonyosodott, hogy az interferon és az interferencia két teljesen különböző biológiai jelenség).

Az 1970-es évek kutatásai bizonyították, hogy a különböző interferon fehérjéket, három géncsalád (IFNα, IFNβ, IFNγ) kódolja, és tisztázódtak az egyes gének kromoszómában elfoglalt helyei is (16. táblázat). Az IFNα-t és az IFNβ-t korábban az I. típusú (klasszikus), az IFNγ-ta II. típusú (immun) interferonnak nevezték. Az interferonok (IFN) leírásánál feltüntetik az interferont termelő faj latin nevének rövidítését és az interferon típusát is (pl. a szarvasmarha Bovidae α-interferonjának elnevezése: BovIFNα, az emberé HuIFNα, a lovaké EqIFNα stb.). Az elnevezés is jelzi, hogy az interferonoknak szűk a gazdaspektrumuk. Ez alól a humán interferonok kivételek, mivel több állatfaj (borjú, macska, nyúl, patkány) sejtjeiben is kifejtik hatásukat.

A szekvenciaanalízisek eredményei már evolúciós kapcsolatokat is feltártak a három interferon-géncsalád között. Az IFNγ valószínűleg közvetlen leszármazottja a három interferon-géncsalád közös ősének, amelyik feltételezhetően 500 millió éve jelent meg a törzsfejlődés palettáján. Az IFNβ gén kb. 250 millió éve vált el az IFNα-tól. A közös származást már csak a 30%-os genomazonosság őrizte meg. Az IFNα körülbelül 60 millió éve vált szét két genetikai alcsoportra, amelyekbe a ma ismert összes IFNα altípus besorolható. Az IFNα szubtípusok között 77%-os azonosság mutatható ki. Az állatok törzsfejlődése során az interferon a halaknál jelent meg először. A gerincesek genetikai állományában (az emlősök kivételével) csak az IFNα és az IFNβ gének azonosíthatók, az IFNγ-tnem kódolják. Az emlősfajokban mindhárom IFN-géncsalád kimutatható. Amíg a legtöbb emlősfaj csak egy IFNβ gént kódol, addig pl. a nyúlban két IFNβ génalcsaládot, a szarvasmarhában, lóban és sertésben több IFNβ génalcsaládot különítettek el. Az emlősmagzatok az interferont a magzati élet második felétől kezdik el termelni.

16. táblázat - Interferonok típusai és fizikokémiai jellemzői (egér interferon)

Interferon

Tulajdonság

α

β

γ

Korábbi elnevezések

Le–IFN

1. típus

F–IFN

1. típus

Immun IFN

2. típus

Szubtípusok száma

›20

kettő

három

Molekulatömeg (d)

   

Nagy szubtípusok

16 000–23.000

23 000

20 000–25 000

Klónok

19 000

19 000

16 000

Glikoziláció

nem

igen

igen

pH 2 stabilitás

stabil

stabil

labilis

Indukció

vírusok

vírusok

mitogének, antigének

Termelő sejtek

epithel sejtek, leukociták

fibroblast

lymphocyta

Intron a génben

nem

nem

igen

Hu-IFN α-val homológia

80–95%

30–50%

‹10%


Interferonok indukciója

Élettani körülmények között a sejtek nem termelnek kimutatható mennyiségű interferont, de különböző aktiválóanyagok (interferoninduktorok) hatására az interferon termelése jelentősen fokozódik. Ilyen interferontermelést indukáló ágensek a mikroorganizmusok (vírusok, baktériumok, protozoonok), az immunstimulátorok vagy mitogének (endotoxinok, fitohemagglutinin), az antibiotikumok (pl. kanamicin, ciklohexamid), kettős szálú-polinukleotidok (poly I:C), valamint egyes kis molekulatömegű szintetikus vegyületek (pl. akridinfestékek). A továbbiakban, részletesen tárgyaljuk a vírusok által indukált interferonok (IFNα, IFNβ) termelésének mechanizmusát és a vírusszaporodásra kifejtett gátló hatásukat (95. ábra).

95. ábra - Az interferonok indukciója

kepek/95abra.png


A leghatékonyabb interferoninduktorok a kettős szálú RNS-nukleinsavak. A reo- és birnavirusok a genomszerkezetük (2/RNS), a többi RNS-vírus a replikáció során keletkező intermedier-(+RNS/-RNS) révén indukálja az IFN gént (sejtenként már egyetlen 2/RNS-molekula képes aktiválni az interferontermelést).

Általánosságban elmondhatjuk, hogy az RNS-vírusok erős interferoninduktorok, a DNS-vírusok a (poxvirusok kivételével) viszont gyengén aktiválják az interferon gént. Az IFN gén indukciójának hatékonysága függ a vírustörzs specificitásától és a sejt típusától. Ugyanazon vírus különböző törzsei eltérő intenzitással indukálhatják az interferontermelését. Egyazon vírustörzs különböző típusú sejtekben más és más hatékonysággal aktiválhatja az IFN gént.

Az interferon vírusellenes hatásának kifejlődéséhez minimálisan két sejt szükséges. Az első sejtben a vírus aktiválja az interferon gént (indukció), amelyik a sejt riboszómáival letermelteti az interferonokat és ezek az interferonmolekulák a második sejtben fejtik majd ki vírusellenes hatásukat Amíg az indukció előfeltétele a vírusfertőzés, addig a vírusellenes hatás kifejlődéséhez az interferonnak meg kell előzni a fertőző vírust a fogékony sejt eléréséért vívott küzdelemben. A vírussal fertőzött sejtekhez, ha interferont adtak, a vírus multiplikációja zavartalanul folyt tovább. Ugyanakkor, ha a vírusfertőzés előtt kezelték a sejteket interferonnal, a sejt fertőződését, illetve a vírus multiplikációját gátolni tudták.

A vírusok nagy valószínűséggel azért képesek aktiválni az interferon gént, mert a fertőzés során a vírusfehérjék gátolják a sejt saját fehérjeszintézisét. Ennek eredményeként a sejt nem tud elegendő interferon gént represszáló fehérjét termelni, így megindulhat az interferon fehérjék szintézise. Az interferontermelés a fertőzés után 2–4 órán belül megkezdődik, és maximumát a vírusfehérje-szintézis csúcspontján éri el, majd mennyisége (és ezzel párhuzamosan hatékonysága is) 1–2 nap után drasztikusan csökkenni kezd. Ezek az interferonmolekulák a saját sejtjüket már nem tudják megvédeni az aktivációjukat elősegítő vírus károsításától. Ahhoz, hogy az interferonok antivirális hatásukat a környező sejt(ek)ben kifejthessék, két fontos lépést kell megtenniük: el kell hagyniuk az őket létrehozó sejtet és kapcsolódniuk kell a vírusfertőzésre még fogékony sejt membránjához.

Interferonok antivirális hatása

Az interferonmolekulák a vírusfertőzésre még fogékony sejt sejtmembránjának interferonreceptoraihoz kapcsolódnak. Az interferonreceptorok glükoproteinekből épülnek fel. Két különböző interferonreceptort ismerünk. Az egyikhez kapcsolódik az IFNα és/vagy az IFNβ, a másikhoz kizárólag az IFNγ. A tumorsejtek több IFNγ-receptort hordoznak, mint a normál sejtek. A membránkapcsolat fontosságát bizonyítja, hogy a sejt plazmájába közvetlenül injektált interferon nem fejtett ki vírusellenes hatást. A receptorhoz kapcsolódó interferon mélyreható változásokat hoz létre a sejtmembránban, amelynek eredményeként a lipid kettős réteg merevvé válik és az egyes membránkomponensek újraépülése, pótlódása felfüggesztődik vagy megszűnik. Az ebből adódó strukturális változások már önmagukban is gátolják a vírusszaporodás egyes lépéseit, úgymint az adszorpciót, a penetrációt és a víruskiszabadulást. Az adszorbeálódott interferon a sejtfúzió gátlása révén megakadályozza a sejtből–sejtbe történő vírusterjedést és a sejttranszformáció gátlásával, a tumorvírusok és retrovíruok szaporodását. A sejtmembránban lejátszódó események hatással lesznek a cytoplasmában zajló vírusszaporodási folyamatokra is (96. ábra).

96. ábra - Az interferonok vírusellenes hatása

kepek/96abra.png


Amikor az IFNα és IFNβ a receptorokhoz kapcsolódik, egy olyan kaszkádreakció indul be, aminek eredményeként a sejt cytoplasmájában három különböző enzim szintetizálódik: a 2,5-oligoA szintetáz, az L RN-áz (endoribonukleáz) és aproteinkináz. Ezek az enzimek különböző mechanizmusokon keresztül gátolják a vírusfehérjék szintézisét. A 2,5-oligoA szintetáz aktiválja az L RN-ázt, ami endoribonukleázként működve- széttördeli az mRNS-eket. Alternatív úton, az interferonok az mRNS-ek (5’G-cap) metilizációját is gátolják, aminek eredményeként az mRNS-ek nem tudnak a riboszómákhoz kapcsolódni. A vírus-mRNS-ek enzimatikus emésztése és metilizációjának gátlása lehetetlenné teszi a transzlációs folyamatok elindulását. Mivel az RNS-vírusoknál az mRNS-ek pozitív szálú templátként (+RNS) is funkcionálnak, károsodásuk a replikáció blokkolását okozza (lásd RNS-vírusok replikációja).

Interferonhatásra a normál sejtben inaktív 67kD proteinkináz aktiválódik. A proteinkináz a peptidláncok kialakulását gátolja. Megfigyelték, hogy interferonkezelésre nem mindig aktiválódik a proteinkináz, ugyanakkor néhány esetben a cytoplasmában zajló vírusellenes hatást egyedül hajtotta végre (93. ábra). Több vírus interferonrezisztenciája annak köszönhető, hogy olyan fehérjét szintetizál, amely képes inaktiválni a proteinkinázt (adenovirus, ortomyxovírus).

Az interferonok speciális vírusellenes hatását fedezték fel egerek influenzavirussal való fertőzésekor. Az IFNα és IFNβ aktiválták az egerek kromoszómájában jelenlevő ún. Mx-gént, amelynek fehérjetermékei drasztikusan gátolták az influenzavirusok transzkripcióját, ma még nem tisztázott mechanizmusokon keresztül.

A fentiekben részletezett vírusellenes hatást kizárólag az IFNα és az IFNβ váltja ki.

Az IFNγ annyira elkülönül az IFNα és IFNβ géncsaládoktól, hogy indukcióját vírusokkal nem is lehet kiváltani. A kizárólag lymphocyták által kódolt IFNγ gének indukciója csak specifikus antigének vagy mitogének hatására megy végbe. Az IFNγ valójában az immunreguláció szabályozása révén fejti ki gátló hatását a vírusok szaporodására. Az immuninterferonnak is nevezett IFNγ és az immunrendszer kapcsolatát az Immunológia c. fejezet tárgyalja részletesen.

Interferonok terápiás alkalmazhatósága

Az interferonok a rendkívül magas előállítási költségek miatt az állatgyógyászatban nem terjedtek el (nagyon ritkán, pl. influenzavirussal fertőződött értékes sportlovak gyógykezelésére használták). Az IFNα terápiás jelentősége a humán daganatos betegségek gyógykezelésében számottevő. (papilloma, lymphoma, mononucleosis infectiosa, hairy cell leukémia). A malignus daganatokra csak részleges hatásuk van. Az interferont jelenleg az emberi krónikus (aktív) hepatitisek (HCV, HBV, HDV) kezelésében alkalmazzák. A HCV (hepatitis C vírus) terápiában az interferon önmagában 50%-os gyógyulást, míg a vírus ellenes szerrel (RIBAVIRIN) kombinálva közel 100%-os felépülést eredményezett.

Az interferonok vírusellenes hatását a terápiában nehezen tudták felhasználni a következő okok miatt:

• a terápiás dózis előállítása rendkívül költséges (újabban géntechnikai eszközök alkalmazásával próbálják csökkenteni az előállítás és a tisztítás költségeit, pl. klónozás),

• az IFN kizárólag parenterálisan alkalmazható,

• a mesterséges IFN induktorok (poly I:C) mérgezők (a toxikus és hatékony dózis közel esik egymáshoz),

• az interferon rövid ideig hatékony (pár órán belül lebomlik és a vesén át kiürül a szervezetből), ezért a kezelést gyakran kell ismételni, ami az alkalmazási nehézségek mellet a kezelés költségeit is jelentősen növeli,

• rosszindulatú (malignus) daganatok gyógykezelésénél „életen át” kellene adni,

• súlyos toxikus mellékhatások (láz, orrváladékozás, hányás, anorexia, myalgia, leukopénia stb.) lépnek fel, (az influenzafertőzések során fellépő hasonló klinikai tünetek is valószínűleg az interferonok toxikus hatására vezethetők vissza).

A vírusellenes interferonterápia jövőbeni jelentőségét elsősorban olyan életveszélyes vírusfertőzések, mint pl. a veszettség, a haemorrhagiás láz és az encephalitis halálos kimenetelének a megakadályozásában látják.

Sejttranszformáció (oncogenesis)

A vírus–sejt kapcsolat egyik különleges formája a sejttranszformáció. Megfigyelték, hogy egyes vírusok a sejtbe jutásuk után a sejt növekedési és osztódási képességét megváltoztatják. Egyrétegű sejttenyészetekben ez a hatás jól azonosítható sejtmorfológiai változással jár, amit a folyamat alapján sejttranszformációnak, a folyamat eredménye alapján mikrotumornak nevezünk (97. ábra). A szervezet szintjén, a szöveti kötelékekben kialakuló sejttranszformáció a tumor vagy daganat. A tumor sejtkárosító hatásának és szervezeten belüli terjedőképességének (áttétképződésének) mértéke alapján megkülönböztetünk jóindulatú (benignus) és rosszindulatú (malignus, rákos) daganatokat. A malignus tumorok elnevezése attól függ, hogy milyen sejttípusban alakult ki a tumor (pl. carcinoma: epithelsejt, sarcoma: mesenchymasejt, lymphoma, leukémia: lymphocyta). A tumorképződés folyamatát tumorgenezisnek vagy az ezzel szinonim oncogenezisnek vagy carciongenezisnek nevezik.

97. ábra - Malignus transzformáció (mikrotumor) egyrétegű szövettenyészetben (900 ×) (Nász I. felvétele)

kepek/97abra.png


Az utóbbi évtizedek kiterjedt kutatásai bizonyították, hogy a sejttranszformáció speciális fehérjékhez (oncoprotein) kötött tulajdonság. Ezeknek a fehérjéknek a genetikai kódját onkogénnek nevezik. Az eukaryota sejtek kromoszómájában megtalálható oncogéneket sejt onkogénnek (c-onc,cellular-oncogen)vagy proto onkogénnek (ősi), a vírusokban azonosított oncogéneket vírus onkogénnek (v-onc) nevezik (98. ábra).

98. ábra - A c-onc- és v-oncgének elhelyeződése a genomban

kepek/98abra.png


A c-oncgének ősi gének, mivel az élesztősejtektől az emberig minden fajban megtalálhatók. Evolúciós szerepük valószínűleg a sejtosztódás és a sejtdifferenciálódás szabályozásában keresendő. Talán ez az oka annak, hogy az eukaryota sejtek kromoszómájának kb. 5%-át c-oncgének alkotják. A c-oncgének univerzális és konzervatív jellegét bizonyítja, hogy pl. a muslica (Drosophila) és az ember c-oncgénje (c-sarc) 95%-ban azonos szekvenciával rendelkezik.

A sejt oncogének által kódolt oncoproteinek a sejtmembránban és a cytoplasmában, a sejt jelző rendszerének (short-term signal chain) tagjaiként funkcionálnak, a sejtmagban található oncoproteinek pedig nagy valószínűséggel részt vesznek a DNS-replikáció és a transzkripció szabályozásában. Élettani körülmények között az oncoproteinek termelése szigorú kontroll alatt áll. Ha ez az ellenőrző rendszer felborul, az oncoproteinek tevékenysége a sejt transzformációjához és ezen keresztül a daganatok kialakulásához vezet.

A vírusokban található v-oncgének valójában a sejtből származó c-oncgének. Ezt bizonyítja, hogy a c-onc- és v-oncgének (néhány, pontmutációból adódó nukleotid különbségtől és a v-oncgének intronhiányától eltekintve), majdnem teljesen azonosak. Az említett különbségek evolúciós eseményekre vezethetők vissza. A v-oncgénnel rendelkező vírusok (pl. egyes retrovirusok) multiplikációja során c-oncgének épültek be a vírus genomjába és annak szerves részévé váltak. A v-oncgéneknek nincs szerepük a vírus multiplikációjában, ezért a vírus számára nem lényeges (non essential) fehérjéket kódolnak. A v-oncgének által kódolt oncoproteinek a sejt transzformációját okozzák.

Az oncogenitás mechanizmusa

A sejttranszformáció kialakulásának okai és folyamatai még nem teljesen tisztázottak. Azt azonban biztosan állíthatjuk, hogy a daganatképzésért minden esetben a sejt által kódolt c-oncgén a felelős, egy kivételtől eltekintve, amikor a sejtet megtámadó vírus szállítja a transzformációt okozó (bár szintén a sejtből származó) v-oncgént. A v-oncgénnel rendelkező vírusok éppen ezért különleges helyet foglalnak el a daganatkutatásban.

Vírusok által kiváltott daganatképződés

V-oncgént hordozó vírusok a sejtbe jutva mindig daganatot okoznak, mivel a vírusmultiplikáció során a vírus „saját” fehérjéjeként nagy mennyiségben termelődő oncoproteinek kontroll nélkül fejthetik ki a sejt transzformációjához vezető hatásukat. A v-oncgént hordozó retrovirusok a v-oncgén (pl. sarcgén) hordozásáért nagy árat fizetnek, ugyanis a v-oncgén valamelyik létfontosságú vírusgénszakaszba (gag, pol, env) épül be. Ebből adódóan a v-oncgént hordozó retrovirusok kizárólag v-oncgént nem hordozó rokon vírussal pl. leukózisvírussal együtt képesek fertőzni a sejtet. Ez az oka annak, hogy pl. macskákban a szarkómavírus- (FSV) fertőzés viszonylag ritkán fordul elő, de olyankor minden esetben malignus daganatos megbetegedést, sarcomát okoz (a sarcgénnek köszönhetően), és biztosak lehetünk abban, hogy az FSV-vel fertőzött macska leukózisvírussal (FLV) is fertőzött volt (17. táblázat).

17. táblázat - Retrovirus gének és funkciójuk

Gének

Funkció

gag

csoportspecifikus antigén: core és kapszid fehérje

pol

polymeráz: reverz transzkriptáz, proteáz, endonukláz

env

burok fehérje

*

 

tax/tex

transzaktiváció

tat

transzaktiváció, HIV replikáció szabályozás

rev (art, trs)

gén szabályozás (HIV-replikáció)

nef (F, 3' orf , B)

negatív korai faktor (expresszió szabályozás)

vif (Q, sor, A)

vírus fertőzőképesség kifejeződése, replikáció kezdetét segíti

vpr (R)

nem ismert

vpx (X)

nem ismert

LTR

(Long terminal repeat) promoter, enhancer (génszabályozás)

* csak a lentivirusokban előforduló gének


V-oncgént nem tartalmazó vírusok esetében a vírus fehérjéi „zavart okoznak” a sejt onkogénjének szabályozásában és ezért a sejt transzformációját tulajdonképpen a represszált állapotból felszabaduló c-oncgén által termelt onkoproteinek hajtják végre. Ezt a jelenséget DNS vírusoknál figyelték meg. A DNS vírusoknál kimutatták, hogy az episzomális állapotú vírusnukleinsavakról termelődő vírusfehérjék (T-antigén, EGF, E1) képesek megkötni a sejt által termelt ún. antionkogén fehérjéket (p53, anti-Rb), amelyek a c-oncgének működését szabályozzák. Ennek eredményeként a sejt „S” fázisba kerül és az intenzívvé váló sejtosztódás jóindulatú daganat képződését eredményezheti (immortalizáció). Az esetek egy részében azonban megszűnik a vírus episzomális állapota és a vírusgenom integrálódik a sejt genomjába. Az integráció lesz az első lépés a rosszindulatú daganat kialakulásához vezető úton (transzformáció). Az integrációval a vírus nemcsak „végteleníti” a sejt osztódását, de a felfokozott replikációs folyamatok során az antionkogénekben is bekövetkezhetnek mutációk. Ezek, az antionkogénekben bekövetkező mutációk eredményezhetik végsősoron a sejt malignus transzformációját.

A herpesvirusok közül a Gammaherpesvirinae alcsaládba tartozó vírusokról mutatták ki, hogy daganatképződést indítanak el a szervezetben. A korábban Gammaherpesvirinae alcsaládba tartozó Marek-betegség vírusa (GHV–2) a T lymphocyták transzformációját indítja el, ami a szervezet szintjén letális kimenetelű generalizált lymphadenosis kifejlődéséhez vezet. A lymphadenomákban nem lehet víruspartikulákat kimutatni (abortív fertőzés). A produktív fertőzés lehetőségét a Marek betegség vírusa a tolltüsző hámsejtjeiben találja meg, ami rendkívül jó lehetőséget biztosít az utódvirionoknak a populáción belüli terjedésre (A tollverdesés során leváló hámsejtekben levő vírust könnyen felveszi a fogékony baromfi).

Az Epstein–Barr-vírus (EBV) kizárólag a B lymphocytákban okoz transzformációt. A transzformáció kialakulását kofaktorok segíthetik (pl. Burkitt-lymphomáknál a malária miatti immunszupresszió és a 6 hónapos kornál korábbi EBV fertőzés, a Singapur köré húzott 1500 km sugarú körön belül pedig a sózott hal nagymértékű fogyasztása okozza a malignus daganatok kifejlődését.) Az EBV által okozott rákokban a c-myconkogént az ellenanyag-termelő promoterek működtetik a B-lymphocitákban.

A papillomavirus-fertőzéskor kialakuló transzformáció az emlős állatfajok bőr- és nyálkahártyájában benignus tumorok kialakulásához vezet. Habár ezek a tumorok legtöbbször spontán gyógyulnak, néhány esetben bizonyos kofaktorok hatására malignussá válnak. Ilyen malignustranszformációt írtak le szarvasmarháknál Skóciában, ahol a zsurlófű legelése vezetett a malignustranszformáció kialakulásához. Hasonló jelenséget írtak le Texasaban és Ausztráliában, ahol a napsugárzás hatására vált malignussá a szarvasmarhák bőrpapillomatózisa. Az emlős-papillomavirusok rágcsálóba oltva is kiváltanak sejttranszformációt. A transzformálódott sejtekben nem találtak viriont. A bovin- papillomavirus egy esetében bizonyították, hogy a vírus-DNS 69%-a már elindítja a transzformációt.

A hepadnavirusok közé tartozó Hepatitis B vírus világszerte elterjedt, és az általa kiváltott hepatocelluláris carcinoma az egyik leggyakoribb letális humán daganatos megbetegedés. A vírus nemcsak emberben hanem az amerikai mormotában (Marmota monax) és a pekingi kacsában is májdaganatot okoz. A vírus ugyan integrálódik a sejtgenomba, de a transzformáció megindításának stratégiáját még nem tisztázták.

Egyes poxvirusokról bizonyították, hogy benignus tumorokhoz vezető sejttranszformációt hoznak létre. A transzformációért feltételezhetően a vírusfehérjék közvetlenül játszanak szerepet. A vacciniavirus-fertőzéseknél pl. kimutatták, hogy az egyik korai virusprotein az epidermális növekedési faktorral homológ szerepet képes betölteni, ezért ez a korai fehérje felelős azoknak az epidermális hiperpláziáknak a kialakulásáért, ami a vaccinavirus-fertőzések bemeneti kapujában megfigyelhetők.

Hasonló benign tumorképződés figyelhető meg nyulakban a Leporipox genusba tartozó nyúlfibromatózisvirus-fertőzésnél, madarakban a bőrön keresztüli Avipox vírusok okozta fertőzésnél és Rhesus majmokban a Yabapoxvirus fertőzése során. Ezekben az esetekben a tumorképződés mechanizmusa még nem tisztázott.

Vírus jelenléte nélkül kialakuló daganatképződés

Mutáció hatására aktiválódik a represszált állapotban levő c-oncgén, és ez az esemény sejttranszformációt okozó oncoproteinek termeléséhez vezet. Ilyen mutációt okoznak a carcinogen anyagok, a sugárzás (pl. a csernobili atomerőmű katasztrófája) és a DNS-replikáció során előforduló spontán átírási hibák.

A sejt osztódása során, környezeti hatásra megnőhet a c-oncgének száma (gén-amplifikáció), ami még a represszált állapot ellenére is olyan mértékben megnöveli az oncoproteinek mennyiségét, hogy az a sejttranszformáció megindulásához vezet.

Az „ugráló gén” (transzpozíció) jelensége alapján ismert, hogy egyes gének (pl. ellenanyagokat kódoló gének) megváltoztatják a kromoszómán belül elfoglalt helyüket. Epstein–Barr-vírus-fertőzéseknél megfigyelték a c-oncgének transzpozícióját, aminek eredményeként megindult a sejt transzformációja. Feltételezik, hogy egyes retrovirusok is kényszeríthetik a c-oncgéneket transzpozícióra.

Latens fertőzés

A vírus–sejt kapcsolatok azon különleges helyzete a latens fertőzés, amikor a vírus „saját elhatározásából” felfüggeszti a multiplikációját, és ezért átmenetileg nem termelődnek utódvirionok, vagyis a latencia alatt a fertőzés abortív jelleget ölt. Latencia alatt a vírus csak nukleinsav (és esetleg transzkriptek) formájában van jelen a sejtben. A latencia mind a sejt, mind a vírus számára a legkedvezőbb együttélést jelenti, ugyanis a latens fertőzés alatt a vírus nem károsítja a sejtet (mivel nincs vírusfehérje-szintézis), és ezért a sejt is „eltűri” a vírus jelenlétét, ami evolúciós szempontból a vírusnak rendkívül kedvező túlélési lehetőséget biztosít (noncytocidal fertőzés). A latens állapot a sejtek, sejtvonalak passzálása során is fennmaradhat.

A latencia a reaktivációval szűnik meg, amikor a latens állapotban levő vírusgenomról megindul az utódvirionok szintézise (az alvó vírus felébred). Éppen ezért a reaktiváció eredménye mindig produktív fertőzés lesz. A reaktiváció okait és pontos mechanizmusát még nem ismerjük, de pl. a kortizonmolekulákról bizonyították, hogy a sejtbe jutva képesek reaktiválni a latens vírusgenomot. A reaktiváció után ismételten kialakulhat a latens állapot.

A latens állapot laboratóriumi diagnosztikája a latens vírusgenom (vagy vírustranszkript) kimutatásán és/vagy reaktiválásán alapszik. A latens genom vagy transzkript azonosítása nukleinsav-hibridizációval (in vitro, in situ) történik, a reaktivációt pedig az ún. ko-kultivációs módszerrel hajtják végre. A ko-cultivációs módszer egyik fajtája, amikor egyrétegű sejttenyészetre egy fertőzött állat olyan szervdarabkáját helyezzük, amelyik a latens vírust feltételezhetően tartalmazza (cell and organ culture). Azon a felületen, ahol a szervdarabka és a sejttenyészet membránjai érintkeznek, sejtfúzió indul meg. Valószínűsíthető, hogy a sejtfúzióhoz szükséges fehérjék termelésének transzkripciós és transzlációs folyamatai játszanak szerepet a reaktivációban, de erre vonatkozóan közvetlen bizonyítékaink még nincsenek. A reaktiváció eredményeként termelődő utódvirionok elhagyják a szervdarabka sejtjeit, és az egyrétegű szövettenyészet sejtjeit fertőzik meg, ahol többnyire jól azonosítható cytopathologiás elváltozást (CPE) okoznak.

A latenciát a herpesvirus és a retrovirus-fertőzések során vizsgálták részletesen.

A retrovirusok multiplikációs stratégiája a latens állapot kialakítására irányul. A retrovirusok esetében éppen a reverz transzkripció teremti meg a lehetőséget arra, hogy a +RNS-vírusgenom DNS/2-ként integrálódni tudjon a sejt kromoszómájába. Ezért a retrovirusoknál a latencia tulajdonképpen az első DNS/2 megjelenésétől az első utódvirion kialakulásáig tart. A retrovirusok nukleinsava a latencia alatt integrálódott formában van jelen. Bizonyították, hogy a sejtbe jutó kortizonmolekulák közvetlenül képesek reaktiválni az integrálódott retrovirus-genomot. A reaktivációt követően a transzkripciós és transzlációs folyamatokat a gazdasejt enzimei végzik.

A herpesvirusok legfontosabb élettani jellemzője a latencia. A latencia kialakulását a vírus által kódolt ún. „latenciához kapcsolódó mRNS-ek” vagy LAT-ok (Latency Associated Transcript) irányítják A humán herpesvirusoknál (HSV–1) eddig 6 különböző LAT-ot azonosítottak. Az Alphaherpesvirusok által latensen fertőzött sejt kb. 4–20 vírusgenomot tartalmaz. Latencia alatt a herpesvirusgenom extrakromoszomálisan, cirkuláris formában (episzoma) van jelen a sejtmagban. Betaherpesvirusoknál (cytomegalovirus, Epstein–Barr-virus) előfordul, hogy a latens vírusgenom integrálódik a sejt kromoszómájába. A humán herpesvirusok esetében megfigyelték, hogy a virulens vírustörzseknél magasabb hatásfokkal ment végbe a reaktiváció, mint az avirulens törzseknél. Bizonyos deléciós mutánsok kialakítanak ugyan latenciát, de nem reaktiválhatók. Ezért diagnosztikai szempontból nagyon fontos, hogy a reaktiváció negatív eredménye még nem jelenti a latencia hiányát. Herpesvirusoknál a latencia a LAT-ok azonosításával (hibridizációval) igazolható.

Perzisztáló fertőzés

A sejt–vírus kapcsolatokban perzisztáló fertőzés akkor alakul ki, ha a vírus multiplikációja során nem pusztítja el a sejtet. A perzisztáló fertőzés tehát egy olyan együttélési forma, amelyben a sejt megtartja életfunkcióit, miközben folyamatosan termeli az őt fertőző vírusokat(produktív fertőzés). Perzisztáló fertőzést elsősorban a nem cytopathogen (noncytocidal) vírusok hoznak létre (arenavirusok, retrovirusok, néhány paramyxovirus, pestivirus).

A perzisztensen fertőzött sejtekben a vírustermelés mindenképpen anyag- és energiaveszteséggel jár, de ez általában nem olyan mértékű, ami a sejtnövekedés vagy a sejtosztódás megszűnését okozná. Ennek köszönhetően a perzisztensen fertőzött sejtek osztódásuk után is folyamatosan ürítik a vírusokat. Ez a vírus számára komoly evolúciós előnyt jelent, mivel sejtgenerációkon keresztül fenntarthatja a sikeresen elindított multiplikációját. Habár a perzisztensen fertőzött sejtek hosszú ideig megtartják osztódóképességüket, a folyamatos energia- és tápanyagveszteségek előbb-utóbb egy lassú progresszív változást okoznak a sejt anyagcseréjében, ami végül is a sejt halálához vezet.

Szervezeten belül egyes szervekben olyan gyorsan váltódnak vagy pótlódnak a szöveti kötelékben levő sejtek (pl. bélhám, epidermisz), hogy a perzisztensen fertőzött sejtek, sejtcsoportok halála legtöbbször nem okoz kiesést a szerv funkciójában.

A perzisztensen fertőzött egyrétegű szövettenyészeteket nem lehet használni vírusdiagnosztikai célra (pl. vírusizolálás, VN próba) mivel a perzisztens fertőzést kialakító vírus már előre „lefoglalta” az izolálandó vírus multiplikációjához szükséges enzimeket és sejtorganellumokat. A sertéspestisvirus avirulens törzsei perzisztens fertőzést okozhatnak sertés eredetű sejtvonalakban (PK IBR–2).

A sejtvonalak perzisztens fertőzöttségének felismerését megnehezíti a cytopathogen hatás (cytopathogenic effect, CPE) hiánya, ezért a sejtvonalak ellenőrzése során a perzisztáló vírus jelenlétére az izolálás mellett a vírus nukleinsavát és/vagy fehérjéit kimutató jelzéses módszerekkel (IF, immunperoxidáz-próba, nukleinsav-hibridizáció stb.) következtetünk. Ritka esetekben a perzisztensen fertőzött sejtvonalakat vírus- vagy vírusantigén-termelésre is használhatjuk (pl. szarvasmarha-leukózisvirus).

Lítikus fertőzés (cytolysis)

Amikor a vírusfertőzés a sejt halálához (líziséhez) vezet, litikus fertőzésről beszélünk. A sejt szempontjából végzetes kimenetelű cytolysis mindig produktív fertőzés eredménye, vagyis vírustermeléssel járó folyamat. A lítikus fertőzést elindító vírus a sejtkárosító hatását (CPE) a multiplikációja során, a következő folyamatokban fejti ki:

• Egyes vírusok már az adszorpciójuk révén közvetlenül is károsítják a sejtmembránt (pl. az adenovirusok peptonfehérjéi önálló toxikus hatást fejtenek ki).

• A korai transzkripció és transzláció során termelődő fehérjék leállítják vagy gátolják a sejt saját fehérjéinek termelését (poliovirusok, herpesvirusok, poxvirusok, togavirusok).

• A DNS-vírusok korai fehérjéi gátolják a sejt kromoszomális DNS-ének és mRNS-ének szintézisét (herpesvirusok, adenovirusok).

• A folyamatosan termelődő vírusfehérjék, nuklokapszidok felhalmozódnak és toxikus hatásuk mellett még szinte kiszorítják a sejtalkotókat is (pl. adenovirusok, picornavirusok). Ez a folyamat vezet a zárvány (inclusion body) kialakulásához.

• Burkos vírusok a sejtmembránba ágyazzák burokfehérjéiket, aminek következtében megváltozik a membrán permeabilitása. Ez az ozmotikus viszonyok felborulásához vezet (herpesvirusok).

• A legtöbb vírus depolimerizálja a sejtstruktúrát és a sejtorganellumok transzportját biztosító cytosceletont, ami a sejt lekerekedése néven ismert cytopathogen hatást okozza. A cytosceletonkárosítás a makromolekulák szintézise során következik be. (A cytosceleton depolimerizációját elsősorban a herpesvirusok és a szopornyicavirus estében tanulmányozták.)

• Egyes burkos vírusok (herpesvirus, paramyxovirusok) speciális felszíni fehérjével rendelkeznek (fúziós protein), amelyek a sejtmembránba ágyazódva a szomszédos sejtek sejtmembránjainak összeolvadását (sejtfúzióját) okozzák. A sejtfúzió végső soron a szomszédos sejtek membránstruktúrájának teljes feloldódásához és a sejtplazma összeolvadásához, vagyis syncytium képződéshez vezet.

A felsorolt sejtkárosító hatások önállóan és kumulatív úton is jelentkezhetnek a fertőzött sejtben, és ennek eredményeként fénymikroszkópos vizsgálattal jól elkülöníthető morfológiai elváltozásokat figyelhetünk meg. Ez a morfológiai változás (CP-hatás) egyes vírusok esetében diagnosztikai értékű lehet, habár a vírusok azonosításához ma már szerológiai és immunhisztokémia módszerek is elengedhetetlenül szükségesek.

A vírusok által okozott cytopathogén elváltozásokat egyrétegű szövettenyészetekben tanulmányozhatjuk fénymikroszkópos vizsgálattal. Egyes cytopathogén hatások festetlen, élő sejtkultúrákban is felismerhetők (pl. sejtlekerekedés, syncytiumképzés, sejtleválás), de a sejtkárosító hatások többsége csak metanollal fixált és kontraszt festékkel (hematoxilin-eosin, Giemsa) festett sejttenyészetben azonosítható (zárvány, rögösödés, vakuolás elfajulás stb.). A leggyakoribb CP-hatásokat az alábbiakban foglaljuk össze (18. táblázat).

18. táblázat - Vírusok cytopathogén hatása

Cytopathogen hatásmechanizmus

A hatást kiváltó vírusok

Sejt fehérje szintézisét gátolják

herpesvirusok, poliovirusok, tógavirusok, poxvirusok,

Sejt DNS + inaktiválják, széttördelik

herpesvirusok

Sejt membrán struktúrát változtatják

gliboprotein beépülés

syncytium

minden burkos vírus

herpesvirusok, paramyxovirusok, HIV

cytoszkeleton darabolódik

herpesvirusok

Permeabilitás megnő

tógavirusok, herpesvirusok

virion komponens toxikus

adenovirusok pepton-fehérjéi

apoptózis (programozott sejthalál)

adenovirusok, circovirusok,

transzformáció

papovavirusok, herpesvirusok, retrovirusok


Zárvány. A zárványok a nukleokapszid-összeépülésének a helyén jönnek létre. Elektronmikroszkópos vizsgálatokkal látható, hogy a zárványok tulajdonképpen nukleokapszidok tömegéből álló „vírusraktárak”. Mivel az akkumulálódott nukleokapszidok az összeépülés helyéről kiszorítják a sejtorganellumokat, a zárvány körül fénymikroszkóppal jól megfigyelhető világos udvar, ún. „halo” keletkezik. A „halo” mellett a homogén festődés segít a zárvány felismerésében. Sejtbeli helyeződésük alapján magzárványokat és cytoplasmazárványokat különítünk el (99. ábra).

99. ábra - A sejtzárványok típusai (Fenner (1987) után módosítva) cytoplasma

kepek/99abra.png


Magzárványokat azok a DNS-vírusok okoznak, amelyek replikációja és nukleokapszidjainak összeépülése a sejtmagban történik (herpesz-, adeno-, papova-, parvovirusok). A szintén DNS-nukleinsavval rendelkező poxvirus és az afrikai sertéspestisvírus a cytoplasmában alakít ki zárványt (mivel replikációjuk és nukleokapszidjuk összeépülése a sejtplazmában megy végbe).

A magzárványok alakjuk és festődésük alapján elkülöníthetők, de ennek ma már nincs diagnosztikai jelentősége (pl. Cowdry-A és -B). A zárványok alakja ugyanis döntően attól függ, hogy a vírus makromolekuláinak szintézise éppen milyen fázisban van. Herpesvirusoknál megfigyelték, hogy a zárványképződés intenzitása függ a sejt típusától is (pl. Aujeszky vírus nyúl vesesejtben (RK sejtvonal) kifejezettebb zárványképződést okoz, mint más fajok sejtjeinek fertőzésekor).

Cytoplasma-zárványokat az RNS-vírusok (és a DNS-genommal rendelkező poxvirus és az afrikai sertéspestis virusa) alakítanak ki, mivel a replikáció és a nukleokapszid-összeépülés is a cytoplasmában zajlik. Ebből a szempontból külön csoportot képviselnek a retrovirusok, amelyeknél a replikáció a sejtmagban, a nukleokapszid-összeépülés azonban a cytoplasmában megy végbe (ez az egyetlen ismert víruscsalád, ahol az összeépülés nem a replikáció helyén történik). A cytoplasmazárványok többnyire eosinofil festődésű képletek, és gyakran gyűrűszerűen veszik körül a sejtmagot (pl. reovirusok). Poxvirusok multiplikációja során mind basofil, mind eosinofil festődésű zárvány előfordul. A cytoplasmazárványokat körülvevő „halo” sokkal kifejezettebb, mint a magzárványok esetében.

A zárványképzés egyes esetekben diagnosztikai értékű, mint pl. Negri-test (veszettség vírusa, cytoplasmazárvány), bagolyszem (cytomegalovirus, magzárvány); Guarnieri-féle testek (poxvirus, cytoplasmazárvány).

Sejtek lekerekedése. AzRNS- (pl. picornavirus) és DNS- (pl. herpesvirus, adenovirus) vírusok egyaránt kialakítják ezt az egyik leggyakoribb cytopathogen hatást. Festetlen sejtkultúrákban a kettős fénytörésű (autókerékszerű sejthatárral rendelkező) kerek sejtek már jelzik a lekerekedésben megnyilvánuló cytopathogen hatást. Ezek a sejtek viszonylag hamar kiszabadulnak a szöveti kötelékből és leválnak az üveg faláról. Festett sejttenyészetben a lekerekedett sejtek intenzívebben festődnek. A sejt lekerekedését az ozmotikus viszonyok megváltozása okozza (100. ábra). A sertés-enterovirusok esetében a sejtlekerekedés a pathogen törzsekre jellemző (differenciál diagnosztikai értékű) CP-hatás, mivel az apathogen törzsek a sejtek „szétrobbanását” okozzák.

100. ábra - Vírusok cytopathogen hatása (sejtlekerekedés). Aujeszky-vírussal (K-61 törzs) fertőzött sertésvesesejt (SEM 1400 x)

kepek/100abra.png


Sejtfúzió, syncytiumképzés. A sejtfúziót kizárólag burokkal rendelkező vírusok alakíthatják ki, mivel az eseményt a fertőzött sejt membránjába beépült vírusfehérjék irányítják. A vírus által kódolt fúziós proteinek (pl. paramyxovirusoknál az F-protein) a késői transzláció után jutnak el a sejtmembrán azon szakaszaihoz, ahol a vírus majd el fogja hagyni a sejtet. A fúziós proteinek a szomszédos sejtek közötti membránkapcsolatok feloldásával összeolvasztják a fertőzött és nem fertőzött szomszédos sejteket, így hatalmas közös plazmájú óriássejtek jönnek létre, amelyekben a sejtmagok csoportba verődve vagy koszorú alakban láthatók. Ezek az óriássejtek membránalagutakon keresztül kapcsolatba maradnak egymással, és kialakul a syncytium (101. ábra). A syncytium kiváló lehetőséget biztosít a vírusnak az intracelluláris terjedésre (ez a szervezet szintjén történő fertőzéskor rendkívüli előnyt jelenthet a vírusnak az immunrendszerrel szemben). A sejtek lekerekedése és a sejtfúzió a natív (nem festett) egyrétegű szövettenyészetben is jól elkülöníthető a nem fertőződött sejtektől (102. ábra)

101. ábra - Vírusok cytopathogen hatása (syncytium) Aujeszky-vírussal (utcai vírustörzs) fertőzött sertésvesesejtek (SEM 1400 ×)

kepek/101abra.png


102. ábra - Nem fertőzött egyrétegű sertésvese-sejttenyészet (SEM 1400 ×)

kepek/102abra.png


A DNS-vírusok közül egyedül a herpesvirus (Alphaherpesvirinae), az RNS-virusok közül több viruscsalád (paramyxo, corona, RS stb.) is képez syncytiumot. A herpesvirusoknál a syncytiumképzés intenzitása függ a vírustörzs virulenciájától és a fertőzött sejt típusától.

Egyéb cytopathogen hatások. A hemadszorpció egy olyan sejtmembrán-károsítással járó esemény, amikor a sejtmembránba beépült vírusfehérje képes megkötni a sejt felületén a vörösvérsejteket. Hemadszorpciót azok a burkos vírusok alakítanak ki, amelyek vörösvérsejtet megkötő (agglutináló) felszíni fehérjével (HA) rendelkeznek. A jelenséget a laboratóriumi vírusdiagnosztikában (hemadszorpciós próba) is alkalmazzuk, egyes vírusok (paramyxovirus, afrikai sertéspestis virusa) felismerésében.

A további cytopathologiás elváltozások, mint a sejtek rögösödése (parvovirus), sejtek vakuolizációja (BVD-, adenovirus, Aujeszky-virus) festett sejtkultúrákban tanulmányozhatók. A felsorolt sejtkárosító hatások együtt és külön-külön is a sejt lízisét okozzák, ami végső soron a sejt halálához vezet.

Nem vírusspecifikus sejtkárosító hatás jön létre a szövettenyészet elöregedése, a tápfolyadék pH-jának, az inkubáció hőmérsékleténekmegváltozása miatt. A vírusizolálásra nem kellően előkészített minta (pl. bélsár), toxintartalma, baktériumos fertőzöttsége (pl. mycoplasma, leptospira) olyan degenerációkat hozhat létre a sejttenyészetben, ami könnyen összetéveszthető a vírusok által okozott CP-hatással. Ezekben az esetekben több laboratóriumi diagnosztikai módszer (szövetátoltás, VN próba, immunhisztokémia stb.) összehangolt alkalmazása segít a specifikus és nem specifikus CP-hatások elkülönítésében.

A sejttenyészetben kialakuló cytopathogen hatás nem minden esetben jelenti a vírus szervezetre kifejtett pathogen hatását is. Az árva (orphan) vírusok egy része kifejezett cytopathogen hatást mutat, de az állatban nem okoz klinikai tünetekben megnyilvánuló fertőzést. Ugyanakkor a sertéspestis vírusa sertéssejtvonalakon nem fejt ki cytopathogen hatást, de a szervezet szintjén történő fertőződés legtöbbször a sertés elpusztulásához vezet.

Vírus–szervezet kölcsönhatások

A vírus–szervezet kölcsönhatásai bonyolult, hosszú evolúciós folyamat eredményeként alakultak ki. A vírus és a szervezet közötti kapcsolat lényegében három, egymástól függő folyamaton keresztül valósul meg:

• a vírus belépése a szervezetbe,

• a vírus eljutása a célsejtig,

• a vírus szaporodása a célsejtekben.

A vírus számára az első két folyamat csak kényszerű (és ki nem kerülhető) eszköz ahhoz, hogy megtalálja a szaporodásának feltételeit biztosító célsejteket. A célsejtekben történő vírusszaporodás kimenetele nagymértékben függ a vírus mennyiségétől, virulenciájától és szaporodási stratégiájától (pl. latencia), valamint a szervezet immunállapotától és a célsejtek fogékonyságától.

A vírusok a fertőzés után, rendszerint a fertőzési kapuban (szervezetbe történt belépés helyén) elszaporodnak. A vírusok egy része vagy lokalizált vagy generalizált fertőzést okoz.

A lokalizált fertőzés során a vírus csak a fertőzési kapuhoz tartozó szervben vagy esetenként a szervhez tartozó regionális nyirokcsomóban szaporodik el (elsődleges vírusszaporodás). A fertőzési kapu hámsejtjeit elhagyó vírusok az extracelluláris térbe lépnek, és a nyirokereken keresztül jutnak el a regionális nyirokcsomókba. Az extracelluláris térben és a nyirokerekben levő macrophagok a legtöbb lokalizált fertőzést okozó vírust ekkor megemésztik, és ezáltal elejét veszik a fertőzés szervezeten belüli terjedésének (pl. egyes poxvirusok, papillomavirusok). Más vírusok (pl. morbillivirusok, arterivirusok) azonban képesek elszaporodni a macrophagokban és a lymphocytákban is, így akadály nélkül juthatnak el a regionális nyirokcsomókba és a véráramba, amivel kezdetét veszi a generalizált fertőzés. Ezt a lehetőséget azonban számos, lokális fertőzést okozó vírus nem tudja kihasználni, mivel hiába jut el más szervekhez, ha adszorpciós fehérjéi kizárólag a fertőzési kapuban levő sejtekhez adaptálódtak (pl. rotavirusok, enterális coronavirusok, egyes paramyxovirusok, ortomyxovirusok).

A generalizált fertőzés során a vírus elhagyja a primer vírusszaporodásra szolgáló szervet, és a nyirokrendszeren keresztül belép a véráramba. A generalizált fertőzésnek azt a szakaszát, amíg a vírus a véráramban tartózkodik, viraemiának nevezzük. Egyes vírusok még a viraemiás időszak alatt is folytatják a primer vírusszaporodást, de most már a fehérvérsejtekben (pl. arterivirusok) és/vagy az erek endothelsejtjeiben (sertéspestis vírusa). Általában hosszan tartó viraemiához vezet a nyirokszervek (lép, csontvelő, nyirokcsomók) és a máj vírusos fertőzöttsége. A vérárammal a vírusok eljutnak a fertőzési kaputól nemegyszer távol levő szervekbe is, ahol ismételten lehetőségük nyílik a vírusszaporodásra (másodlagos vírusszaporodás). Több vírusfertőzés esetében ez a másodlagos vírusszaporodás felelős a nemegyszer végzetes kimenetelű kórtani folyamatokért (pl. IBR, Aujeszky-betegség, szopornyica).

A vírusfertőzés a szervezet szintjén abban különbözik a sejt szintű fertőződéstől, hogy a fertőzés kimenetelét (és nemegyszer a létrejöttét is) alapvetően meghatározza az immunrendszer állapota.

A vírus bejutása és terjedése a szervezetben

Természetes körülmények között a vírus a szervezetbe a bőr vagy a légző, emésztő és urogenitális rendszer nyálkahártyasejtjein, valamint a kötőhártyán keresztül juthat be. Speciális bejutási lehetőséget jelent az ízeltlábúak szúrása (pl. arbovírusok), az állatok harapása (pl. veszettség) és az orvosi beavatkozás (injekciós tűvel, sebészi műszerekkel, pl. leukózis, sertéspestis). A szervezetbe bejutó vírus első szaporodási ciklusával (ami többnyire a behatolás helyén található sejtekben történik) kezdetét veszi a fertőzés.

Fertőzés a bőrön keresztül

Az intakt bőr hámrétege a vírusok számára átjárhatatlan. Az epidermis külső, keratinizálódó sejtjei speciális védelmet jelentenek a vírusokkal szemben, ugyanis a keratinizálódó sejtekben a vírusok szaporodása gátolt. Ez alól csak a papillomavirusok kivételek, mivel kapszidjaik felépüléséhez keratinra van szükségük.

A bőrön keresztüli fertőződésre akkor van lehetőség, ha a bőr folytonossága valamilyen ok (pl. felpállás, sérülés) miatt megszakad. A bőr sérülésein keresztül leggyakrabban a poxvirusok és a papillomavirusok alakítanak ki lokális fertőzést a bemeneti kapuban történt szaporodásuk révén. Mivel az epidermisz nem tartalmaz vér- és nyirokereket, az itt szaporodó vírusok többsége nem alakít ki generalizált megbetegedést (papillomavirusok, egyes poxvirusok). Ugyanakkor néhány vírus a dermiszben (irhában) jelenlevő fibroblastok és macrophagok segítségével eljuthat a vér- és nyirokáramba, ahonnan szétterjedve a szervezetben generalizált fertőzést alakíthat ki, vagy a bőrben (bőrcsomósodási kór) vagy a szervezet egyéb szerveiben is (egérhimlő, juhhimlő, SVD). Ezzel a lehetőséggel csak azok a vírusok élhetnek, amelyek képesek a fibroblastokhoz és a macrophagokhoz adszorbeálódni, illetve azokban elszaporodni.

A vírus bőrön keresztüli szervezetbe jutásának különösen veszélyes módja az ízeltlábúak szúrásával-harapásával történő behatolás (kullancsok, szúnyogok, tetvek, legyek stb.). Az ízeltlábúak szúró szájszerve ugyanis többnyire a bőr alatti rétegbe, nemegyszer közvetlenül a benne futó nyirok- és vérerekbe juttatja a vírust, ami kitűnő lehetőséget teremt a szervezeten belüli gyors invázióra. A házi légy (Musca domestica), habár nem rendelkezik szúró szájszervvel, praestomális fogaival képes legalább három sejtréteget kiharapni a szöveti kötelékből, így fertőzésközvetítő szerepe jelentősebb, mint korábban gondolták.

Az ízeltlábúak lehetnek ún. mechanikai vektorok, amikor a vírust, csak mint „felületi szennyező anyagot” hordozzák testfelületükön (szájszervükön), és azok az ízeltlábú táplálkozása során, „mechanikusan” kerülnek be a melegvérűek szervezetébe (pl. Aujeszky-vírus, myxomatosis vírusa, baromfi himlővírusa). Egyes vírusok azonban képesek elszaporodni a melegvérű fajt megtámadó ízeltlábú sejtjeiben is, így ezek az ízeltlábúak biológiai vektorokká válnak (pl. az afrikai sertéspestis vírusa az Ornithodorus kullancsfajokban nemcsak elszaporodni képes, hanem transovarialisan a kullancs utódaiba is átmegy, így a kullancsgenerációk végtelen sokaságát teszi biológiai vektorrá). Az ízeltlábúakat mint biológiai vektorokat igénybe vevő vírusokat, korábban az arbovirusok (arthropode born) csoportjába sorolták (alpha-, flavi-, orbi-, bunyavirusok).

Különleges, bőrön keresztüli fertőződést jelent a vírussal fertőzött gerinces harapása, amelynek révén a vírus közvetlenül bejuthat a nagy vérerekbe és az idegekbe is (pl. veszettség).

Az orvosi beavatkozások során (pl. vakcinázás, farokcsonkítás stb.) az injekciós tűvel vagy sebészi eszközzel subcutan, intramuscularisan vagy akár intravénásan is beoltható az eszközre tapadt vírus. Ebből a szempontból különösen veszélyes a tömegoltó készülékek használata, mivel egy viraemiás állapotban levő állat vakcinázása során annyi vírus kerülhet a tűre, amivel több állat is fertőzhető (pl. sertéspestis, leukózis, fertőző lóarteritis, macska immunhiányos betegségének vírusa).

Fertőzés a légzőszerveken keresztül

A légzőszervek és a hozzájuk tartozó testnyílások rendkívül fontos bemeneti kaput jelentenek a vírusok számára. A legtöbb vírus ezt az utat választja a fertőzéshez.

A légző rendszert megtámadó vírusoknak az alábbi akadályokat kell legyőzni a sikeres fertőzés megindításához:

• A felső légutak 33 °C-os hőmérséklete nem kedvez a testhőmérséklethez (37–39 °C) adaptálódott víruspolimeráz enzim működésének. (A rhinovirusok éppen ezt a hátrányt fordították javukra, mivel polimeráz enzimjük 33 °C-on aktív.)

• A légutak felületét borító mucociliaris hámsejtek egyrészt mechanikus szűrőként viselkednek, másrészt az általuk szekretált nyálka vírusspecifikus IgA ellenanyagokat tartalmazhat, amelyek már a bemeneti kapuban megakadályozzák a vírusok adszorpcióját (pl. a herpesvirusok elleni intranasalis vakcinázáskor éppen ezt a jelenséget használjuk ki).

• Az alveolusokban jelenlevő lymphoid sejtek és macrophagok a phagocytosis révén jelentősen csökkentik a vírusok megtelepedését (immunszuppresszált vagy immunhiányos állatok ezért is fogékonyabbak a légúti vírusfertőzésekkel szemben).

A légzőszerveket a vírusok általában aerosol formájában érik el, ami annak köszönhető, hogy a légúti fertőzésben szenvedő állat köhögése és tüsszögése révén aerosol formában juttatja ki a külvilágra a fertőző víruspartikulákat tartalmazó hörgőváladékát. Az aerosolcseppek átmérője alapvetően meghatározza a vírus fogékony szervezetbe jutásának lehetőségét a légutakon keresztül.

• A 10 μm-nél nagyobb partikulák általában lerakódnak az orrüregben, többnyire az orrkagylókat borító nyálkahártyákban. Az orrüreg anatómiai szűrőjén fennakadt vírusnak további komoly akadályt jelenthet a nyálkahártyasejtek által esetlegesen kiválasztott IgA ellenanyagok semlegesítő hatása. Amennyiben ezeket az akadályokat sikerül a vírusoknak elhárítani, az orrüreg hámsejtjeiben kitűnő lehetőséget találnak a szaporodásra, sőt egyesek (pl. herpesvirus) a szaglóhámon és a szaglóidegen keresztül az idegrendszerbe történő közvetlen bejutásra is.

• Az 5–10 μm közötti partikulák elérik légcsövet és a hörgőket, itt azonban nagy részük fennakad a mucociliáris rétegben. (Ha a ciliumok retrográd mozgása gyógyszerek vagy társfertőzések hatására lelassul, vagy leáll, a szervezet légúti fertőzésekkel szembeni fogékonysága megnő, mivel az 5 μm-nél nagyobb partikulák is „lecsúsznak” az alveolusok közelébe.)

• Az 4 μm-nél kisebb partikulák (mint a gázmolekulák) az inhaláció révén általában közvetlenül eljutnak a tüdő alveolusaiba, ahol a vírusok az alveolust borító egyetlen hámsejt rétegen való áthatolás után már belépnek a véráramba, amennyiben sikerül elkerülniük az alveoláris macrophagok emésztő hatását.

Az aerosolpartikulákban a vírusok túlélése nagymértékben függ a környezet hőmérsékletétől, páratartalmától és a nap UV sugárzásától. A burkos vírusok ellenállóbbak az alacsony páratartalom esetén bekövetkező kiszáradással szemben, mint a nem burkos vírusok. A légúti fertőzést okozó vírusok esetén különösen jelentős airborne (levegővel terjedő) fertőzési mód tanulmányozása során megfigyelték, hogy az aerosolcseppekbe zárt vírusok több mint 40 km távolság megtétele után is megtartották fertőzőképességüket (Aujeszky-vírus).

A felső légutakba nemcsak belégzéssel, de kontaminációval is bejuthatnak vírusok (pl. a humán rhinovirusokkal történő fertőzésben kiemelt szerepet játszik az ujjakra tapadt vírus „orrpiszkálás” útján történő bejuttatása). A légző rendszerbe jutó vírusok egy része csak lokálisan szaporodik el (pl. rhinovirusok, coronavirusok, adenovirusok), más részük generalizált megbetegedést okoz (pl. herpesvirusok, paramyxovirusok).

Fertőzés az emésztő rendszeren keresztül

A szervezetbe az emésztő rendszeren keresztül bejutó vírusok egy rendkívül ellenséges környezettel találják szemben magukat, amíg eljuthatnak a szaporodásukhoz ideális környezetet biztosító bélhámsejtekhez. A gyomor savas pH-ja, a bél alkalikus pH-ja és fehérjeemésztő enzimei ,az epesavak emulgeáló hatása, valamint a bélhámsejtek által szekretált IgA ellenanyagok olyan hatékony védelmet jelentenek a szervezetnek, hogy a vírusoknak csak viszonylag szűk köre (rotavirusok, coronavirusok, enterovirusok, astrovirusok, torovirusok, reovirusok) képes az áttörésére. A vírus a következő (eddig megismert) stratégiákkal próbálja megóvni a multiplikáció szempontjából létfontosságú adszorpciós fehérjéit a felsorolt károsító hatásoktól.

Egyes virusoknál (pl. enterovirusok, rotavirusok, calicivirusok) az adszorpciós fehérjék térszerkezete biztosítja a gyomorsavval szembeni rezisztenciát. A rhinovirusok pl. éppen a savas pH-nak köszönhetően vesztik el az adszorpcióhoz szükséges felszíni fehérjéjüket (VP 4 protein).

Az epesavak emulgeáló hatása elsősorban a burkos vírusok számára jelent veszélyt, mivel kizárólag ezek felszíni fehérjéiben találhatók lipidek (vélhetően e hatásra kialakuló szelekciónak köszönhető, hogy az emésztő rendszeren keresztül támadó vírusok közül egyedül a coronavirusok viselnek burkot).

A fehérjeemésztő enzimek hatását a vírusok nem tudják elkerülni, ezért fehérjéiket különböző módszerekkel próbálják védeni. A felszíni fehérjék védelmét az anyatej, illetve a táplálék pufferkapacitásával biztosítják (pl. coronavirusok). Egyes vírusok (rotavirusok, coronavirusok, reovirusok) a receptorkötő fehérjék egy részét inaktivált, ún. komplex fehérje formában hordozzák. A proteáz enzimek vágáshelyei éppen azokat a felszíni struktúrákat érintik, amelyek az inaktivált állapotban levő adszorpciós fehérjék aktiválásához szükségesek (pl. proteáz inhibitorok jelenlétében a reovirusok szaporodása csökken, ugyanakkor tripszinkezelésre a rotavirusok infektivitása megnő).

Bizonyos vírusok kizárólag a bélhámsejtben képesek elszaporodni (rotavirus), míg más vírusok (pl. reovirus, poliovirus) a bél lumene felől eljutnak a bélhám alatti lymphoid szövetbe (Peyer-plakkokba) is. A reovirusok esetében bizonyították, hogy ezt a transzportot a bélhám speciális, ún. „M sejtjei” végzik, amelyek több táplálékfehérjének a transzportjáért felelősek. Az enterovirusok egy része a bél hámsejtjeiből a központi idegrendszerbe is eljut, ahol poliomielitist okoz (fertőző sertésbénulás).

Az emésztőszerven keresztül támadó vírusok esetében még nem ismertek azok a faktorok, amelyek elősegítik, hogy az emésztő rendszerre korlátozódó fertőzés generalizált fertőzéssé váljon.

A nemegyszer súlyos enterális megbetegedést okozó parvovirusok (CHV-2, MEV), az emésztő rendszer megkerülésével, a véráram felől érik el a bélhámsejteket, miközben – a corona- és rotavirus-fertőzésekkel ellentétben – az azokat pótló basalis sejteket is elpusztítják (103. ábra).

103. ábra - Enterális kórképet okozó vírusok támadáspontja

kepek/103abra.png


Fertőzés az urogenitális rendszeren keresztül

A vírusok esetében az uréteren keresztüli ascendáló fertőzésnek nincs nagy jelentősége (egyes adenovirusok esetében még vitatott, hogy az uréter vagy a véráram felől érik el a húgyhólyagot, amelynek sejtjeiben elszaporodnak).

Az érintetlen genitáliák fiziológiás környezete (hüvelyváladék pH-ja, kémiai összetétele, a vizelet savas hatása) hatékony védelmet biztosít a vírusfertőzésekkel szemben. A szexuális érintkezés, illetve művi beavatkozások során (mesterséges termékenyítés, hüvelyvizsgálat stb.) a genitáliákon kialakuló nyálkahártya-sérülések ugyanakkor több vírus számára jelentenek bemeneti kaput (herpesvirus, papillomavirus). Ennek során a nemi szervekben és esetleg a húgyutakban (papillomavirus) történő lokális elszaporodás után akár generalizált fertőzést is kialakíthatnak (Aujeszky-vírus, BHV–1,).

Fertőzés a conjunctiván keresztül

A conjunctiva hámsejtjeiben elszaporodó vírusok (pl. adenovirus, herpesvirus, BVD) lokális elváltozásokat (conjunctivitist, szaruhártyahomályt) hoznak létre, amelyek bakteriális társinfekció hatására súlyosbodhatnak (szaruhártyafekély, vakság).

A lokális elszaporodás helyéről kiindulva egyes vírusok generalizált fertőzést alakíthatnak ki. (Az Aujeszky-vírus és a humán enterovirus 70, a conjunctiva felől eljut a központi idegrendszerbe, ahol ismételt elszaporodásával többnyire halálos kimenetelű megbetegedést okoz.)

Az idegrendszer fertőzése

Az idegrendszer természetes körülmények között nem jelent fertőzési kaput a vírusoknak, ezért ebben a fejezetben az idegrendszer szervezeten belüli fertőződésének körülményeit vizsgáljuk. A vírusok többsége a központi idegrendszert két úton éri el. Vagy a véráram felől, vagy a perifériás idegeken keresztül.

A vérárammal érkező vírus többféleképpen kerülheti ki a „vér–agy gát” blokkoló hatását. A vírusok egy része elszaporodik az agyi kapillárisok endothelsejtjeiben, és azok destrukciója után már közvetlenül eléri az agysejteket, míg a vírusok másik csoportja az endothelsejtek károsítása nélkül, közvetlen passzív transzporttal jut be az agyszövetbe a vasculáris réseken keresztül. A véráramban levő vírus ritkán a lymphocytákba és/vagy leukocytákba zártan, azok migrációja során jut át a vér–agy gáton. A meningitist okozó vírusok (pl. flavivirusok) többnyire az agyhártya vagy a kamrai érfonat (plexus chorioideus) sejtjeiben szaporodnak el, melynek eredményeképpen az agykamrák ozmotikus nyomása megemelkedik. Az ebből adódó interstitialis oedema kitűnő lehetőséget teremt az agyszövetben történő intenzív vírusterjedésnek.

A perifériáról támadó vírusok axonális transzporton keresztül, az idegrostokban haladva érik el a központi idegrendszert. Ennek a szervezeten belüli terjedési módnak az a rendkívüli előnye, hogy a perifériás idegrendszerben megbújó vírus „láthatatlan” az immunrendszer számára. In vivo kísérletekkel bizonyították, hogy a veszettség vírusa (rhabdovirus) az izomsejtekben a neuromuscularis junctio nikotin acetilkolin receptoraihoz kapcsolódva jut át az idegsejt axonjába, ahol a cytoplasmaáramlás szállítja tovább az idegtest felé. Amíg a herpesvirusok az axonba jutva fertőzik a Schwann-sejteket, addig a veszettséget okozó vírusok az idegsejt fertőzése nélkül jutnak el a központi idegrendszerbe a viszonylag gyors (100-400 mm/nap) axonális transzporttal. A spongiform encephalopathiát okozó prionfertőzések esetén lassú (0,5–1,3 mm/nap) axonális transzportot figyeltek meg.

A szervezet fogékony sejtjeibe eljutó vírus a multiplikációja során különböző típusú fertőzéseket alakít ki.

A vírusfertőzés típusai

Amikor a szervezet először találkozik a vírussal, a kialakult kapcsolatot akut fertőzésnek nevezzük. Az akut fertőzés kimenetele háromféle lehet:

• a szervezet eliminálja a vírust és vírusmentessé válik (klinikai értelemben, felgyógyul),

• a vírus a szervezet halálát okozza,

• a vírus hosszabb-rövidebb ideig fennmarad (perzisztál) a szervezetben.

Azt az állapotot, amikor a vírus az akut fertőzés után együtt él a szervezettel, perzisztens fertőzésnek nevezzük. Járványtani és kórtani szempontból a perzisztens fertőzés rendkívül jelentős, mivel kitűnő lehetőséget biztosít a vírusnak a természetben való túlélésre és terjedésre, valamint meghatározó szerepet játszik az immunpathológiai kórképek és a neoplasiák kialakulásában. A perzisztens fertőzések kialakulásában nemcsak a kórokozó vírus de a szervezet immunállapota is meghatározó szerepet játszik (19. táblázat).

19. táblázat - Perzisztáló fertőzések kialakulásának okai

A vírus részéről:

• nem immunogén az ágens (pl. prion),

• a vírusgenom integrálódik a sejt kromoszómájába (retrovirusok),

• a vírus az immunrendszertől védett helyen szaporodik (pl. herpesvirusok latenciája a ganglionban),

• a vírusnak csökkent a virulenciája (sertéspestis),

• gyors antigénsodródás a szervezetben (lentivirusok),

• diaplacentáris fertőzés (hepatitis B, hantavirus, stb.)

Az immunrendszer részéről:

• ellenanyagot nem termel, mert az ágens nem immunogén (prion),

• ellenanyagot nem termel, mert a vírus „elbújt" (herpesvirus, Rabies vírus),

• ellenanyagot termel, de az nem neutralizálja a vírust (afrikai sertéspestis BHV–4),

• immunrendszer károsodott (veleszületett immundeficienciák),

• immunrendszert a vírus károsítja a multiplikációja során (PRRS, HIV),

• makrofágkárosítás (afrikai sertéspestis, PRRS),

• lymphoid sejtkárosítás(fertőző bursitis, cytomegalo vírus, HIV),

• immuntolerancia (BVI, sertéspestis, retrovirusok)


A perzisztens fertőzéseken belül a vírusürítés, a vírushordozás és a klinikai tünetek jelenléte és kifejeződése alapján megkülönböztetünk:

• latens,

• krónikus (alkalmilag krónikus),

• és lassú fertőzéseket.

Klinikai értelemben a vírusfertőzés lehet tünetekben megnyilvánuló (apparens) vagy klinikai tünetek nélkül (innapparens) jelentkező, ún. szubklinikai megbetegedés. A perzisztens fertőzések közül valódi szubklinikai megbetegedés a latens és a lassú fertőzések alatt alakul ki, bár ez utóbbiban a klinikai tünetek megjelenése a szervezet halálát okozza. A krónikus fertőzések során átmenetileg jelentkezhet klinikai tünet. A perzisztens fertőzésekről összefoglaló áttekintést ad a 101. ábra.

Latens fertőzés

Az akut fertőzés után egyes vírusok (pl. herpesvirus, retrovirus) a szervezet meghatározott sejtjeiben latens fertőzést alakítanak ki. A latens fertőzés alatt a vírus felfüggeszti szaporodását, ezért kizárólag nukleinsav- és vírustranszkriptek (LAT) formájában van jelen a szervezetben. A latens vírusgenom vagy extrakromoszomálisan (pl. herpesvirus) helyezkedik el a sejtmagban, vagy integrálódik a sejt kromoszómájába (pl. retrovirusok).

Latens fertőzés alatt az állat tünetmentes, nem üríti a vírust, és a szervezetben komplett vírust nem lehet kimutatni. A vírushordozás csak vírusnukleinsav formájában történik. (A szervezetben vírust nem lehet izolálni). A latens fertőzés adott esetében az állat életének végéig fennállhat, de gyakoribb, hogy a latens genom reaktiválódik és megindul az utódvirionok szintézise.

A reaktiváció eredményeként vírustermelés indul meg, ami a szervezet szintjén vírusürítést és vírushordozást eredményez. A reaktiváció során enyhe fokú klinikai tünetek is jelentkezhetnek. A reaktiváció tehát alacsonyabb szinten megismételt akut fázisnak is felfogható. Az akut fertőzés során kialakult immunmemóriának köszönhetően a reaktiváció alatt termelődő virionok nagy részét az immunrendszer eliminálja, ezért lesznek enyhébbek a klinikai tünetek és ezért ürít kevesebb vírust a fertőzött állat.

A latensen fertőzött állat óriási veszélyt jelent fogékony társaira, mivel egyelőre tisztázatlan, hogy természetes körülmények között mikor és milyen hatásra reaktiválódik benne a latens vírus. Ez a fertőzési veszély még fokozottabb, ha a latencia keringő lymphocytákban alakul ki (retrovirus-fertőzések), mert ilyenkor a latens vírus a lymphocytákat tartalmazó vérrel és testváladékokkal átkerülhet fogékony egyedekbe (pl. vérvétel, transzfúzió) anélkül, hogy reaktiválódna. Herpesvirus-fertőzéseknél kimutatták, hogy bizonyos immunszuppresszív hatások (stresszhelyzetek, kortizonkezelések) reaktiválják a latens fertőzést. A latens fertőzés és a reaktiváció veszélye miatt pl. minden herpesvirussal fertőződött állatot élete végéig potenciális vírusterjesztőnek kell tekinteni, még akkor is, ha klinikailag egészséges.

Krónikus fertőzés

Krónikus fertőzés során a vírusmultiplikáció esetenként kisebb-nagyobb megszakításokkal ugyan, de zavartalan. Ezért krónikus fertőzéseknél akár évekig is tartó folyamatos vírushordozás, folyamatos vagy periodikus vírusürítés alakul ki (104. ábra). A betegségre jellemző klinikai tünetek nem jelentkeznek, vagy csak nagyon enyhe formában láthatók.

104. ábra - A perzisztáló vírusfertőzések típusai (Fenner (1987) után módosítva)

kepek/104abra.png


A folyamatos vírusürítéssel járó krónikus fertőzések (sertéspestis, BVD, arenavirus-fertőzések) általában a magzati életben bekövetkezett fertőzéssel szembeni immuntoleranciának köszönhetőek. A periodikus vírusürítés a postnatalis fertőzések során alakul ki (ragadós száj- és körömfájás, afrikai sertéspestis). A száj- és körömfájás vírusa pl. a kérődzők garathámsejtjeiben alakít ki krónikus fertőzést, ezért a fertőzött (tünetmentes) állat köhögésekor a garatváladékkal nagy mennyiségű vírust juttat ki a környezetébe.

A postnatalis életben kialakult krónikus fertőzés a folyamatos vírustermelés révén állandó antigéningert biztosít az immunrendszernek, ezért a szervezetben mind a vírus, mind az ellene termelődő ellenanyag kimutatható. Ha a magzati életben történő fertőzés immuntolerancia kialakuláshoz vezet, a megszülető állat úgy termeli és üríti a vírust, hogy a szervezet nem termel ellene ellenanyagot, mivel a vírusfehérjéket „sajátjaként” ismeri fel.

A kutyák szopornyicavírussal történt fertőződése után ún. alkalmilag krónikus fertőzés is kialakulhat (104. ábra). Az akut fertőzést túlélt kutyák egy részében az akut fertőzés alatt a vírus eljuthat a központi idegrendszerbe, ahol egy viszonylag lassú vírusszaporodás történik, amelynek eredményeként az ún. posztinfekciós agyvelőgyulladás vagy gyakran néhány év után rendszerint halálos kimenetelű ún. öregkori (old dog) encephalitis alakul ki. Az idegrendszeri károsodást a vírus indítja el, de annak súlyosbodásáért a lokális immunpathológiás folyamatok felelősek.

Hasonló esemény játszódik le a szopornyicavírussal rokon humán kanyaróvirus-fertőzéskor, ahol a krónikus fertőzés egy halálos kimenetelű szubakut sclerotikus panencephalitis kialakulásához is vezethet. Ezekben az esetekben a kanyaró vírust kokultivációval izolálni tudták az idegsejtekből.

Az alkalmilag krónikus fertőzések során tehát komplett vírushordozás van, és a klinikai tünetek megjelenése esetenként halálhoz vezet. Mivel a vírustermelés a központi idegrendszerben történik, az alkalmilag krónikus fertőzés alatt vírusürítést nem tapasztaltak. A vérben a vírusspecifikus ellenanyagok folyamatosan kimutathatók.

Lassú fertőzések

A lassú fertőzések valójában olyan elhúzódó akut megbetegedések, amikor a klinikai tünetek megjelenése előtti állapot (inkubáció) rendkívül sokáig (akár évekig) is tart. A perzisztens fertőzés tulajdonképpen az inkubációs periódusban alakul ki, amikor a vírus kimutatható az állat szervezetében (104. ábra). Egyes vírusok esetében (HIV, lovak fertőző anaemiája) a testváladékokkal történő (sejthez kötött) vírusürítést figyeltek meg.

Lassú fertőzést eddigi ismereteink szerint a lentivirusok és a prionok alakítanak ki. A Lentivirusok okozta lassú fertőzések során a vírus a macrophagokban (visna-maedi), a T-lymphocytákban (HIV, BIV, FIV), valamint az agy, a tüdő és az ízületek sejtjeiben perzisztál. A fertőzés során keletkező ellenanyagok nem neutralizálják a vírust.

Az átoltható szivacsos agyvelőbántalmat okozó prionfertőzések során a „fertőző fehérjék” az idegrendszer és a lymphoid szövet sejtjeiben halmozódnak fel és a scraepi kivételével egyetlen esetben sem bizonyították a kórokozó testváladékokkal történő ürítését. A fertőző prionmolekulák ellen nem termelődnek sem specifikus ellenanyagok, sem interferonok (lásd Prionok c. fejezet).

A vírusfertőzések diagnosztikája

A különböző kórformákat előidéző, pathogen vírusok elleni védekezés az állatorvosi munka egyik leglényegesebb eleme. A hatékony védekezés alapvető feltétele pedig a specifikus és lehetőleg minél gyorsabb diagnózis.

Hazai viszonyok között a gyakorló állatorvosoknak vírusdiagnosztikai munkára alig van lehetőségük. Néhány kórokozó kimutatására ugyan már forgalomban vannak olyan diagnosztikai készletek (pl. antigénkimutatásra vagy szerológiai gyorsvizsgálatokra alkalmas reagenskészletek), melyekkel egyes vizsgálatok a mintavétel helyszínén is elvégezhetők, de a specifikus vírusdiagnosztikai munkához (szövettenyésztéshez, diagnosztikai minták feldolgozásához stb.) szükséges feltételek az esetek túlnyomó többségében csak laboratóriumi körülmények között teremthetők meg. A vírusfertőzések specifikus diagnosztikájában ezért többnyire nélkülözhetetlen a gyakorló állatorvos munkáját kiegészítő intézeti vizsgálat, pl.

• amikor a klinikai kép és a helyszínen végzett boncolások valamely vírusos betegség gyanúját vetik fel, de egyértelmű diagnózis nincs,

• amikor rendelet vagy jogszabály írja elő, pl. valamely egzotikus betegség (afrikai sertéspestis, száj- és körömfájás stb.) gyanújának megerősítése vagy kizárása céljából, mentesítési eljárások során a folyamat ellenőrzése céljából,

• mentesség igazolásához (SPF állományok, spermadonorok ellenőrzése során, kiállításra, versenyre szállított állatok esetében stb.),

• egyes állományok járványhelyzetének („vírusterheltségének”) felmérésekor,

• zoonosis (állatról emberre terjedő betegség, pl. veszettség) gyanúja esetén stb.

A vírusfertőzések felismerésére direkt és indirekt módszereket alkalmazunk; a direkt eljárások során magát a vírust vagy annak valamely alkotórészét (fehérje- vagy nukleinsav-komponenseit) mutatjuk ki, az indirekt (vírusszerológiai) eljárásokkal pedig az ezek hatására a fertőzött állatokban termelődött ellenanyagokat.

A vizsgálat célja meghatározza, hogy milyen vizsgálati anyagot kell a laboratóriumba küldeni: a beteg vagy elhullott állatot vagy az abból származó szerveket, szervdarabokat, tamponmintákat, vért, vérsavót stb. Állományszintű vizsgálatkor figyelni kell arra is, hogy a mintaszám statisztikailag reprezentatív legyen.

Mintavételnél igen fontos, hogy a mintát mikor és honnan vesszük és az mennyi idő alatt érkezik a vizsgálatot végző laboratóriumba. A direkt víruskimutatásra szánt diagnosztikai minták beküldésekor minél korábban, röviddel a klinikai tünetek jelentkezése után célszerű mintát venni, mielőtt a másodlagos (baktériumos) társfertőzések megnehezítenék az elsődleges kórokozó felderítését. A mintavétel az elváltozást mutató szervrendszerből történjék, pl. légzőszervi megbetegedés során élő állat esetén orrtampont, elhullott állatból pedig a tüdőt, a légcsövet vagy annak darabjait kell beküldeni. Frissnek (vagyis virológiai vizsgálatra legalkalmasabbnak) tekinthető a mintavételtől számított egy napon belül laboratóriumba érkező minta. Egyes, ma még meglehetősen ritkán és a betegségek szűk körében alkalmazott vizsgálati módszerekkel (pl. az ún. polimeráz-láncreakción alapuló eljárásnál, lásd később) bomló, autolizált mintából is kimutatható a vírus.

Az indirekt víruskimutatási vizsgálatokra szánt vérmintát alvadásgátló- és konzerválószert nem tartalmazó, steril csövekbe vesszük. Az intézetben a véralvadékot centrifugálják, a vérsavót elkülönítik, és felhasználásig –20°C-on tárolják.

Mindig különös figyelmet kell fordítani a legfontosabb járványtani és klinikai megfigyeléseket, a korábbi kezeléseket stb. felsoroló kísérőirat megírására, mely a laboratóriumi szakemberek munkáját irányíthatja és nagymértékben megkönnyíti.

A vírusok direkt kimutatása

Vírusizolálás

A vírus direkt kimutatásának alapvető módszere a vírusizolálás, vagyis az a folyamat, melynek során a diagnosztikai mintából a vírust valamelyik vírusszaporítási módszerrel (pl. embrionált tyúktojásban vagy szövettenyészetekben) elszaporítjuk és azonosítjuk (105. ábra). Az izolálás tehát csak akkor lehetséges, ha a mintában fertőzőképes virionok vannak, ezért kell a mintavételt a klinikai tünetek megjelenésekor (vagyis a vírusok tömeges ürülésekor) végezni.

105. ábra - A vírusizolálás folyamata

kepek/105abra.png


Mivel a vírusizolálási céllal beküldött minták általában baktériumokkal, takarmányszemcsékkel, szövettörmelékkel, porral stb. szennyezettek (pl. orrtampon, bélsár, hullából származó szervminta stb.), ezeket megfelelő módon elő kell készíteni. Először a mintához antibiotikumtartalmú pufferoldatot adunk az izotónia és az izoiónia biztosítása, illetve a baktériumszaporodás visszaszorítása érdekében. A szervdarabokat ebben a pufferoldatban homogenizáljuk (dörzscsészében, potterben stb.). Ezután viszonylag kis fordulatszámú centrifugálással leülepítjük a durva törmeléket. A vírustartalmú felülúszó folyadékot vagy szűréssel, vagy egy újabb, nagyobb fordulatszámon történő centrifugálással megtisztítjuk a finomszemcsés szennyeződéstől, baktériumoktól, spóráktól stb. Ezután olthatjuk a szuszpenziót tojásba és/vagy szövettenyészetre.

A vírus–sejt kapcsolódás korábban ismertetett specificitása miatt az ismeretlen vírust tartalmazó mintákat célszerű párhuzamosan többféle tenyészetre (vese-, here-, fibroblast-, pajzsmirigysejtekre stb.) leoltani. Ugyancsak az izolálás esélyeit növeli a kokultivációs technika vagy a fertőzésre fogékonyabb primer és szekunder tenyészetek alkalmazása sejtvonalak helyett. Még ilyen esetekben is gyakran előfordul, hogy a rendelkezésre álló sejttípusok közül egyik sem fogékony az adott vírusra, ezért az nem kezd multiplikálódni. Embrionált tyúktojások oltása esetén az oltás helyének helyes megválasztása is fontos a sikeres izolálás szempontjából.

A továbbiakban az oltott tojásokat lámpázással, a szövettenyészeteket mikroszkóppal naponta ellenőrizzük. Az oltott tojások szükség esetén felbonthatók, belőlük mintát lehet venni (pl. allantoisfolyadék, CAM-darab) és ezekkel kiegészítő vizsgálatokat lehet végezni (EM, HA). A szövettenyészetek szükség esetén a szövettani technikából ismert eljárásokkal megfesthetők. Amennyiben több napon át sem észlelünk vírus jelenlétére utaló elváltozást, akkor a tenyészet levált sejtjeit, kiszabadult virionokat stb. tartalmazó sejtfelülúszó folyadék 0,1–0,2 ml-ét (inoculum) friss szövettenyészetre oltjuk át. Ha a mintában fertőzőképes partikulák, a tenyészetekben pedig fogékony sejtek voltak, akkor legfeljebb két-három ilyen vakpasszázs után feldúsul a vírus, és jelentkezik a rá jellemző sejtkárosító hatás. A nem cytopathogen vírusok izolálásakor a vizsgálatot egyéb diagnosztikai eljárásokkal (EM, IF, immunperoxidáz-festés stb., lásd később) is ki kell egészíteni.

Az izolátumot ezután plakkozással szokták „tisztítani”, vagyis genetikailag egységes víruspopulációt alakítanak ki. Ekkor a fertőzött sejtfelületet tápfolyadékból és agarózból készült géllel fedik le, mely nem engedi, hogy egy adott sejtben frissen termelődött partikulák távoli sejtekhez jussanak el, hanem csak a közvetlenül szomszédos sejtekben indul meg az újabb szaporodási ciklus. Az ilyen, fokozatosan terjedő lokális elváltozást plakknak nevezzük (106. ábra). Egy plakkot megfelelő módszerrel kiemelve a tenyészetből, genetikailag tiszta (egyetlen virion utódaiból álló) víruspopulációt nyerünk: ettől kezdve az izolátumot vírustörzsnek nevezzük.

106. ábra - Plakkok szövettenyészetben

kepek/106abra.png


A plakktisztítás műveletét a gyakorlati vírusdiagnosztikában legtöbbször megelőzi a vírus azonosítása, vagyis vírusrendszertani helyének pontos megállapítása, noha elméletileg csak tisztított vírust lenne szabad azonosítani.

Legelőször azt kell megállapítani, hogy a vírus melyik családba tartozik.

• A törzs azonosításában segítséget nyújthat a mikroszkópos vizsgálatok során tapasztalt sejtkárosító hatás, a vírus sejtspektruma stb., de ezek önmagukban semmiképpen nem elegendőek, a pontos besorolást a vírus fizikokémiai tulajdonságainak vizsgálata teszi lehetővé.

• Kloroformkezeléssel állapítjuk meg, hogy burkos vagy burok nélküli vírust izoláltunk: a burkos vírusok e kezelés hatására elveszítik fertőzőképességüket, mivel lipidtartalmú burkukat (és ezzel a sejthez való kötődésben szerepet játszó külső fehérjéket) a kloroform leoldja.

• Elektronmikroszkópos vizsgálattal (legtöbbször ultravékony metszetekben vagy negatívkontraszt-eljárással) megállapíthatjuk a kapszid méretét, szimmetriaviszonyait, a kapszomerek rendeződését stb.

• A vírusszaporítás során a sejttenyészethez halogénezett uridinszármazékokat adva eldönthető, hogy a vírus genomja DNS vagy RNS. A halogénezett uridinszármazékok (jód-, bróm-dezoxiuridin) a DNS replikációja során a timidin helyére épülnek, ezért a vírus nem szaporodik. A timidint nem tartalmazó RNS-vírusok replikációját e vegyületek nem gátolják.

• A vírussal fertőzött szövettenyészetben akridinsárga festés után a szimpla szálú vírusnukleinsav piros, a dupla szálú sárga fényben fluoreszkál.

A fenti vizsgálatokat elvégezve megállapítható, hogy az izolátum melyik víruscsaládba tartozik. A továbbiakban szerológiai módszerekkel a vírus szerotípusát kell meghatározni. Erre az immunológiából ismert szerológiai eljárások, valamint a későbbiekben ismertetett vírusneutralizációs (VN) és hemagglutináló vírusok esetében a hemagglutinációgátlási (HAG) próbák használhatók.

A szerotípusokon belül gyakran szubtípusok, variánsok különíthetők el, melyek pathogenitása, virulenciája, szervspecificitása stb. eltérő lehet (pl. a szarvasmarha fertőző rhinotracheitisének vírusa, baromfipestis-vírus stb.). Mivel az ilyen fenotípusos változások hátterében mindig eltérő genetikai információ áll, az egyes változatok nukleinsav-vizsgáló módszerekkel (restrikciós endonukleázokkal végzett hasítás, heteroduplex technika, nukleinsav-hibridizáció) elkülöníthetők és azonosíthatók. Ha a genombeli eltérés a struktúrproteinek szerkezetében is változásokat okoz, akkor ezek poliakrilamid-gélelektroforézissel vagy monoklonális ellenanyagokkal kimutathatók még akkor is, ha hagyományos, poliklonális immunsavókkal a szerológiai próbákban a variánsok nem különíthetők el egymástól.

Kísérleti állatoltás

A fertőzőképes vírus kimutatására és azonosítására bizonyos esetekben még ma is alkalmazzák a diagnosztikai állatoltást, noha állatvédelmi okokból alkalmazási köre erősen beszűkült. Így pl. az afrikai lópestis és a veszettség diagnosztikájában a más diagnosztikai módszerekkel (immunfluoreszcencia, kórbonctani és kórszövettani vizsgálatok stb.) kiegészített állatoltás gyorsabb és megbízhatóbb diagnózist tesz lehetővé, mint a vírusizolálás.

Elektronmikroszkópos vizsgálatok

Az elektronmikroszkópos diagnosztikával nemcsak a fertőzőképes, komplett virionok mutathatók ki, mint az előző két esetben, hanem az éretlen, inkomplett, sőt üres kapszidok is (pl. burok nélküli herpesvirus-partikulák a sejtmagokban). Ez a módszer célravezető lehet olyan esetekben is, amikor a kórokozó vírus szövettenyészeten, tojásban vagy kísérleti állatoltással nem izolálható. (Pl. a házinyúl haemorrhagiás betegségének vírusát eddig nem tudták izolálni, diagnosztikájában és kórokozójának meghatározásában az elektronmikroszkópos vizsgálat igen fontos szerepet játszik.) Ezért a korábban említett vírusszerkezeti vizsgálatok mellett az elektronmikroszkóp a diagnosztikai munka során is felhasználható.

Az elhullott állatok szerveiből készült ultravékony metszetek (107. ábra) vizsgálata során a predilekciós helyekről vett minta sejtjeiben a termelődő víruspartikulák felismerhetők, egyes esetekben azonosíthatók is. Az immunelektronmikroszkópos vizsgálat (108. ábra) csak akkor alkalmazható, ha előre valószínűsíthető, hogy milyen vírus(ok) okoz(nak) egy adott megbetegedést. A vírusizolálásnál leírtak szerint előkészített (homogenizált, pufferrel kiegészített, centrifugált) vírusszuszpenzióhoz specifikus ellenanyagokat tartalmazó savót adunk (ennek helyes megválasztása érdekében kell előre behatárolnunk azon vírusok csoportját, melyek az adott kórkép kiváltásában szerepet játszhatnak). Az ellenanyagok hatására összecsapódó víruspartikulákat centrifugálással leülepítjük, és az üledéket negatívkontraszt-eljárással vizsgáljuk. A képződött virionhalmazok a látótérben a különálló virionoknál könnyebben megtalálhatók. A vizsgálat bizonyos vírusok esetében egyben szerotipizálásnak (vírusazonosításnak) is tekinthető.

107. ábra - Reovirusok elektronmikroszkópos képe fertőzött sejtben (Az Országos Állat-egészségügyi Intézet felvétele)

kepek/107abra.png


108. ábra - Rotavirusok immun-elektronmikroszkópos képe (Az Országos Állat-egészségügyi Intézet felvétele)

kepek/108abra.png


Vírusantigének kimutatása

A vírusantigének kimutatásakor ugyancsak a specifikus ellenanyagok kötődését használjuk fel diagnosztikai célból. Ezekkel az immunológiából ismert szerológiai próbákkal komplett és inkomplett virionok, sőt még a kapsziddá össze nem épült vírusfehérjék is kimutathatók. Természetesen a megfelelő savó kiválasztása itt is alapfeltétel, csak a kórbonctani és klinikai kép alapján valószínűsíthető kórokozók ellen termelt savók használata indokolt.

A direkt és indirekt immunfluoreszcenciás (IF) próba segítségével szövettani metszetekben, levált sejtekben (pl. rotavirus-fertőzés esetén a bélsárral ürülő hámsejtekben) vagy lenyomati készítményekben (pl. a veszettség diagnosztikája agyvelőlenyomati készítményekben) intracellulárisan mutatható ki az antigén (109. és 110. ábra).

109. ábra - Parainfluenza 3 vírus IF képe fertőzött sejt cytoplasmájában (dr. Köves Béla felvétele)

kepek/109abra.png


110. ábra - Adenovírus IF képe fertőzött sejtmagban

kepek/110abra.png


A további antigénkimutási eljárásokkal a sejtből kiszabadult (vagy különböző módszerekkel kiszabadított), oldatban lévő vírusok, vírusfehérjék mutathatók ki.

A komplementkötési (KK) próbával mutatják ki a vírusantigént pl. száj- és körömfájás esetén a szájnyálkahártya elváltozásaiból gyűjtött hólyagfalból, hólyagnyirokból.

Az agargél-precipitációs próbával vagy újabban annak kb. tízszer érzékenyebb és gyorsabb változatával az ellenáramú (counter current) immunelektroforézissel kimutathatók a fertőzött állatok bélsarából a nagy mennyiségben ürülő rota-, parvo- és adenovirusok.

Igen érzékenyek az enzimreakciókat és izotópos jelzést alkalmazó próbák (ELISA, RIA és ezek különféle változatai). E próbákban egyre gyakrabban alkalmaznak hibridomasejtekkel termeltetett monoklonális ellenanyagokat, kihasználva ezek specificitását, tisztaságát és standardizálhatóságát. E módszereket azonban inkább a fertőzött állatokban megjelenő ellenanyagok kimutatására, vagyis az indirekt víruskimutatásra használják, noha antigénkimutatásra is alkalmasak.

Vírusnukleinsav kimutatása

A korábban ismertetett nukleinsav-hibridizációs eljárás a genetikai kutatásokon kívül a vírusdiagnosztikában is felhasználható. A vizsgálati mintában lévő DNS-t hőkezeléssel hosszában felnyitják, majd hozzáadják a 32P izotóppal jelzett próba-nukleinsavat. Ez lehet fertőzött sejtekből tisztított vagy klónozás után baktériumokkal termeltetett DNS vagy mRNS. Amennyiben a vizsgálati anyagban van vírusspecifikus DNS, akkor az a komplementer próba-DNS-szállal kettős szálat alakít ki; ezt a többszöri mosás után is visszamaradó radioaktivitás jelzi. Az izotópfelhalmozódást általában autoradiográfiás módszerrel vagy műszeres méréssel mutatják ki.

Az eljárásnak a diagnosztikában két változatát használják. Az in situ hibridizáció során szövettani metszetekben mutatható ki a vírus-DNS (pl. az Aujeszky-féle betegség vírusával latens módon fertőzött ganglionokban). A dot blot hibridizációt a korábban már említett nitrocellulóz filtereken végzik (az eljárást ezért filterhibridizációnak is nevezik). Ilyenkor a vizsgálati mintát (szervdörzsölékből, orrtamponból stb. származó sejteket) nitrocellulóz filterre csöppentik, és kémiai úton roncsolják. A sejtekből kiszabaduló DNS aspecifikusan kötődik a filterhez. Hőkezelés és a megfelelő specifikus próba hozzácseppentése esetén a többszöri mosás után is visszamaradó radioaktivitás egyértelműen arra utal, hogy a mintában specifikus vírus-DNS volt (111. ábra).

111. ábra - Filterhibridizációs eljárás

kepek/111abra.png


Specificitásuk miatt a nukleinsav-hibridizációs próbák is csak olyan esetekben használhatók, ha szűkíthető azon vírusok köre, amelyek az adott fertőzést okozhatták, vagy sejtjük, hogy milyen vírus idézte elő a fertőzést, és ezt a feltevésünket akarjuk igazolni vagy kizárni. (A módszer ugyanis jelenleg még meglehetősen drága, és a különböző vírusokra specifikus próbanukleinsavakkal végzett párhuzamos vizsgálatok a költségeket megtöbbszörözik.) A sejtben latens fertőzést okozó vírus-DNS (pl. a kromoszómába épülő DNS közvetítőt alkalmazó retrovirusok vagy egyes herpesvirusok episomálisan perzisztáló nukleinsava) más módszerrel nem mutatható ki.

Az izotópok használatával járó sugárveszély kiküszöbölésére a diagnosztikában is alkalmazható az enzimreakciókon alapuló nukleinsav-kimutatás (pl. biotinnal jelzett próba-DNS) a foszforizotóp használata helyett.

A polimeráz-láncreakción (polymerase chain reaction, PCR) alapuló eljárással a latensen fertőzött sejtekből az igen kis mennyiségű nukleinsav is kimutatható, és ez a módszer alkalmas a régen elpusztult, autolizált sejtekből történő víruskimutatásra is. A vizsgálni kívánt sejtekből származó DNS-hez ekkor mesterségesen előállított, vírusspecifikus oligonukleotid szekvenciákat (primert, indító szakaszt) Thermobacter törzsekből származó polimeráz enzimet és nukleotidokat adnak. Az oligonukleotidok a fertőzött mintában levő vírus DNS-hez tapadva primerként szolgálnak a polimeráz enzim számára, amely a szabad nukleotidokból felépíti a teljes, vírusspecifikus nukleinsavat. A mintát ezután 90–96°C-ra melegítik (a thermobacter-polimeráz ezen a hőmérsékleten nem veszti el aktivitását), így a frissen szintetizált szál leválik a templátként szolgáló nukleinsavról. Ez a folyamat többször megismételhető, így a minden ciklusban megduplázódó templátokról az eredetinél nagyságrendekkel több vírus-DNS szál képződik, és ez a nukleinsav a következő lépésben filterhibridizációval vagy restrikciós endonukleáz emésztéssel azonosítható (112. ábra).

112. ábra - Polimeráz-láncreakció (PCR) folyamatábrája

kepek/112abra.png


A vírusok indirekt kimutatása

Az előbbiek alapján nyilvánvaló, hogy a direkt víruskimutatás a fertőző megbetegedések közül, főleg a heveny fertőzések esetében, csak egy igen rövid (néhány napos) vírusürítési, illetve vírushordozási periódusban lehetséges, és a siker még megfelelő mintavétel esetén is kétséges. Ezért sokszor az indirekt víruskimutatás módszereit kell felhasználnunk a vírusok okozta betegségek kórjelzésére vagy egy állományban rendszeresen előforduló vírusok meghatározására (vagyis az állomány járványtani állapotának felmérésére). Ilyenkor a különböző szerológiai módszerekkel a vérsavóban kimutatott ellenanyagok jelenléte utal egy állat vagy az állomány fertőzöttségére. Mivel az immunglobulinok a vérben a fertőzést követően több hónapig perzisztálnak, ebben az esetben a vizsgálat időpontja nem olyan szűken behatárolt. Lényeges, hogy figyelembe vegyük az állományban végzett esetleges immunizálásokat, valamint fiatal állatokban a maternális ellenanyagok jelenlétének lehetőségét. A jelenleg alkalmazott vakcinákkal és szerológiai módszerekkel ugyanis a maternális ellenanyagok, valamint a vakcinázás és a fertőződés következtében kialakuló immunglobulinok között többnyire nem lehet különbséget tenni.

A vírusellenes ellenanyagok kimutatásának két célja lehet. Az egyik, amikor a vizsgálat a járványtani állapot felmérésére irányul, vagyis azt kell megállapítani, hogy milyen vírusok fordulnak elő rendszeresen egy adott állományban. Ilyenkor a statisztikai mintavétel szabályai szerint (általában kb. az állatok 10%-ából) vett vérmintákat kell intézeti vizsgálatra küldeni. A több vírussal elvégzett szerológiai vizsgálatok során a pozitív eredmények mutatják az állomány vírusfertőzöttségét.

Más esetekben a vizsgálat célja az adott időpontban megbetegedéseket előidéző járvány kórokozójának felderítése. Ilyenkor a direkt víruskimutatás mellett (ha arra nincs lehetőség, ahelyett) savópárokat kell vizsgálni. Ez azt jelenti, hogy frissen megbetegedett állatokból veszünk vért, majd 2–3 hét múlva (áthangolódásuk után) ugyanazokból az állatokból ismét küldünk vérmintát. Ha a később vett mintákban egy adott vírus ellen ellenanyagok jelennek meg, vagy a korábbinál lényegesen magasabb titerben vannak jelen, az arra utal, hogy az állományban ez a vírus okozza a megbetegedéseket.

Az indirekt vírusdiagnosztikában az immunológiában tárgyalt ellenanyag-kimutatásra alkalmas eljárások használhatók fel: az agargél-precipitáció (AGP), a komplementkötési (KK) próba, az enzimreakción alapuló eljárások (ELISA) és a radioimmunológiai tesztek (RIA). Ezeken kívül van két szerológiai módszer, amelyeket a vírusszerológiában igen gyakran alkalmaznak: a vírusneutralizáció (VN) és a hemagglutináció-gátlás (HAG).

Vírusneutralizáció

A vírus elveszíti fertőzőképességét (semlegesítődik, neutralizálódik) akkor, ha a vírusokat olyan vérsavóval hozzuk össze, amelyben a sejthez kötődésért felelős felszíni antigéneket blokkoló ellenanyagok vannak (113. ábra). A reakció rendkívül specifikus, az egyes vírusok (szerotípusok) közötti különbségeket ugyanis éppen e fehérjék eltérései okozzák. A vírusok besorolásának, identifikálásának ezért fontos eszköze a VN próba. A vizsgálati mintában levő ellenanyagok mennyiségének (titerének) meghatározására a próbához ml-enként ismert számú fertőzőképes viriont tartalmazó (standardizált) vírusszuszpenziót használunk. A standardizálás első lépése a vírus infektív titerének meghatározása. Erre a célra a szövettenyészeten (tojásban) elszaporított vírusszuszpenzióból (általában tízes léptékű) hígítási sort készítünk, és annak minden fokozatával több (4–6 db) sejttenyészetet (tojást) oltunk. A megfelelő inkubációs idő elteltével a töményebb szuszpenzióval oltott tenyészetekben megjelenik a vírusra jellemző CPE, egy bizonyos hígítási fok felett pedig nem észlelhető vírushatás. Azt a legnagyobb hígítási fokot, amelynél a vírus hatása a tenyészetek 50%-ában jelentkezik, a vírus hígítási végpontjának nevezzük. Ez az a hígítási fok, melynek vírustartalma 1 TCID50 (tissue culture infective dose 50%). A továbbiakban, a vírusneutralizációs próbában felhasznált vírusszuszpenzió a nemzetközi standard szerint ennél 100-szor töményebb, vagyis koncentrációja 100 TCID50. A vírusszuszpenzió infektív titere plakkszámlálással még pontosabban megállapítható. Ilyenkor az egyes vírushígításokkal oltott sejtréteget a plakktisztításnál leírt módon fedjük, és megfelelő idő elteltével a kialakuló plakkokat megszámoljuk. Az ily módon titrált szuszpenzió víruskoncentrációját PFU-ban (plaque forming unit) adjuk meg (114. ábra).

113. ábra - Vírusneutralizáció hatásmechanizmusának sematikus képe (A: eredményes vírusfertőzés, B: neutralizáló ellenanyagok jelenlétében a vírus nem tud fogékony sejtreceptorához kapcsolódni)

kepek/113abra.png


114. ábra - Plakkszámlálással történő infektív titermeghatározás szövettenyészeten (Dr. Kükedi András anyagáról készült felvétel)

kepek/114abra.png


Magát a VN próbát a vizsgálandó savónak az immunológiai részben ismertetett kettes alapú logaritmus szerint történő hígításával (1:2, 1:4 stb.) kezdjük. Az egyes hígítási fokokhoz 100 TCID50 vagy 100 PFU koncentrációjú vírusszuszpenziót adunk, összekeverjük, és 37 °C-on egy órán át inkubáljuk. Ezután minden hígítási fokozattal sejttenyészeteket oltunk, és naponta vizsgáljuk, hogy melyekben mutatkozik vírushatás. Ahol nem tapasztalunk CPE-t, ott a savóban a neutralizációhoz elegendő mennyiségű ellenanyag volt. Ennek mennyisége azonban a hígulás mértékében csökken. A savónak az a legnagyobb hígítása, amely még tartalmaz vírussemlegesítő ellenanyagokat, megadja a savó neutralizációs titerét. Ez a titerérték, tehát az ún. konstans vírus, változó savóhígítás módszere szerint végzett VN próbával határozható meg.

Viszonylag ritkábban (főleg az ún. párhuzamos titrálásokban, az egymással keresztreagáló, szoros antigénrokonságban lévő vírusok azonosítására) alkalmazzák a konstans savó, változó vírushígítás módszerével végzett VN próbát, amikor a vírusból 10-es alapú logaritmus szerint több hígítási sorozatot készítenek. Ezek közül az egyik sorozat tagjaira mérik rá az egy adott (konstans) mértékben hígított vizsgálandó savók mintáit, egy másik sorozatra pedig biztosan ellenanyagmentes savót mérnek (kontroll), majd inkubációt követően a keverékekkel szövettenyészeteket oltanak. A savó ellenanyag-tartalmára abból következtetünk, hogy a kontrollhoz képest milyen mértékben csökkenti a vírus infektív titerét. A két érték hányadosa az ún. neutralizációs indexet adja; minél magasabb ez az érték, annál több ellenanyagot tartalmazott a vizsgált savó.

Matematikailag jobban értékelhető eredményt ad, ha a plakkredukció módszerét alkalmazzuk. Ilyenkor a neutralizáló ellenanyagok jelenlétére a plakkok számának a kontrollokhoz viszonyított csökkenéséből következtethetünk.

Hemagglutináció-gátlás (HAG)

A próba csak olyan vírusok esetében alkalmazható, melyek felületükön speciális fehérjéket (hemagglutinineket) hordoznak, és ezekkel meghatározott fajok vörösvérsejtjeinek specifikus receptormolekuláikhoz képesek kötődni. Mivel mind a vírus, mind a vörösvérsejt több ilyen kötőfehérjével rendelkezik, összekeveredésük esetén, többszörös kapcsolódás révén, vírusokból és erythrocytákból álló aggregátumok jönnek létre. Ezek a szuszpenzióból kicsapódnak, és a reakciócső alján zegzugos szélű, szétterült üledéket alkotnak. Amennyiben a hemagglutináló vírusszuszpenziót specifikus ellenanyagokat tartalmazó savóval hozzuk össze, akkor a hemagglutinin-fehérjékhez kapcsolódó ellenanyagok meggátolják a vírus-erythrocyta kapcsolat kialakulását, és a vörösvérsejtek szabályos korong formában ülepednek le (115. és 116. ábra).

115. ábra - Hemagglutináció-gátlás sematikus képe

kepek/115abra.png


116. ábra - Hemagglutináció-gátlás

kepek/116abra.png


A vizsgálatot ebben az esetben is a vírusoldat standardizálásával kezdjük. Ezúttal azonban a vírus hemagglutinációs titerének meghatározása a cél. A vírusszuszpenzió kettes léptékű hígítási sort készítünk, melynek minden egyes tagjához hozzáadjuk a megfelelő állatfajból származó, mosott (0,5–1%-os) vörösvérsejt-szuszpenziót. A keveréket ezután a reakció számára optimális (vírusonként eltérő) hőmérsékleten és ideig inkubáljuk (pl. a juh-adenovirusokat patkány-vörösvérsejtekkel 4°C-on, 12 óráig, a parainfluenza-vírusokat tengerimalac-vörösvérsejtekkel 37°C-on, 2–12 óráig stb.). Az a legnagyobb hígítási érték, amelyben még létrejön az agglutináció, a vírusszuszpenzió hemagglutinációs titerét adja meg. Ennek koncentrációja 1 HA-egység. A HAG próbában ennél 4–8-szor töményebb vírusoldatot használunk.

A HAG próbát úgy hajtjuk végre, hogy a vizsgálandó vérsavót kettes léptékben hígítjuk, a hígítási sor minden tagjára azonos mennyiségben 4–8 HA-egység koncentrációjú vírusoldatot mérünk, és a keveréket (1 óráig 37°C-on) inkubáljuk. Ezt követően a csövekbe mosott vörösvérsejtek 0,5–1%-os szuszpenzióját mérjük. Megfelelő ideig tartó és megfelelő hőmérsékleten történő inkubálás után az ellenanyagot nem tartalmazó csövekben kialakul az agglutináció. A savónak azt a hígítási fokát, amelyben még gátolni képes az agglutináció kialakulását, a savó HAG-titerének nevezzük.

A HA és HAG vizsgálatok során anyag- és munkaerő-megtakarítást jelent, ha a próbákat csövek helyett műanyag lemezek vájulataiban végezzük, a hígításhoz pedig ún. Takátsy-féle hígítókacsot (újabban inkább többcsatornás mikropipettákat) használunk.

Védekezés a vírusfertőzések ellen

A direkt és indirekt diagnosztikai módszerekkel a fertőzött egyedekben vagy állományokban kimutatott pathogen vírusok ellen értelemszerűen védekezni kell. A védekezés során részben állat-egészségügyi igazgatási és állathigiéniai intézkedésekkel védekezünk: karanténozással, az állatforgalom ellenőrzésével, megfelelő tartási és takarmányozási körülmények biztosításával stb. Emellett a fertőzött vagy fertőzésveszélynek kitett állatok védelmére a vírusellenes szereket és a vakcinákat, a környezetben a kiürülő, fertőzőképes virionok ellen pedig a különböző fertőtlenítőszereket vesszük igénybe. Ez utóbbiak megfelelő alkalmazásához mindenekelőtt a vírusok ellenálló képességét kell ismernünk.

A vírusok ellenálló képessége

A környezet hőmérséklete alapvetően befolyásolja a vírusok élettartamát. A bakteriológiából ismert sterilizálási eljárásokkal (autoklávozással, hőlég-sterilizálással) minden vírus inaktiválható, sőt a struktúrproteinek denaturációja miatt a vírusok többsége (elsősorban az érzékenyebb burkos vírusok) már 1–2 óráig tartó, 56 °C-os inkubálás alatt is elveszti fertőzőképességét.

A beszáradás iránt szintén elsősorban a burkos vírusok érzékenyek, ezek a különböző testváladékokkal a környezetbe jutva csak rövid ideig maradnak életben. Más vírusok (pl. a parvo-, pox- és picornavirusok) több hétig, sőt több hónapig is túlélnek beszáradt állapotban.

A különböző sugárhatások közül a látható fény, különösen a napfény közvetlen hatására a legtöbb vírus elpusztul. Ez a folyamat tiszta ultraibolya fény hatására még gyorsabban végbemegy. Az ionizáló sugárzás (gamma-sugárzás) töréseket okoz a nukleinsavszálon, és ezért szintén inaktiválja a vírusokat.

Ha a környezet kémhatása az intracellulárisan jellemző értékektől nagymértékben eltér, akkor a vírusfehérjék denaturálódnak, a vírus elveszti fertőzőképességét. A vírusok ugyanis fiziológiás pH-értékek között (pH 6,5–7,5) a legstabilabbak, noha sok vírus hosszabb ideig képes elviselni a pH 3-as közeget is (pl. az enterovirusok, adenovirusok, coronavirusok stb.).

Fertőtlenítő- és inaktiválószerek

A vírusok különböző alkotóelemeivel reagáló vegyületek közül kerülnek ki a leggyakrabban alkalmazott fertőtlenítőszerek és a vakcinakészítéskor használt inaktiválószerek egyaránt. Mind fertőtlenítésnél, mind inaktiválásnál az alapvető cél a vírus infektivitásának megszüntetése, de inaktiváláskor fontos szempont az is, hogy az antigenitásért felelős (glüko)proteinkomponensek minél kevésbé módosuljanak a beavatkozás következtében. Ezért az inaktiváláskor használt szerek hatásmechanizmusa eltér a fertőtlenítőszerekétől (pl. a fehérjékkel nem reagálnak), vagy koncentrációjuk töredéke a fertőtlenítéskor alkalmazott koncentrációnak.

Fertőtlenítőszerként használhatók pl. a pH-viszonyokat szélsőségesen megváltoztató erős savak és lúgok (pl. a 2–3%-os nátronlúg vagy a 0,1–0,2%-os kénsav).

A különböző oxidálószerek, szervetlen és szerves halogénszármazékok (klórlúg, klórmész, jódtinktúra, jodofórok stb.) a szulfidcsoportok oxidációja révén inaktiválják a vírusokat. Hatásukat a fehérjetartalmú szennyeződések (vér, bélsár, nyálka stb.) erősen csökkenthetik. Találunk köztük a vírusszennyezésnek kitett („ragályfogó“) tárgyak és a fertőzött testfelületek fertőtlenítésére alkalmas vegyületeket egyaránt (előbbi célra pl. a klórlúg és klórmész, utóbbira a Neomagnol-oldat vagy a jodoforok használhatók).

A fehérjedenaturáló vegyületek (alkoholok, fenol stb.) általában csak kisebb kézi műszerek, üvegtárgyak „gyors fertőtlenítésére” alkalmasak, de tudnunk kell, hogy e szerek nem inaktiválják a vírusok nukleinsavát, csak a fehérjekomponenseket precipitálják vagy oldják. Ezért használható mindkét vegyület pl. nukleinsav-tisztításra az analitikai vizsgálatok előtt.

A zsíroldó szereket és a detergenseket általában nem fertőtlenítőszerként, hanem tisztítószerként használják. E vegyületek közül némelyik csak a burkos vírusokat inaktiválja a lipoprotein-komponensek oldása révén. Ezek az anyagok vírusinaktiválásra csak bizonyos célból (pl. vírusazonosításkor) alkalmazhatók.

Az alkilálószerek közül a formalin 3%-os oldatát tárgyak, berendezések lemosására, gőzét légterek fertőtlenítésére használják.

A formalint a vakcinakészítés során inaktiválószerként is általánosan használják. A vírusfolyadékhoz kis koncentrációban (0,001%) hozzámért formalin ugyanis a vírusnukleinsav aminocsoportjait is alkilálja és ezáltal inaktiválja, de az antigénszerkezetet nem változtatja meg jelentősen, mert a polipeptidmolekulákon keresztkötéseket hoz létre, stabilizálva az eredeti antigénszerkezetet. (Nagyobb koncentrációban a fehérjéket is erőteljesen denaturálja és azok antigenitását is megváltoztatja.)

Az inaktiválásra újabban egyre inkább terjed a nukleinsav-denaturáló szerek (pl. béta-propiolakton, etil-etilénimin) használata, melyek a vírus antigenitásért felelős fehérjekomponenseit érintetlenül hagyják, ugyanakkor keresztkötéseket létesítenek a nukleinsavon, ezért inaktiválószerként sokkal biztonságosabban alkalmazhatók vakcinakészítéskor.

Vírusellenes kemoterápia

A vírusellenes szerek részletes ismertetésével (kémiai szerkezet, alkalmazás módja stb.) a gyógyszertan foglalkozik, az alábbiakban csak az antivirális kemoterápia néhány alapelvét ismertetjük, példaként említve néhány vegyületet (117. ábra). Ezek elsősorban a orvosi terápiában használatos gyógyszerek, állatorvosi területen alkalmazásuk legfeljebb a kisállatgyógyászatban elképzelhető. Gazdasági haszonállatok gyógyítására vagy netán tömegkezelésekre alkalmas vírusellenes szerek még nem állnak rendelkezésre, mert az antibakteriális terápiában bevált antibiotikumokhoz hasonló, általánosan hatékony vagy legalábbis széles terápiás skálájú antivirális szerek egyelőre nem ismeretesek. Ennek fő oka az, hogy a vírusok nagyon szorosan kapcsolódnak a sejtben zajló metabolikus folyamatokhoz, ezért a legtöbb vírusellenes szer a sejtre is toxikus. Legismertebbek a különböző nukleozidanalógok (pl. iodoxuridin, trifluortimidin adenin arabinozid), melyek beépülnek a nukleinsavláncba, de a polimeráz enzim számára nem értelmezhetők, ezért gátolják a nukleinsavreplikációt. Ezek a hagyományos nukleozidanalógok a sejtek kromoszomális DNS-ének replikációjakor is beépülnek a DNS másolatba, vagyis többé-kevésbé citotoxikus hatásúak, ezért általában csak külsőleges kezelésre alkalmazhatók (pl. herpeszellenes kenőcsökben).

117. ábra - Egyes vírusellenes szerek szerkezeti képlete

kepek/117abra.png


A vírusszaporodás biokémiai folyamatainak alaposabb megismerése után úgy tűnik, hogy a vírus multiplikációs ciklusának több olyan szakasza is van, amely alkalmas lehet a szelektív beavatkozásra. Az újabb vírusellenes gyógyszereket már ennek ismeretében tervezték és szintetizálták.

A logikai megközelítés alapján bármely olyan folyamat, amelyben vírusspecifikus enzimek szerepelnek, potenciális célpont lehet olyan szer előállítására, amely iránt a kérdéses enzim affinitása fokozott. Az ilyen molekulákat és annak analógjait szintetizálják, hatástani és ártalmatlansági vizsgálatokat végeznek, végül kiválasztják a gyógyszernek legalkalmasabb változatot. Mivel vírusspecifikus enzimek csak a fertőzött sejtekben vannak, az intakt sejtek működését ezek a szerek nem befolyásolják.

Ilyen előre megtervezett, szelektív gyógyszerek az ún. második generációs nukleozidanalógok, pl. az acikloguanozin (acyclovir) és valin-észtere a vacyclovir, valamint származékai (famciclovir, penciclovir, gaciclovir). Az acyclovirt és rokonvegyületeit elsősorban a herpeszfertőzések (herpes simplex és cytomegalovirus fertőzés ) terápiájában alkalmazzák. Az acyclovir egy herpesvirus-specifikus enzim (dezoxitimidin-dezoxicitidin kináz) segítségével alakul át acikloguanozin-trifoszfáttá, amely a szintén vírusspecifikus DNS-polimeráz enzim működését gátolja. A folyamatban tehát két helyen is szerepelnek csak a vírussal fertőzött sejtekben jelen lévő enzimek; a szelektív hatás így biztosított.

A didezoxinukleotidokban pl. didezoxicitidin (ddC), didezoxinadenozin (ddA) a DNS-t alkotó dezoxinukleotidhoz képest az a különbség, hogy a nukleotidok egymáshoz kapcsolódásához szükséges 3’ hidroxilcsoport hiányzik, így az ilyen didezoxinukleotid beépülésekor a DNS lánc polimerizációja megszakad. E szereket a human immunodeficiency virus (HIV) szaporodásának csökkenésére alkalmazzák, általában kombinációban. Az ilyen kombinációk általában valamilyen proteáz inhibitort is tartalmaznak (pl. indinavir, saquinavir, ritonavir), mivel a HIV egyik prekurzor fehérjéjét vírusspecifikus enzim vágja végleges méretűre – a proteáz inhibítorok ezt az enzimet blokkolják. 

Az AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) kezelésére fejlesztették ki az azidotimidint (AZT), amelyet a vírusspecifikus reverz transzkriptáz enzim timidinmolekula helyett beépít a vírus RNS-genomjáról másolt DNS-láncba. Mivel az AZT-ról hiányzik a 3’-hidroxilcsoport, a következő nukleotidnak nincs hová kötődnie, a DNS-lánc növekedése megáll, egy inkomplett és ezért inaktív provírus jön létre. A szert legtöbbször egyéb, a HIV vírus szaporodását más pontokon gátló komponensekkel kombinálva alkalmazzák, ezzel a módszerrel a fertőzöttek kezelésében ígéretes eredményeket értek el.

A ribavirin a guanozin analógja, és így elvileg hasonló módon fejtené ki hatását. A molekula azonban intracellulárisan átalakul (trifoszfát formájában fordul elő), és ez a származék a mRNS-molekulák felépítésében szerepet játszó guaniltranszferáz enzimet gátolja. Arenavirus fertőzések leküzdésére alkalmazzák.

A nem nukleozidanalóg kemoterápiás szerek közül a methisazont a emberi himlőmegbetegedések megelőzésére használták. Ez a szer elsősorban a késői transzlációt gátolja, így a struktúrproteinek felépülését akadályozza. Az amantadin és származéka, a rimantadin, az influenzavirusok külső burkának és a sejtmembránnak az összeolvadását gátolja. Szűk spektrumú gyógyszer, csak az influenzás tünetek enyhítésére használható, noha in vitro szövettenyészeteken néhány paramyxovirus szaporodását is gátolta. A Zanamivir és a GS4104 nevű vegyület neraminidáz gátló és így az influenzavirus szaporodását csökkenti. A Foscarnet (foszfonoformolsav trinátrium sója) egyrészt a reverz transzkriptáz működését gátolja, másrészt a herpesvirus-specifikus polimerázt is, igy HIV, cytomegalovirus és herpes simplex fertőzések esetén alkalmazható.

A fenti szerek egy része a sejtek működését is befolyásolja (többé-kevésbé cytotoxikusak), néha az in vitro tapasztalt antivirális hatásnál az in vivo kísérletekben észlelt eredmények kevésbé megfelelőek, és rezisztens vírustörzsek megjelenését is leírták.

Interferonok és interferoninducerek

Elméletileg az interferonok ideális vírusellenes szerek. Nem szintetikus termékek, hanem a szervezetben képződnek, nem toxikusak, és a vírusok széles skálája ellen hatásosak. Ennek ellenére az interferonokat terápiás vagy preventív célból a vírusos megbetegedések kezelésére a korábban leírt gyakorlati nehézségek miatt még a humán gyógyászatban is csak bizonyos esetekben (vírusos hepatitis, influenza, rhinovirusos nátha) alkalmazzák. Az állatorvosi praxisban a közeljövőben nem várható széles körben felhasználható, gazdaságos és hatékony készítmények forgalomba hozatala. Az interferon inducerek általában toxikusak és hatásuk in vitro jóval erősebb, mint in vivo. Ezért ilyen szerek nincsenek forgalomban.

Szérumok

A vírusfertőzések ellen a szervezetbe bevitt kész ellenanyagok segítségével a betegség klinikai tünetei enyhíthetők, a gyógyulás gyorsítható, a vírusürítés csökkenthető. Számtalan készítmény van forgalomban a kisállatok vírusfertőzéseinek kezelésére. A szérumterápia (passzív immunizálás) lehetőségeivel és kockázataival az Immunológia fejezet foglalkozik.