Ugrás a tartalomhoz

Molekuláris diagnosztika

Dr. Balogh István, Dr. Kappelmayer János, Dr. Tőzsér József (2011)

Debreceni Egyetem

15. fejezet - 15. A molekuláris diagnosztika metodológiája

15. fejezet - 15. A molekuláris diagnosztika metodológiája

Tartalom

Szintén kereskedelmi forgalomban hozzáférhető bizonyos mutáció analízisre az oligonukleotid ligációs teszt (OLA, oligonucleotide ligation assay). Ennek felhasználási elvét mutatja CFTR mutációk vizsgálata esetén a 15.1. ábra. A teszt ismert mutációk kimutatását teszi lehetővé. Egy mutációs helyet két oligonukleotid próba definiál. Addig, amíg a fluoreszcens festékkel jelölt közös próba mindenképp behibridizál a templát DNS-hez (ez minden esetben korábban felamplifikált PCR termék) az allél specifikus próba kizárólag az adott allélre képes hibridizálni, azaz a normál próba a vad típusú, míg a mutáns próba a mutációt hordozó allélre. A hibridizált oligonukleotidok kovalens összekötését hőstabil ligáz enzim valósítja meg és a keletkezett termékek elektroforetikusan kerülnek elválasztásra. A módszer festékek és próbahosszok változtatásával erősen multiplexálható, lehetővé téve egyidejűleg akár 20-30 különböző mutáció bármely genotípus szerinti elkülönítését és analízisét.

15.1. ábra - 15.1. ábra. Mutáció kimutatás oligonukleotid ligációs teszttel

15.1. ábra. Mutáció kimutatás oligonukleotid ligációs teszttel

A fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) elvén alapuló valós idejű PCR reakciót mutatja a 15.2. ábra. A felső részen a két, donor illetve akceptor festékkel jelölt egyszálú oligonukleotid próba látható együtt a vizsgálni kívánt DNS templáttal. Amennyiben a donor festék gerjesztési hullámhosszának megfelelő fénnyel világítjuk meg a rendszert, és a donor festék nem kerül közel az akceptor festékhez (azaz a próbák nincsenek a templáthoz hibridizált állapotban), a donor festék a saját emissziós hullámhosszán emittálva tér vissza alapállapotba (középső ábra rész). Amennyiben a két próba behibridizál a templát DNS-hez, a donor festék nem emisszióval, hanem energiatranszferrel tér vissza alapállapotba, egyidejűleg gerjeszti az akceptor festéket. Azaz, a donor festék gerjesztésével az akceptor festékre jellemző emissziós hullámhosszon detektálhatunk fluoreszcens jelet. A módszer alkalmas arra, hogy a PCR reakciót valós időben kövessük. Ha az egyik próba mutációs hely fölé van tervezve, akkor a rendszerrel pontmutációkat vagy egyéb kis skálájú mutációkat tudunk kimutatni. Ekkor a PCR reakció kivitelezése után lassú hevítéssel és a fluoreszcens jel folyamatos követésével a tökéletes komplementaritást mutató próba vad típusú templát hibrid, illetve a nem tökéletes komplementaritást mutató próba mutáns templát hibrid közti olvadáspont különbséget a fluoreszcencia jel különböző hőmérsékleteken bekövetkező csökkenése mutatja meg.

15.2. ábra - 15.2. ábra. Mutáció kimutatás hibridizációs próbákkal - fluoreszcencia rezonancia energia transzfer

15.2. ábra. Mutáció kimutatás hibridizációs próbákkal - fluoreszcencia rezonancia energia transzfer

A 15.3. és 15.4. ábrán a mutációs hely fölé tervezett detektáló, vagy szenzor próba és a közvetlenül e próba mellé tervezett horgonyzó (anchor) próba helyzete látható a DNS templáton.

15.3. ábra - 15.3. ábra. Mutáció kimutatás fluoreszcensen jelölt hibridizációs próbákkal

15.3. ábra. Mutáció kimutatás fluoreszcensen jelölt hibridizációs próbákkal

A 15.3. ábra azt az esetet mutatja, amikor a vad típusra tervezett detektáló próba mutáció fölött foglal helyet, így a komplementaritás nem tökéletes (jobbról a negyedik nukleotid pozíció). Az ábrán a horganyzó próba 3’ végén látható piros jelzés az egyik, míg a detektáló próba 5’ végén látható sárga jelzés a másik festéket jelöli. A festékek egyike donor, míg a másik akceptor szerepet tölt be. A detektálás alapja a fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET). Az ábra ellenpárja a 15.4. ábrán látható, ahol a vad típusra tervezett detektáló próba vad típusú genomiális DNS-hez hibridizál, így tökéletesen komplementer vele.

15.4. ábra - 15.4. ábra. Mutáció kimutatás fluoreszcensen jelölt hibridizációs próbákkal

15.4. ábra. Mutáció kimutatás fluoreszcensen jelölt hibridizációs próbákkal

A multiplex ligáció függő próba amplifikáció (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) olyan molekuláris genetikai diagnosztikai módszer, mely alkalmas génszakasz duplikációk és deléciók detektálására, akár heterozigóta formában is. Ezáltal lehetőség van például hordozók kimutatására olyan betegségek esetében, ahol a kóroki tényezők a fentiek (Duchenne/Becker izomsorvadás). A módszer igen kis kópia számbeli különbségeket képes kimutatni, kis szakaszok (pl. exonok) esetén. Elve szerint olyan oligonukleotidokat amplifikálunk, melyek a genomiális DNS templátra hibridizálva előzőleg összeligálódtak. Minden MLPA próba szett két specifikus oligonukleotidot, egy rövid szintetikus és egy hosszabb próbát tartalmaz exononként (a rendszer multiplexálható). A rövid szintetikus oligonukleotid próba tartalmaz target specifikus szekvenciát (21-30 bázis) a 3’ végen, és egy 19 bázisból álló szekvenciát az 5’ végen, ami azonos a jelzett PCR primerrel, míg a hosszú próba a génspecifikus szekvencián túl ún. töltelékszekvenciát és a másik PCR primernek megfelelő szekvenciát tartalmazza. A módszer alkalmazásakor a próba mixet a genomiális DNS-hez hibridizáltatjuk. Ezt követi a ligáz enzim hozzáadása, ami a hibridizált (ezáltal egymás közvetlen közelében levő, a templáton immobilizált) próbákat ligálja, így a ligált termékek száma arányos a reakcióban levő megfelelő kiindulási DNS szakaszok mennyiségével. Ezt követően PCR primerekkel és a PCR egyéb szükséges komponenseivel PCR reakciót indítunk. A hosszú próbákat úgy tervezték, hogy a PCR termékek egymástól néhány nukleotid hosszúságban különbözzenek (ezt definiálja a töltelék szekvencia), így azok nagy felbontású kapilláris elektroforézissel elválaszthatók. A kapilláris elektroforézis során a műszer elektroferogrammot készít, melynek X-tengelyén a mintából származó PCR termékek belső molekulasúly standardhoz viszonyított nagysága, míg az Y-tengelyen a fluoreszcencia intenzitás látható. Mivel a fluoreszcencia intenzitás a kezdeti kópia szám függvénye, az értékelés alapja a csúcs intenzitások összehasonlítása.

15.5. ábra - 15.5. ábra. Multiplex ligáció függő próba amplifikáció (MLPA, multiplex ligation dependent probe amplification)

15.5. ábra. Multiplex ligáció függő próba amplifikáció (MLPA, multiplex ligation dependent probe amplification)

A kis skálájú mutációk kimutatásának referencia módszere a DNS szekvenálás, azaz a DNS nukleotid sorrendjének a megállapítása. A módszer kifejlesztése Sanger nevéhez fűződik (Nobel-díj). A DNS szekvenálás tett lehetővé a Humán Genom Projekt megvalósítását. Az eredetileg nehézkes, bakteriális klónozást (15.6(50). ábra) és nagyméretű, kézzel öntött akrilamid gél elektroforézis lépéseket is magában foglaló módszer a későbbiekben lényegesen egyszerűsödött és automatizálódott, de mindvégig megtartotta az elektroforetikus elválasztás szükségességét A ábra bal oldalán a hagyományos, Sanger DNS szekvenálás látható, míg a jobb oldalon az egyre nagyobb teret nyerő új generációs DNS szekvenálások. Elektroforetikus lépés az új generációs technikákban nem szerepel, ez esetben az áteresztőképesség igen nagy, az ennek megfelelő bioinformatikai igénnyel. Az új generációs DNS szekvenálások jelentik a genetikai forradalom új állomását, és előrelátható a molekuláris diagnosztikára gyakorolt alapvető hatásuk is, a genomikai szemlélet egyre hangsúlyosabb megjelenése formájában.

15.6. ábra - 15.6. ábra. A DNS szekvenálás különböző formái.

15.6. ábra. A DNS szekvenálás különböző formái.