Ugrás a tartalomhoz

Molekuláris diagnosztika

Dr. Balogh István, Dr. Kappelmayer János, Dr. Tőzsér József (2011)

Debreceni Egyetem

8. fejezet - 8. Példák monogénes betegségekre

8. fejezet - 8. Példák monogénes betegségekre

Tartalom

A Duchenne/Becker izomsorvadás (DMD-BMD, Duchenne/Becker muscular dystrophy) olyan X kromoszómához kötött progresszív izomgyengüléssel járó recesszíven öröklődő genetikai betegség, melyet az egyik legnagyobb ismert humán génben, a dystrophin génben bekövetkező súlyos trunkáló mutációk okoznak. A dystrophin gén 100-szor nagyobb egy átlagos humán génnél, nagysága az E.coli teljes genomjának a fele, nagyobb, mint bármelyik élesztő kromoszóma. Transzkripciója 16 órán át tart, az első leírt példája a kotranszkripciós splicing-nak. A 3685 aminosavas (427 kDa molekulasúlyú) fehérjét kódoló gén 2400 kb hosszú, 79 exonból áll. A kódolt fehérje, az azonos nevű dystrophin fő feladata a sarcolemma fizikai megerősítése, az intracelluláris kontraktilis elemek összekapcsolása az extracelluláris mátrix komponenseivel. Az intracelluláris lokalizációjú dystrophin az N-terminálisával kötődik az aktinhoz. Az extracelluláris elemekkel való összeköttetés a dystroglycanokon keresztül valósul meg. A DMD-BMD allélikus betegségeket a dystrophin gén különböző mutációi okozzák. Ezek az eltérések az esetek 2/3-ában nagy, több exont érintő deléciók. Az olyan mutációk, melyek nem okoznak teljes dystrophin fehérje vesztést, a lényegesen enyhébb, régen klinikailag is különállónak tartott Becker típusú izomsorvadást okozzák. Az olvasási keret státusza fontos prognosztikai marker, ugyanis ha a deléció olvasási keret eltolódást nem okoz, akkor a fehérje funkciója csökken ugyan, de valamelyest megtartott, így a Becker típus alakul ki. Az esetek egy harmada de novo mutáció eredményeként jön létre, és hasonló az arányuk a pontmutációknak, illetve gén szakasz duplikációknak is. A betegség diagnosztikája lehet fehérje alapú vagy DNS alapú. A szérumban mérhető kreatin kináz aktivitás a nekrotizáló vázizomsejtek miatt igen emelkedett, bár a hordozók esetén ez átfedhet a normál tartománnyal. Klinikai gyanú esetén lehetséges a biopsziás anyag feldolgozása immunhisztokémiával illetve SDS-PAGE elektroforézist követő immunoblottinggal. Ez utóbbi módszer lehetőséget nyújt a dystrophin fehérje hosszának meghatározására is, azaz, hogy trunkált-e vagy teljes hosszúságú, esetleg teljesen hiányzik. A molekuláris diagnosztika DNS ágán multiplex PCR teszteket fejlesztettek ki a deléciók vizsgálatára. 17 exon és a promoter vizsálatával két PCR tesztben a deléciók 98%-a kimutatható, de a módszer hordozó diagnosztikára nem alkalmas. A hordozó vizsgálat egy speciális teszttel, a multiplex ligáció függő DNS amplifikációval (multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA) végezhető el (lásd később).

Amikor kiderült, hogy e két klinikailag elkülöníthető betegséget ugyanazon gén mutációi okozzák, létrehozták a dystrophinopathiák klinikai kategóriát. Hamarosan kiderült, hogy egy harmadik betegség, az X kromoszómához kötött cardiomiopathia is ebbe a csoportba tartozik. Ezt a betegséget olyan mutációk okozzák, melyek a dystrophin gén több promotere közül a szívizom specifikus promoterben következnek be. Eredményeképp a dystrophin fehérje szelektíven hiányzik a szívizomból, míg a vázizom dystrophin szintje normál vagy közel normál (8.1. ábra). Azaz a dystrophin gén felfedezése, klónozása és karakterizálása segített három különálló klinikai betegség molekuláris kapcsolatainak felderítésében, ezáltal a molekuláris diagnózis lehetőségének kialakításában.

8.1. ábra - 8.1. ábra. Allélikus betegségek: egy gén, három betegség

8.1. ábra. Allélikus betegségek: egy gén, három betegség

Jó példaként szolgál a Duchenne izomsorvadás az indirekt molekuláris analízis bemutatására is. Ha nincs információnk az adott genetikai betegséget okozó specifikus mutáció pontos génen belüli helyzetéről, de rendelkezésre áll a családban több nemzedék mintája, kapcsoltsági vizsgálatot végezhetünk génen belüli vagy gén közeli polimorf markerekkel. A 8.2. ábrán látható analízis a dystrophin gén két oldalán található variábilis a1, a2 és b1, b2 markereket használja. Ebben az esetben az a1-b1 marker kombináció definiálja a Duchenne izomsorvadást okozó X kromoszómát. A harmadik nemzedék beteg fiú gyermekének leány testvérei esetében ezekkel a markerekkel lehetséges a hordozó állapot megállapítása. A III/2-es leány testvér hordozó, míg a III/1-es leány testvér hordozó kromoszómát nem örökölt.

8.2. ábra - 8.2. ábra. Kapcsoltsági vizsgálat hordozó állapot megállapítására

8.2. ábra. Kapcsoltsági vizsgálat hordozó állapot megállapítására