Ugrás a tartalomhoz

Molekuláris diagnosztika

Dr. Balogh István, Dr. Kappelmayer János, Dr. Tőzsér József (2011)

Debreceni Egyetem

14. fejezet - 14. A molekuláris diagnosztika metodológiája

14. fejezet - 14. A molekuláris diagnosztika metodológiája

Tartalom

A rutin molekuláris genetikai diagnosztika leggyakrabban használt módszerei az ismert eltérések kimutatását célozzák. Ilyenek a mutációs forró pontok, az alapító hatású mutációk, illetve a kockázati tényezők vagy a farmakogenetikai célpontok. Tradicionálisan a leggyakrabban használt mutáció kimutatási módszer a PCR-t követő restrikciós emésztés (PCR-RFLP). Mivel a bakteriális restrikciós endonukleázok igen specifikus szekvencia motívumot ismernek fel, jól használhatók az olyan mutációk jelenlétének vagy hiányának detektálására, amely eltérések ilyen restrikciós felismerő szekvencia motívumban vannak. Az ismert néhány száz restrikciós endonukleáz számos esetben segít a pontmutációk kimutatásánál. Ebben az esetben a PCR-t követő restrikciós emésztés után egy agaróz vagy akrilamid gélelektroforézissel választják el a restrikciós fragmenteket. A fragmentek számából és hosszából lehet következtetni a genotípusra.

Az allélspecifikus PCR olyan mutációk kimutatására alkalmas, melyek pozícióját és a lehetséges nukleotidokat ismerjük (ismert mutációk detektáló módszere). A módszer alapelve az, hogy a Taq polimeráz enzim működéséhez igényli az adott primer tökéletes hibridizációját, azaz a 3’ inkomplementaritást nem képes tolerálni, az így hibridizált oligonukleotidot primerként nem tudja használni (14.1. ábra). A rendszer tartalmaz egy közös oligonukleotid primert (az ábra jobb oldalán látható) és tartalmaz a lehetséges allélekre specifikus oligonukleotid primereket (az egyik allélre specifikus látható az ábra bal oldalán). A PCR reakció két, egymástól elkülönített reakciótérben zajlik. A körülmények óvatos megválasztása lehetővé teszi az allélspecifikus amplifikációt. Az ábrán felül látható esetben az allélspecifikus primer tökéletesen hibridizál a templát (általában genomiális) DNS – hez. Ennek eredményeképpen ebben a reakciótérben termék keletkezik, melyet detektálni tudunk (pl. elektroforézissel). Az ábra alsó részén a templát DNS-ben bekövetkezett pontmutáció miatt a primer nem képes a templáthoz tökéletesen behibridizálni (3’ vég inkomplementaritás). Amennyiben a lehetséges kombinációkkal állítjuk össze a reakciót, több mutációt tudunk egyidejűleg vizsgálni. A módszer alkalmas az összes lehetséges (vad típus, heterozigóta, homozigóta mutáns) genotípus kimutatására. Az allélspecifikus PCR számos néven (ASO-PCR, ARMS) található a szakirodalomban, illetve kereskedelmi forgalomban is hozzáférhetők az ilyen alapelven fejlesztett mutáció detektáló kitek.

14.1. ábra - 14.1. ábra. Az allélspecifikus PCR alapelve

14.1. ábra. Az allélspecifikus PCR alapelve

Az allélspecifikus PCR azonban még mindig olyan módszer, amely gél elektroforetikus elválasztást igényel. Számos olyan törekvés volt, ami ezt a lépést próbálja kiküszöbölni, és más alapelveket használ az allélek közötti diszkriminációhoz.

Az allélspecifikus oligonukleotid hibridizáció kis skálájú, egy vagy néhány nukleotidot érintő genetikai eltérések detektálására szolgáló molekuláris genetikai diagnosztikai módszer (14.2. ábra). A módszer alapelve a tökéletes illetve nem tökéletes nukleinsav hibridizáció közti olvadáspont különbség. A teszt egy nylon vagy nitrocellulóz membránon kerül kivitelezésre. A membránra különböző szekvenciájú oligonukleotid próbák, 15-20 nukleotid hosszúságú, egyszálú DNS láncok vannak felcseppentve és immobilizálva. Egy mutációs helyet két, az adott lehetséges allélre specifikus próba definiál. Általában a próbák úgy vannak tervezve, hogy a közepük különbözzön. A PCR reakciót egy, az 5’ végén módosított (biotinált) primerrel és egy módosítatlan primerrel végezzük. Ennek eredményeképp minden PCR termék egy szála az 5’ végén egy biotin molekulát fog hordozni, melynek a detektálásnál lesz szerepe. A PCR elvégzése után a PCR terméket denaturáljuk és a denaturált PCR terméket a membrán csíkra hibridizáltatjuk. Az optimalizált tesztben az adott allél-specifikus próbához kizárólag a vele tökéletesen komplementer PCR termék fog hibridizálódni, az attól egyetlen egy nukleotidban eltérő termék már nem. Mivel az adott mutációs helyet két próba definiál, így mindhárom genotípus elkülönítése lehetséges. A hibridizáció és a megfelelő, a nem kötődött PCR termékeket eltávolító mosási lépések után a rendszerhez streptavidin-enzim konjugátot adunk (az enzim leggyakrabban alkalikus foszfatáz (AP) vagy torma peroxidáz (HRP)). A megfelelő szubsztrát hozzáadásával kizárólag ott tapasztalunk szín reakciót, ahol történt hibridizáció. A rendszer nagymértékben multiplexálható, egyidejűleg akár tucatnyi pontmutáció, vagy kis deléció, inzerció vizsgálható. Kereskedelmi forgalomban is hozzáférhetők az ilyen alapelven fejlesztett mutáció detektáló kitek.

14.2. ábra - 14.2. ábra. Mutáció kimutatás allélspecifikus oligonukleotid hibridizációval

14.2. ábra. Mutáció kimutatás allélspecifikus oligonukleotid hibridizációval

Az allélspecifikus oligonukleotid hibridizáció egyik fontos felhasználási területét mutatja a 14.3. ábra. A cisztikus fibrózis hátterében álló CFTR génmutációk nagyfokú heterogenitást mutatnak, több mint 1600 különböző patogén eltérést írtak eddig le. Körülbelül 30 gyakoribb olyan mutáció van, amely a vizsgált populációkban általában okozza a betegséget, ezért a kereskedelmi forgalomban kapható mutáció detektáló diagnosztikai kitek ezekre, a szakmailag elfogadott mutációs panelre koncentrálnak. Az ábrán egy ilyen, az allélspecifikus oligonukleotid hibridizáció elvén működő kit és annak néhány leolvasási eredménye látható. A vizsgált mutációk nagy száma szükségessé teszi két membráncsík használatát. A mutációk mind vad típus, mind mutáns alléljükkel reprezentálva vannak. Az ábra bal oldalán a CFTR19, míg a jobb oldalán a CFTR17+Tn kit látható. Egy minta vizsgálata során a két membráncsík használatával számos mutációt tudunk vizsgálni. Az első minta vad típusúnak bizonyult, amit az mutat, hogy mindkét membráncsík esetében kizárólag a normál próba szekvenciához történt hibridizáció. A második minta genotípusa p.F508del (ami a leggyakoribb cisztikus fibrózist okozó mutáció), homozigóta formában. Erre az utal, hogy a CFTR19 membráncsíkon kizárólag az M.F508del allélspecifikus próba helyén tudtunk jelet detektálni, a W.F508del = W.I507del normál allélre specifikus oligonukleotid próba helyén nem. A harmadik minta vizsgálata során két eltérést is sikerült kimutatni. A M.G542X mutáció a CFTR19, a M.R117H mutáció a CFTR17+Tn membráncsíkon adott jelet. Mivel mindkét genetikai eltérés esetében a normál próba is mutatott hibridizációt, így mindkét esetben a genotípus heterozigóta, azaz összetett heterozigótaság mutatható ki. A negyedik minta analízise a harmadikéhoz hasonlóan zárult, azaz két mutáció heterozigótaságát mutattuk ki. A két eltérés a p.S1251N és a 394delTT. Egy ilyen vagy ehhez hasonló mutáció detektáló kittel a patogén CFTR génmutációk 80-95 százaléka kimutatható, populációtól függően.

14.3. ábra - 14.3. ábra. Allélspecifikus oligonukleotid hibridizáció használata a leggyakoribb cisztikus fibrózist okozó genetikai eltérések kimutatására

14.3. ábra. Allélspecifikus oligonukleotid hibridizáció használata a leggyakoribb cisztikus fibrózist okozó genetikai eltérések kimutatására