Ugrás a tartalomhoz

Molekuláris diagnosztika

Dr. Balogh István, Dr. Kappelmayer János, Dr. Tőzsér József (2011)

Debreceni Egyetem

1. fejezet - 1. A biológiai információ

1. fejezet - 1. A biológiai információ

Tartalom

A molekuláris diagnosztika az emberi örökítőanyagban bekövetkezett mennyiségi és/vagy minőségi változásokat mutatja ki. Tágabb értelemben mindazon molekuláris biológiai technikákat magában foglalja, melyek a veleszületett betegségek hátterét analizálja, így ebbe a csoportba sorolhatók a genetikai, genomikai technológiákon túl a proteomika széles módszertana is. E tananyag azonban a molekuláris diagnosztika azon értelmezését fejti ki, mely a genetikai kérdések tisztán nukleinsav-alapú megközelítését tartalmazza.

A két fő elemből (mitokondriális és nukleáris) álló emberi genom ma már nagyjából ismert. A mitokondriális genom egy cirkuláris DNS molekulából áll, 16,6 kilobázis (kb) hosszú. Molekuláris patogenetikai szempontból fontos megemlíteni, hogy a mitokondriális genom kizárólag anyai ágon öröklődik. A mitokondriális genom 13 fehérjét kódoló gént tartalmaz, melyek - szemben a nukleáris gének nagy részével - intronmentesek. A 3,1 gigabázis (Gb) méretű nukleáris genom kromoszómákba rendeződik. A humán kromoszóma készlet a 22 testi kromoszóma mellett két nemi, X és Y kromoszómából áll. A genom kb. 20000 fehérjét kódoló gént tartalmaz, átlagosan 1/120 kb denzitással. A gének rendkívül nagy variabilitást mutatnak, mind exonjaik számában, mind méretükben. Az átlagos gén kb. 10 exont tartalmaz, a legnagyobb exon számmal rendelkező humán gén az izomban expresszálódó titin (363 exon). A legnagyobb ismert humán gén a szintén izomban expresszálódó dystrophin, mely 2400 kb. Ez utóbbi gén öröklött hibája vezet a Duchenne/Becker izomsorvadáshoz.

A génekben tárolt információ számos szinten szabályozódva kerül funkcionális kifejeződésre (1.1 ábra).

A genetikai információ általános haladási iránya a DNS-RNS-fehérje irány. A genomiális (vagy mitokondriális) DNS-ből RNS molekula közvetítésével kerül kifejeződésre a genetikai információ a transzlált fehérjék formájában (1.1 a).

Az esetenként igen komplex és részleteiben még mindig nem ismert szabályozási folyamatok minden szintet érintenek. A DNS/fehérjekomplexek szerkezete definiálja az aktív régiókat, együtt a DNS epigenetikai módosításaival. A transzkripcionális szabályozás megvalósulhat a különböző splicing mintázatokon, a szövet specifikus expresszión, valamint a kicsi szabályzó RNS molekulák által is. A fehérjék számos poszttranszlációs módosításon eshetnek át (1.1 b).

1.1. ábra - 1.1. ábra. A biológiai információ szerveződési szintje genetikai  szempontból

1.1. ábra. A biológiai információ szerveződési szintje genetikai  szempontból

Az emberi gének exonjainak átlagos hossza kb. 300 bp. A genetikai információ fő funkcionális kifejeződése a fehérje szintézis. A génekben kódolt információ az mRNS-en keresztül alakul át a fehérje szekvenciájává. Az elsődleges transzkript még tartalmazza a teljes gén szekvenciát. Az mRNS érése során megtörténik az intronok kivágódása és a kódoló exonok összekapcsolódása, a splicing, valamint az mRNS molekula több módosítást is kap. Ezek az alábbiak:

  • - 5’ sapka. Az mRNS egy 7-metilguanozin sapkát kap az 5’ végére. Ennek fő funkciói az mRNS védelme az 5’-3’ exonukleáz emésztéstől, az mRNS citoplazmatikus transzportjának elősegítése, a splicing és a riboszóma mRNS kötődésének elősegítése.

  • - poliadenilációs szignál. A mRNS molekula egy kb. 200 adeninből álló poliadenilációs farkot kap a 3’ végére. A poliadenilációs szignál felrakási helyét egy AAUAAA szekvenciamotívum jelzi. Ettől kb. 15-30 nukleotid távolságra 3’ irányban történik meg az mRNS hasítása és az adeninek mRNS-be építése. A poliadenilációs szignál szerepe hasonló az 5’ sapkáéhoz, azaz segíti az mRNS citoplazmatikus transzportját, stabilizálja az mRNS-t, illetve segíti a riboszomális apparátus mRNS kapcsolódást. Fentiek összefoglalása látható az 1.2 ábrán.

A poliadenilációs szignál felrakási hely körüli szekvenciák fontosságát jelzi, hogy az itt bekövetkező mutációk patogének lehetnek (pl. protrombin gén 20210A allél), mert interferálhatnak a szignál felrakásával. Ebben az esetben a vad típusú guanin helyett a mutációt szenvedett adenint tartalmazó 20210A allél következménye stabilabb, vagy jobban processzált mRNS molekula, mely hatékonyabb fehérje szintézist tesz lehetővé. A megnövekedett fehérjemennyiség szekretálódik, és ennek molekuláris fenotípus következménye a megemelkedett plazma protrombin szint. A megemelkedett plazma protrombin szint pedig 2-3-szorosra megemeli a vénás trombózis kialakulásának esélyét. A mutáció jelentősége nem csak abban áll, hogy in vivo példája a transzkripciós szabályozási finomhangolás defektusnak, hanem az is, hogy igen gyakori, prevalenciája elérheti a 2-4%-ot is.

1.2. ábra - 1.2. ábra. A géntől a fehérjéig

1.2. ábra. A géntől a fehérjéig

Ha nem is az összes, de a legtöbb fehérje kódoló gén tartalmaz intronokat. A nem kódoló intronok képviselik a gén nagy részét, a kódoló exonok általában sokkal rövidebbek.

Az elsődleges RNS transzkript keletkezése után a megfelelő szignálok segítségével megtörténik az intronok kivágódása (splicing). A splicing korrekt kivitelezéséhez szükség van azon jelekre, melyek mutatják az exon-intron határt. Az 1.3 ábrán két exon vége, és a közrefogott intron látható. Az intron 5’ vége a donor splicing hely, míg a 3’ vége az akceptor. Közvetlenül az exon-intron határon találhatók az invariáns GT és AG dinukleotidok az intronban (a betűk fölött a számok az előfordulás valószínűségét jelzik). Igen kritikus még az ún. branch point helyen lévő adenin. Az Y citozint és timint egyaránt jelenthet, az N bármely nukleotidot. Az invariáns helyeken bekövetkező mutációk alapvetően fogják befolyásolni a splicing folyamatát, így nagyon gyakran megváltozott mennyiségű vagy szerkezetű proteinek kialakulása lesz az eredmény. A GT-AG intronokon túl vannak még igen ritkán más jelzésű intronok is. A splicing szignálok fontosságát jelzik, hogy a bennük bekövetkező mutációk majdnem minden esetben patogének.

1.3. ábra - 1.3. ábra. Az exon-intron határ konszenzus szekvenciái

1.3. ábra. Az exon-intron határ konszenzus szekvenciái