Ugrás a tartalomhoz

Fehérjebiotechnológia

Dr. Tőzsér József, Dr. Emri Tamás, Dr. Csősz Éva, Dr. Tőzsér József (2011)

Debreceni Egyetem

6. fejezet - 6. A fehérjék poszt-transzlációs módosítása és a módosítások kimutatása proteomikai módszerekkel

6. fejezet - 6. A fehérjék poszt-transzlációs módosítása és a módosítások kimutatása proteomikai módszerekkel

Tartalom

A transzláció után a fehérjék bizonyos módosításokon eshetnek át, amely megváltoztatja működésüket, lokalizációjukat vagy más molekulákkal kialakított kapcsolatukat. A poszt-transzlációs módosítások (PTM) lehetnek reverzibilisek (cukormódosítások, palmitoiláció, poli-ADP riboziláció, foszforiláció, acetiláció, ubikvitinálás, karboxilálás, nitrozilálás, hidroxiláció)

vagy irreverzibilisek (preniláció, mirisztoiláció, proteolízis, izopeptidkötések kialakítása). A módosítások történhetnek kotranszlációsan (pl. mirisztoiláció, N-glikoziláció, hidroxiláció) vagy poszt-transzlációsan (pl. palmitoiláció, preniláció, foszforiláció, defoszforiláció, proteolízis, ADP-riboziláció, karboxilálás, ubikvitinálás, acetiláció, metiláció, hidroxiláció).

A fehérjék glikozilációja

A fehérjék cukor módosítása történhet O- vagy N- glikoziláció révén. Az O glikoziláció során a fehérjék Ser, Thr, hidroxiprolin és hidroxilizin oldalláncainak hidroxil csoportjához 1-3 cukor egység kapcsolódik. A módosítás főként a Golgi készülékben történő poszt-transzlációs módosítás.

Az N glikoziláció során az ER lumenében Asn vagy Arg oldalláncok nitrogénjéhez 14 egységből álló oligoszacharid kapcsolódik, amely az ER lumenben és a Golgi apparátusban tovább módosul. Célszekvencia: AsnXaaSer/Thr, Xaa bármilyen aminosav lehet, prolin kivételével. Kotranszlációs módosítás.

Az enzimatikusan katalizált glikolizációval szemben a glikálás során a cukrok enzimektől függetlenül kapcsolódnak hozzá a fehérjékhez (6.1. ábra). A glikált fehérjék nem tudják megfelelően ellátni feladatukat – nem kontrollált diabéteszben nagy jelentőségük van. Egyes elméletek szerint az öregedésért is a glikálás során keletkező fehérje-funkcióvesztés felelős.

6.1. ábra - 6.1. ábra. A glikálás.

6.1. ábra. A glikálás.

A fehérjék foszforilációja/defoszforilációja

A folyamat során a kinázok foszfát csoportot helyeznek a fehérjék bizonyos (főként rendezetlen régióiban lévő) Ser, Thr és Tyr aminosav részeire. A foszfatázok pedig eltávolítják a foszfát csoportot. A foszforiláció egy reverzibilis PTM, amelynek segítségével lehetővé válik a fehérjék aktivitásának ellenőrzése, gyors ki-és bekapcsolása (6.2. ábra).

6.2. ábra - 6.2. ábra. A fehérjék módosítása foszforiláció és defoszforiláció révén.

6.2. ábra. A fehérjék módosítása foszforiláció és defoszforiláció révén.

A fehérjék módosítása lipidek segítségével

A lipid módosítások történhetnek preniláció vagy zsírsav módosítás révén. A preniláció során C15 (farneziláció) vagy C20-as (geraniláció) egységek kerülnek a fehérjék C termimálisán levő meghatározott cisztein oldalláncok -SH csoportjaira (6.3. ábra).

6.3. ábra - 6.3. ábra. A fehérjék módosítása preniláció révén.

6.3. ábra. A fehérjék módosítása preniláció révén.

A folyamatot a farnezil transzferáz illetve a geranil-geranil transzferáz enzimek katalizálják. Ezen irreverzibilis módosítások célja a fehérjék membránhoz rögzítése. A zsírsav módosítások során zsírsavak kerülnek a fehérjék bizonyos aminosavaira enzimek által katalizált folyamat révén (6.4. ábra). A palmitoiláció reverzibilis poszt-transzlációs módosítás melynek során a cisztein SH csoportjához palmitinsav kapcsolódik. A mirisztoiláció irreverzibilis kotranszlációs módosítás, melynek pedig mirisztinsav kapcsolódik az N-terminuson lévő, főként glicin aminosavrészhez.

6.4. ábra - 6.4. ábra. A fehérjék módosítása zsírsav módosítások révén.

6.4. ábra. A fehérjék módosítása zsírsav módosítások révén.

A fehérjék proteolízise

A proteolízis egy irreverzibilis poszt-transzlációs módosítás, melynek során a proteáz enzimek a fehérjék meghatározott helyein a peptidkötést elhasítják. A proteolízis során megtörténhet a teljes fehérje feldarabolása, degradációja, míg az úgynevezett limitált proteolízis során csak meghatározott peptidkötések hasadnak el (6.5. ábra).

6.5. ábra - 6.5. ábra. A fehérjék módosítása proteolízis révén.

6.5. ábra. A fehérjék módosítása proteolízis révén.

A proteolitikus hasítás fontos szerepet játszik a fehérjék aktivitásának, szerkezetének és lokalizációjának módosításában, jelentős szereppel rendelkezik számos biológiai folyamatban, mint a fehérjék lebontása, emésztő enzimek aktiválása, véralvadás, szignál transzdukció, extracelluláris mátrix átrendeződése, polipeptid hormonok kialakulása, sejtinvázió, metasztázis, vírusfehérjék processzálása stb. A proteolitikus hasítás a sejten belül és a sejten kívül egyaránt megtörténhet (6.6. ábra).

6.6. ábra - 6.6. ábra. A proteolitikus hasítás helye.

6.6. ábra. A proteolitikus hasítás helye.

A fehérjék karboxilálása

A karboxilálás egy irreverzibilis poszt-transzlációs módosítás. A gamma karboxilálás során karboxil csoport kerül a fehérjék egyes glutamát oldalláncaira. Szerepe van a véralvadási faktorok hatékony működésében.

A fehérjék acetilálása

Az acetiláció egy reverzibilis poszt-transzlációs módosítás, melynek során a fehérjék lizin oldalláncához acetil csoport kapcsolódik. A génexpresszió szabályozásában fontos szereppel bír a hiszton fehérjék célzott acetilációja/deacetilációja. A hiszton acetil transzferáz acetilálja a hisztont elősegítve a transzkripciót, míg a hiszton deacetiláz eltávolítja az acetil csoportot gátolva a transzkripciót.

A fehérjék metilálása

A metiláció egy reverzibilis poszt-transzlációs módosítás, amelynek fontos szerepe van a génexpresszió szabályozásában. A metil-transzferázok metil csoportot helyeznek a fehérjék bizonyos lizin vagy arginin oldalláncaira.

Számos esetben nem a poszt-transzlációs módosítás maga, hanem a poszt-transzlációs módosítások összessége határozza meg az illető fehérje funkcióját. Ilyen például a hiszton esete, ahol a poszt-transzlációs módosításoknak géntranszkripciót befolyásoló szerepe van; a fehérjék változatos poszt-transzlációs módosításainak összessége határozza meg az adott gén átíródását (6.7. ábra).

6.7. ábra - 6.7. ábra. A poszt-transzlációs módosítások géntranszkripciót befolyásoló szerepe.

6.7. ábra. A poszt-transzlációs módosítások géntranszkripciót befolyásoló szerepe.

A fehérjék módosítása izopeptid kötések létrehozásával

A folyamatot a transzglutaminázok katalizálják, amelyek a fehérjék glutamin és lizin oldalláncai között alakítanak ki izopeptid íkötéseket (6.8. ábra). Irreverzibilis poszt-transzlációs módosítás, amelynek szerepe van a véralvadásban és a programozott sejtelhalásban.

6.8. ábra - 6.8. ábra. Izopeptid kötés létrehozása a transzglutaminázok által katalizált reakcióban.

6.8. ábra. Izopeptid kötés létrehozása a transzglutaminázok által katalizált reakcióban.

Poszt-transzlációs módosítások kimutatása

A poszt-transzlációs módosítások detektálására használható egyik módszer a kétdimenziós gélek speciális fluoreszcens festékkel történő festése (6.9. ábra).

6.9. ábra - 6.9. ábra. Poszt-transzlációs módosítások kimutatására szolgáló specifikus festési eljárások.

6.9. ábra. Poszt-transzlációs módosítások kimutatására szolgáló specifikus festési eljárások.

A ProQ Diamond a foszfoproteineket, a ProQ Emerald pedig a glikoproteineket festi meg. A festett foltok kivágása és tömegspektrometriás analízise lehetővé teszi a módosított fehérjék azonosítását. A módszer hátránya, hogy nem ad információt a módosítás helyére vonatkozóan. A PTM helyét tömegspektrometriás módszerek alkalmazásával lehet megadni. A PTM tömegspektrometriás detektálása a triptikus fragmens tömegspektrométerben mérhető tömegváltozása alapján történik. A PTM egy része az analízis során a peptiden marad, tömegspektrométerben megfigyelhető, ez az ún. stabil PTM. Ezzel szemben, az instabil PTM az analízis során elbomlik, nem marad a peptiden, tömegspektrométerben csak közvetve megfigyelhető.

A foszfopeptidek például, negatív töltésű foszfát csoportot (-79 Da) vagy semleges töltésű foszforsavat (98 Da) veszíthetnek a tömegspektrométerben az ütközés során (6.10. ábra).

6.10. ábra - 6.10. ábra. A fehérjék oldalláncán levő foszfát csoport sorsa a tömegspektrometriás analízis során.

6.10. ábra. A fehérjék oldalláncán levő foszfát csoport sorsa a tömegspektrometriás analízis során.

A prekurzor ion keresés – precursor ion scan során tulajdonképpen a foszfopeptidek prekurzor ionjának rekonstrukciója történik (6.11. ábra); olyan anyaion/prekurzor ionok keresésére állítjuk be a tömegspektrométert, amelyek negatív módban 79-es fragmens iont produkálnak a harmadik kvadrupólban.

6.11. ábra - 6.11. ábra. Poszt-transzlációs módosítások kimutatása prekurzor ion kereséssel.

6.11. ábra. Poszt-transzlációs módosítások kimutatása prekurzor ion kereséssel.

A semleges vesztés vizsgálata – neutral loss scan során pedig olyan anyaion.prekurzor ionok keresése történik, amelyek 98 daltonnal kisebbek a harmadik kvadrupólban (6.12. ábra).

6.12. ábra - 6.12. ábra. Poszt-transzlációs módosítások kimutatása semleges vesztés vizsgálatával.

6.12. ábra. Poszt-transzlációs módosítások kimutatása semleges vesztés vizsgálatával.

A prekurzor ion keresés vagy semleges vesztés és a szekvenálás együttes alkalmazása lehetővé teszi a foszforilált peptidek hatékony azonosítását. A PTM detektálásának másik hatékony módja az MRM módszer alkalmazása (6.13. ábra).

6.13. ábra - 6.13. ábra. Poszt-transzlációs módosítások kimutatása MRM segítségével.

6.13. ábra. Poszt-transzlációs módosítások kimutatása MRM segítségével.