Ugrás a tartalomhoz

Molekuláris terápiák

Dr. Balajthy Zoltán, Dr. Aradi János, Dr. Balajthy Zoltán, Dr. Csősz Éva, Dr. Scholtz Beáta, Dr. Szatmári István, Dr. Tőzsér József, Dr. Varga Tamás (2011)

Debreceni Egyetem

12.5. Gén csendesítés ribozimokkal

12.5. Gén csendesítés ribozimokkal

A ribozimok katalitikusan aktív RNS-ek. Számos biokémiai reakciót katalizálhatnak, többek között az internukleotid kötés hidrolízisét. Ez az aktivitás (eredetileg Cech fedezte fel) felhasználható géncsendesítésre, az mRNS, mRNS prekurzor, vagy virális RNS specifikus degradációja által.

Nagy katalitikus RNS-ek: I és II típusú intronok és RNáz P.

Kis katalitikus RNS-ek: kalapács-fejű, hajtű és hepatitisz delta ribozimok.

Kisérleti vagy terápiás célból (egyelőre ez is kísérleti) rendszerint kis katalitikusan aktív RNS-eket használnak, melyek megfelelő kémiai módosításokat tartalmaznak, ezáltal stabilitásuk és a sejtekbe való bejutásuk mértéke javúl (12.5.-8. ábra).

12.5. ábra - 12.5. ábra. Géncsendesítésre gyakran használt ribozimok szerkezete

12.5. ábra. Géncsendesítésre gyakran használt ribozimok szerkezete

12.6. ábra - 12.6. ábra. rRNS prekurzorok ön-splicing mechanizmusa Tetrachymenaban

12.6. ábra. rRNS prekurzorok ön-splicing mechanizmusa Tetrachymenaban

12.7. ábra - 12.7. ábra. Kalapácsfejű ribozim konstruálása M1 RNS ellen

12.7. ábra. Kalapácsfejű ribozim konstruálása M1 RNS ellen

12.8. ábra - 12.8. ábra. Mutáns p53-hiz kötődő, azt javító I-csoportú intron tervezése

12.8. ábra. Mutáns p53-hiz kötődő, azt javító I-csoportú intron tervezése

A ribozimok potenciális antitumor és antivirális ágensek: onkogéneket kódoló gének lehetnek terápiás célpontok. További célpontok lehetnek: növekedési faktorok és receptoraik. Vírus proteinek szintézise szintén gátolható a vírus specifikus mRNS-ek ribozimokkal történő degradációjával.

Ribozimok géncsendesítésre történő felhasználása során két probléma merülhet fel, akár kísérleti, akár terápiás célból történik a gátlás:

  • Érzékenység nukleázokkal szemben

  • Sejtbe történő felvétel problémái

Ezek a problémák megoldhatók az oligonukleotidok kémiai módosításával, és/vagy effektív felvételt stimuláló anyagok segítségével.

Azok a kémiai módosítások, melyeket az antiszensz oligonukleotidoknál mutattunk be, ribozimoknál is alkalmazhatóak.

Gén csendesítés kis RNS fragmentekkel

Rövid, 19-23 nukleotidból álló RNS fragmentek képesek gátolni specifikusan a fehérje szintézist, kapcsolatba lépve a megcélzott mRNS-el. Így, ezek a rövid RNS darabok rendkívül eredményes eszközei a kísérleti géncsendesítésnek, és potenciális terápiás ágensek. Két jól elkülöníthető osztálya létezik a gén csendesítő RNS-eknek, a mikro-RNS-ek (miRNA) és a kis interferáló RNS-ek (Small inrerfering RNS = siRNS)

Az siRNA és miRNA egyaránt mint részlegesen duplaszálú RNS (dsRNS) szintetizálódik. Ez a primer produktum, melyet az RNS polimeráz II szintetizál. A sejtmagban mindkettőt a DROSHA nevű protein komplex processzálja részlegesen, majd a citoplazmába transzportálódik, ahol a processzinget a DICER fejezi be rövid (21-23 nukleotid) duplaszálú (siRNS) vagy részlegesen duplaszálú (miRNS) RNS-eket készítve. Mind a miRNS, mind az siRNS antiszensz szála (irányító szál) egy effektor szerkezetbe lép be, a RISC complexbe (RNA Induced Silencing Complex; miRISC; siRISK). Az antiszensz szál irányítja a RISC-et a target mRNS-hez, mely így gátolja a protein szintézist, jelentősebb degradáció nélkül (miRNS), vagy hasítva az mRNS-t (siRNS).

A miRNS-ek fő funkciója a génexpresszió szabályozása.

A miRNS-ek endogén, nem kódoló RNS-ek. Az miRNS-ek antiszensz szála nem képez tökéletes dupla hélixet a célzott mRNS-el. Rendszerint több kötőhelye van a miRISC-nek a target mRNS 3’ nem-transzlálódó szakaszán (12.9. ábra).

12.9. ábra - 12.9. ábra. Lehetséges működési mechanizmusok. A: siRNS, B: miRNS

12.9. ábra. Lehetséges működési mechanizmusok. A: siRNS, B: miRNS

Az siRNS-ek elsődleges funkciója idegen (exogén; pl. virális) gének expressziójának megakadályozása, a védelem ellenük.

Az siRNS, vagy prekurzora, szintetizálható és bejuttatható a sejtbe (exogén eredet); az siRISC komplex antiszensz szála tökéletes dupla helixet képez a célzott mRNS-el; a RISC komplex egyik komponense, az argonaute protein nukleáz aktivitású, domaine az mRNS szelektív hasítását végzi. A hasított mRNS tovább degradálódik celluláris nukleázok segítségével.

Ahogy fentebb említettük, a 21 nt hosszúságú dsRNS, 3’ túlnyúló véggel, sejtekbe juttatható géncsendesítés indukálására (12.10. és 12.11. ábra). Óriási előnye a módszernek, hogy egy relatíve kis molekulatömegű ágens tervezhető és termelhető nagyon eredményes és specifikus géncsendesítésre. Valószínűleg ezek az oligomerek hasznosíthatók lesznek mint szisztémásan alkalmazott terápiás ágensek.

12.10. ábra - 12.10. ábra. miRNS és siRNS útvonalak

12.10. ábra. miRNS és siRNS útvonalak

12.11. ábra - 12.11. ábra. miRNS és si RNS riboszintézise

12.11. ábra. miRNS és si RNS riboszintézise

In vitro termelt shRNS (small hairpin RNA = rövid hajtű RNS) és dsRNS használható közvetlen traszfekcióra (12.11. és 12.12. ábra). Az előregyártott shRNS-t és dsRNS-t a Dicer 21 nt hosszúságú, 2 nukleotid hosszú 3’ véggel rendelkező részekké hasítja (processzálja), az 5’ vég foszforilálódik (12.13. ábra).

12.12. ábra - 12.12. ábra.miRNS és siRNS működési útvonalai, RNS interferencia indukálásának lehetőségei

12.12. ábra.miRNS és siRNS működési útvonalai, RNS interferencia indukálásának lehetőségei

12.13. ábra - 12.13. ábra. Funkcionálisan aktív siRNS

12.13. ábra. Funkcionálisan aktív siRNS

Az siRNS két szálának a funkciója különböző: az antiszensz (irányító) szál a RISC része lesz, funkciója, hogy a RISC megtalálja a célzott mRNS-t. A szensz (utas) szál degradálódik, nincs további funkciója.

Argonaute proteinek funkciója.

Az argonaute proteinek a RISC (RNA induced silencing complex) részei, katalitikusan aktivak, endonukleáz aktivitással rendelkeznek (12.14. ábra). Az argonaute proteinek evolúciósan konzerváltak, két alcsoportra oszthatóak: Ago és Piwi alcsoportra. Ago proteinek szinte mindenhol expresszálódnak.

12.14. ábra - 12.14. ábra. Az Ago proteinek szerepe az siRNS és miRNS által indukált géncsendesítésben

12.14. ábra. Az Ago proteinek szerepe az siRNS és miRNS által indukált géncsendesítésben

Módszerek funkcionálisan aktív siRNS-ek alkalmazására kísérleti vagy terápiás célból:

  1. 1. Plazmidok vagy virális vektorok alkalmazása (az expresszált produktumnak processzálódnia kell;.(12.15. ábra.)

    12.15. ábra - 12.15. ábra. Funkcionálisan aktív shRNS-t expresszáló plazmidok

    12.15. ábra. Funkcionálisan aktív shRNS-t expresszáló plazmidok

  2. Dupla szálú RNS-ek vagy shRNS-ek alkalmazása (ezeket a dicer-nek processzálnia kell).

  3. Rövid (~21 nt) duplaszálú RNS-oligok használata, melyek rendszerint kémiai módosításokat is tartalmaznak.

Funkcionálisan aktív shRNS-t expresszáló plazmidok. A kis hajtű RNS-ek (shRNA = Small Hairpin RNA) az siRNS-ek prekurzorai (40. és 41. ábra). Az shRNS-eknek processzálódniuk kell Dicer hatására, hogy aktív siRNS-ekké (~21 nukleotid hosszú) alakuljanak. Ezután az antiszensz (irányító) szál részt vesz az aktív RISC kialakításában (12.16 és 12.17 ábra). A szensz szál degradáklódik.

12.16. ábra - 12.16. ábra. Az shRNS termelő plazmid géncsendesítő akciójának mechanizmusa

12.16. ábra. Az shRNS termelő plazmid géncsendesítő akciójának mechanizmusa

12.17. ábra - 12.17. ábra. Géncsendesítés 21 nukleotid hosszú dsRNS oligomerekkel

12.17. ábra. Géncsendesítés 21 nukleotid hosszú dsRNS oligomerekkel

Virális vektorok használata shRNS termelésre. Virális vektorok effektíven használhatóak shRNS termelésre, olyan sejtekben, melyeket nehéz transzfektálni más módszerekkel; még nem osztódó sejtekben is alkalmazhatóak (12.18. ábra). A virális vektorok igen effektíven, természetes úton fertőzik (transzdukció) a sejteket. A leggyakrabban használt virális vektorok shRNS-ek sejten belüli produkciójára a következők: Adenovírus, Adeno-asszociált vírus (AAV), Lentivírus, Retrovírus, Herpes és Baculovírus vectorok.

12.18. ábra - 12.18. ábra. shRNS-ek lentivirális expressziója

12.18. ábra. shRNS-ek lentivirális expressziója

Epigenetikus géncsendesítés. A dezoxi-citidilátok metilációját (epigenetikus módifikálását) a DNS specifikus helyein siRNS-ek irányíthatják. A folyamat során egy RNS polimeráz lép működésbe rövid csatoló RNS-t (scaffold RNS) szintetizálva. Ehhez csatlakozik az siRNS (scaffold RNS/siRNS), majd egy metiláz enzim és más proteinek. Az így kialakuló komplex végzi az siRNS által kijelölt DNS szekvencia metilációját.

Az RNS irányított DNS metiláció egy példa arra, hogy a géncsendesítés történhet epigenetikai változások indukálásával.

A metiláció specifikus helyét az siRNS szekvenciája határozza meg. A folyamat gének promóter régióit is érintheti, leállítva a gén átírását. A géncsendesítés itt bemutatott mechanizmusát növényekben tanulmányozták részletesen.

Az siRNS-ek lehetséges kémiai módosításai. Az siRNS eredményessége növelhető, ha az oligonukleotid szálakon megfelelő kémiai módosításokat hajtanak végre.

A 3’ túlnyúló szakasz, a szensz szál és az antiszensz szál 3’ végi 10 nukleotidja kémiailag módosítható anélkül, hogy aktivitásából jelentősen veszítene a molekula.

Az antiszensz szál 5’ végén elhelyezkedő 6-7 nukleotid (seed region) érzékeny kémiai módosításokra.

A kémiai módosítások hatása az siRNS-ek aktivitására

Növelheti a rezisztenciát különböző nukleázokkal és dieszterázokkal szemben, így növelve az siRNS fél-életidejét.

  • Növelheti az oligonukleotidok nukleáz rezisztenciáját, így növelve fél-életidejét a sejtben.

  • Javíthatja a sejtbe való bejutás effektivitását

  • Alkalmas lehet a molekulák specifikus célba juttatására.

  • Emelheti a molekula általános effektivitását a fenti javított tulajdonságok kombinációja által (48. ábra).