Ugrás a tartalomhoz

A biokémia alapjai

Wunderlich Lívius, Szarka András (2014)

Typotex Kiadó

12. fejezet - Replikáció, transzkripció, transzláció

12. fejezet - Replikáció, transzkripció, transzláció

A nukleotidok és az aminosavak szintéziséről már esett szó, de még nem részleteztük, hogy milyen elvek szerint és milyen mechanizmusokkal történik a nukleinsavak és a fehérjék (polipeptid-láncok) szintézise az alapkövekből. A replikáció során keletlezik az új DNS-szál, a transzkripcó során RNS keletkezik, transzlációnak pedig a polipeptid-lánc felépülését hívjuk. Ezeket a mechanizmusokat azért taglaljuk külön fejezetben, és nem az aminosav- vagy a nukleotid-anyagcseréhez kapcsoltan (mint például azt a poliszacharidok esetében tettük a szénhidrát-anyagcsere ismertetésekor), mert ezek egymással nagymértékben összefüggenek.

A molekuláris biológia ún. centrális dogmája szerint a DNS másolásával keletkezik az új DNS, DNS átírásával keletkezik az RNS, majd az RNS szolgál mintájául a fehérje keletkezésének (12.1. ábra). A folyamat fordítva nem történik meg, kivéve azon ritka eseteket, amikor RNS-vírusok RNS-e DNS vagy RNS keletkezéséhez szolgál mintául, vagy amikor a telomeráz enzim RNS-e szolgáltatja a templátot (mintát) a kromoszómák telomerjeinek hosszabbításához.

12.1. ábra -


Replikáció

Emlékeztetőül felidézünk néhány fontos információ a DNS-sel kapcsolatban: A nukleotidok dezoxiribóz-foszfát láncot alkotnak, a cukor részről ágaznak le a szerves bázisok, amelyek vagy pirimidin-, vagy purin-vázúak. A DNS kettős spirált alkot, a feltekeredő két láncot a bázisok között létrejövő másodlagos hidrogén-kötések tartják össze. A két lánc egymáshoz képest antiparalel („fej-láb”) elrendeződésű, és egymással komplementer: purin bázissal szemben mindig pirimidin (adeninnel szemben timin, guaninnal szemben citozin) található (3.18. ábra).

A replikáció szó másolást jelent; a folyamat során a kettős szálú DNS lemásolódik, a replikáció végén két identikus kettős szálú DNS keletkezik. A folyamat jelentősége az öröklődésben van; mindig replikáció előzi meg például a sejtek vagy bizonyos sejtszervecskék (mitokondrium, színtest) osztódását, hogy mindkét utódsejtbe (vagy sejtorganellumba) azonos genetikai állomány juthasson. A másolást megelőző változásokról (a sejtciklus kiváltó okairól és szabályozási mechanizmusairól) itt nem kívánunk értekezni, elsősorban annak bonyolultsága miatt. Kizárólag a DNS-megkettőződés közvetlen előzményeivel és mechanizmusával fogunk foglalkozni. Először a prokarióták genetikai állományának replikációs folyamatait ismertetjük, az eukariótákban található különbségeket pedig külön részletezzük.

Replikáció prokariótákban

Prokariótákban az éppen nem replikálódó DNS-spirál nagy része további tekeredés következtében ún. pozitív szupertekercs állapotban van. A replikáció elősegítése érdekében a DNS topoizomeráz enzimek segítségével átrendeződik; negatív szupertekercs keletkezik. Ebben az állapotban sokkal könnyebben fel tud majd nyílni a DNS.

A DNS-megkettőződés során a két szál elválik egymásról, és mindkét szál másolatul szolgál egy új, a levált szállal megegyező szekvenciájú másolat szintetizálásához. A keletkező új szálak az eredeti szállal fognak egy új kettős spirált (hélixet) alkotni. Ezt a mechanizmust a DNS szemikonzervatív replikációjának hívjuk; mindkét keletkező kettős szál egyik fele az eredeti szálból való, a másik fele pedig újonnan szintetizálódott. Mivel a két DNS-szál egymásnak komplementere, információvesztés nem történik (12.2. ábra).


A replikációs folyamat elindulásához a DNS kettős hélixnek fel kell nyílnia. Ez nem a DNS teljes hosszában történik meg, csak bizonyos szakaszokon. Ezeket a szakaszokat replikációs origóknak, két eltávolodó szál által létrehozott struktúrát pedig replikációs buboréknak nevezzük. A prokarióták kromoszómája viszonylag rövid, cirkuláris (kör alakú), itt egyetlen replikációs origó található. Eukariótákban a genetikai állomány sokkal nagyobb, nagyon hosszú ideig tartana még a több kromoszómába csomagolt DNS teljes átírása is, ezért a replikáció kezdetekor egyszerre több ponton is felnyílik a kettős spirál. Ebben a folyamatban először a DnaA fehérje játszik fontos szerepet; a replikációs origó speciális szekvenciáit képes felismerni, és azokhoz kötődni, ha azok negatív szupertekercs állapotban vannak. Több DnaA fehérje egyidejű kötődése elősegíti, hogy a DNS kettőslánc rövid szakaszon felnyíljon. A replikációs buborék további szélesítését a helikáz enzim (DnaB) végzi, mely ATP energiájának felhasználásával a két szál közti hidrogén-kötéseket máig felderítetlen mechanizmussal megszünteti, ezáltal a két szálat eltávolítja egymástól (12.3. ábra).


A replikációs buborék két végén túl, a két szál egymástól való eltávolítása miatt a kettős spirál a szokottnál jobban feltekeredik, ami a buborék további növekedését, ezáltal a replikáció menetét akadályozná. Ezt a problémát a topoizomeráz enzimek oldják meg, melyek a szupertekeredő DNS egyik szálát elvágják, majd a relaxáció után újraforrasztják. A topoizomerázok tulajdonképpen az izomerázok közé sorolhatók, két különböző topológiai szerkezet térbeli átrendeződését segítik elő.

A szétnyíló DNS mindkét szálával szemben először mindig egy rövid (kb. 6-8 nukleotid hosszú) RNS-darab szintetizálódik. Ennek az az oka, hogy a DNS-polimeráz enzim működéséhez szüksége van egy olyan szakaszra, amely már kettős szálú; a második szál polimerizációját csak annak a végétől tudja folytatni. Ezt a rövid RNS-darabot (primert) használja majd fel a DNS-polimeráz, hogy dezoxiribonukleotidokkal hosszabbítsa meg a rövid RNS-szakaszt. A rövid RNS-primer egyébként a primáz enzim segítségével szintetizálódik az egyszálú DNS-re, ugyanis annak nincs szüksége már meglévő kettős szálú részre a működés megkezdéséhez.

A nukleinsavak polimerizációs folyamatának szubsztrátjai mindig nukleozid-trifoszfátok. A két foszfo-anhidrid kötés felszakadásának energiája nemcsak a nukleozid-monofoszfátok közötti, vízkilépéssel járó foszfoészter kötés létrejöttéhez, hanem a reakció irreverzibilissé tételéhez is elegendő. Az összes nukleinsav polimerizációja 5’-3’ irányú (tehát a templát szál olvasása 3’-5’ irányú). Ez azt jelenti, hogy mindig a már meglevő oligi/poli-nukleotid szál pentóz részének harmadik szénatomján található hidroxilcsoporthoz kapcsolja majd az új nukleotid pentózának ötödik szénatomján található foszfátot (12.4. ábra).

12.4. ábra - Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 4th edition - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26850/figure/A757/?report=objectonly; 2013.04.09.

Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 4th edition - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26850/figure/A757/?report=objectonly; 2013.04.09.

Ennek az lesz a következménye, hogy a replikációs buborék közepétől mindkét szálon csak az egyik irányban történhet meg a folyamatos szintézis, a másik irányban nem; itt az egyre jobban szétnyíló buborék teszi azt lehetővé, hogy a buborék széle felől a közepe felé szakaszosan történjen a szintézis. Ha a replikációs buboréknak csak az egyik felét nézzük (amelynek a működése pontosan megegyezik a másik felével), akkor ezt a részt replikációs villának is nevezzük. A replikációs villában megkülönböztethető az a rész, ahol a szintézis folyamatosan történik (vezető szál), és ahol szakaszosan történik (követő szál). A vezető szálon a primáz enzim szintetizálta rövid RNS-szakaszt követően a DNS-polimeráz folyamatosan építi fel a DNS második láncát, míg szemben vele, a követő szálon, mindig újra és újra kell a primáznak egy rövid RNS-primert szintetizálni, hogy a DNS-polimeráz azután megszintetizálja a hiányzó szakaszt. Ezeket a követő szálon található, most még különálló 1000-2000 nukleotid hosszúságú fragmentumokat felfedezőjükről Okazaki-fragmentumoknak nevezzük (12.5. ábra).


A replikációs villában prokariótáknál a DNS-polimeráz III enzim található, ez katalizálja a polimerizációt.

Azt gondolhatnánk, hogy a vezető szálon a szintézis gyorsabban halad, hiszen a követő szálon a DNS-polimeráznak mindig vissza kell ugrania a következő RNS primerhez. Azonban ez a mechanizmus nagyon ügyesen össze van hangolva azáltal, hogy tulajdonképpen egyetlen, két katalitikus centrummal bíró enzimkomplex katalizálja a replikációt egyszerre mindkét szálon. Mivel a szintézis a szálakon az ellenkező irányban halad, ez úgy lehetséges, hogy a követő szál hurkot képez. Ezért térben megvalósulhat az, hogy egy replikációs villában ugyanaz a komplex végzi mind a vezető, mind a követő szál egyidejű, ugyanolyan sebességű szintézisét. A követő szál szintézisekor ez a hurok egyre nagyobb lesz, majd hirtelen megrövidül, amikor a polimeráz egy újabb RNS-primerre ugrik át, hogy onnan kezdje az újabb DNS-szakasz szintézisét. A helikáz enzim hozzákapcsolódik a DNS-polimeráz komplexhez, így a replikációs villa felnyílása és a DNS-szintézis ugyanabban az ütemben történik.

A DNS-polimeráz III-nak az 5’-3’ polimeráz aktivitáson kívül van még 3’-5’ exonukleáz aktivitása is. Ez a hibajavításhoz kell: a polimerizáció során óhatatlanul megtörténhet, hogy rossz, nem a komplementer szálnak megfelelő nukleotid épül be az új szálba. Mivel a bázispárosodás nem tökéletes, ezt észreveszi az enzim, és visszafelé kihasítja a már beépült, de nem megfelelően párosodó nukleotidot. A hiba kijavítása után a polimerizáció természetesen tovább folytatódhat.

A hibajavítás ténye adhatja meg a magyarázatot arra a kérdésre, hogy a polimerizáció miért mindig 5’-3’ irányban halad. 3’-5’ irányban ugyanúgy haladhatna egészen addig, amíg a hibajavító mechanizmus el nem távolítaná az utolsó (esetünkben az 5’) nukleotidot. Mivel az 5’ részen lévő trifoszfát is eltávozna, ezáltal az 5’ láncvégi nukleotid már csak egy foszfátot tartalmazna. Az újonnan érkező, beépülésre váró nukleotid OH-csoportja már csak plusz energiabevitellel lenne képes ezzel a foszfáttal foszfoészter kötést kialakítani. 5’-3’ szintézishez nem szükséges többletenergia: az újonnan érkező nukleotid 5’ végén lévő trifoszfát biztosítja a kötés létrehozásához szükséges energiát (12.6. ábra).

12.6. ábra - Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 4th edition - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26850/figure/A769/?report=objectonly; 2013.04.09.

Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 4th edition - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26850/figure/A769/?report=objectonly; 2013.04.09.

Maradt még néhány megválaszolatlan kérdés. Mi történik a követő szálon az RNS-darabkákkal, és hogyan kapcsolódnak össze az Okazaki-fragmentumok? A DNS-polimeráz III az RNS-primerekig szintetizálja a DNS-láncokat. Van egy másik DNS-polimeráz is, a DNS-polimeráz I, amely 5’-3’ polimeráz és 3’-5’ exonukleáz aktivitáson kívül rendelkezik 5’-3’ exonukleáz aktivitással is. Ez a polimeráz tehát megtalálja azokat a helyeket a szálon, ahol szakadás van, és ott elkezdi 5’-3’ irányban leemészteni a ribonukleotidokat (majd a dezoxiribonukleotidokat is), és szintetizálja az új komplementer DNS szálat is helyette. A DNS-polimeráz I-nek azonban nem túl nagy az affinintása a DNS-hez, gyakran ledisszociál róla. Ilyenkor szabadon marad az a szakasz, amelyen a DNS egyik szálán a szakadás (nick) található. Ezt ismeri fel a DNS-ligáz enzim, mely képes energia felhasználásával a foszfo-észter kötést a nukleotidok között létrehozni.

Replikáció eukariótákban

Az eukarióta genom (teljes nukleáris genetikai állomány) replikációja alapvető mechanizmusában hasonló a prokariótákéhoz, a főbb különbségeket megpróbáljuk kiemelni. Eukariótákban a DNS a kromoszómákban van sokszorosan feltekert állapotban. Ennek a sokszoros feltekeredésnek kell megszűnni, miközben a nukleoszómáknak is szét kell esniük. A folyamat szigorún szabályozott, melynek pontos részleteire nem térünk ki. Annyit elég megemlíteni, hogy a DNS-tekeredésért itt is a topizomeráz enzimek felelősek.

Mint már említettük, a replikáció nem egy origóban, hanem több egymástól távoli helyen kezdődik meg csaknem ugyanabban az időben. Ennek következménye az lesz, hogy egy idő után ezek a replikációs buborékok elérik egymást, összeolvadnak (12.7. ábra).


Eukariótákban a DNS-polimerázok is kicsit másképp működnek. Itt két különböző polimeráz van a vezető és a követő szál szintéziséhez. A polimerázok nem mind rendelkeznek exonukleáz aktivitással; a hibajavítást, illetve az RNS-primerek eltávolítást a polimerázokhoz kapcsolódó specifikus nukleázok végzik.

Az eukarióták genomja lineáris DNS-szakaszokba van csomagolva. Ezek a kromoszómák, melyeknek a végeit teloméreknek hívjuk. A telomérek a kromoszóma igen fontos részei; speciális fehérjék kötődnek hozzájuk, épségük a megfelelő sejtosztódáshoz elengedhetetlen. A telomérek minden osztódási ciklus után rövidülnének, hiszen a követő szálon az 5’ végen maradna egy olyan szakasz, amely a replikáció során nem tudna átíródni (a replikáció ugyanis egyirányú), ezáltal minden egyes osztódás után egyre rövidebb DNS adódna tovább az utódsejtbe. A cirkuláris DNS-sel bíró prokariótákban ez természetesen nem probléma, azokban mind a két szál képes körben átíródni.

A telomér szekvenciák átírását a telomeráz enzimek segítik. A telomérek többszörösen ismétlődő motívumokat tartalmazó, úgynevezett repetitív (ismétlődő) szekvenciákkal rendelkeznek. A telomeráz enzimhez asszociálódva található egy rövid RNS-szekvencia, mely komplementer ezekkel a szekvenciákkal, és egy rövid részen hibridizálni tud a telomér túlnyúló 3’ szálával. Ez a kis hibridizált szakasz megfelelő primernek bizonyul ahhoz, hogy az enzim saját polimeráz aktivitását kihasználva meghosszabbítsa a 3’ véget. A véghosszabbítás után a telomeráz áthelyeződik úgy, hogy az RNS-e ismét össze tudjon párosodni az újonnan szintetizálódott 3’ véggel, ezáltal ismét primerként használva azt. A lánchosszabbítás többször megismétlődik, a megfelelően hosszú 3’ túlnyúló véghez egy primáz most már tud RNS-darabot szintetizálni, és a DNS-polimeráz segítségével feltöltődik a másik szál (12.8. ábra).

12.8. ábra - Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 4th edition - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26826/figure/A821/?report=objectonly 2013.04.10.

Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 4th edition - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26826/figure/A821/?report=objectonly 2013.04.10.

A telomerázok elsősorban az embriogenezis során vagy sűrűn osztódó sejtekben aktívak (ilyenek például a tumorsejtek is). Szomatikus (testi) sejtekben a telomerázok többnyire nem aktívak. Ez lehet az oka annak is, hogy felnőttekben a szomatikus sejtek osztódásának lehetősége függ a bennük lévő telomérek hosszától, a telomérek rövidülése az osztódási hajlandóságot is csökkenti. Ez lehet az egyik oka az öregedés mechanizmusának.

A DNS hibajavítás

Semmilyen mechanizmus sem tökéletes, így a replikáció sem. Bár igen nagy pontossággal működnek a reakciók, mégis becsúszhat egy-egy hibás nukleotid a replikáció során. Nemcsak a replikáció során, hanem máskor is történhet DNS-sérülés. Ezek történhetnek spontán módon vagy valamilyen környezeti hatásnak (például radioaktivitás, UV- vagy röntgen-sugárzás, vegyi anyagok) a következtében. A DNS információtartalma miatt elsődleges fontosságú, hogy a hibák a soron következő replikáció előtt kijavítódjanak, különben a DNS maradandó információvesztést (vagy –változást) szenvedhet, ami továbböröklődik az utódsejtekbe. Ezt az elváltozást hívjuk mutációnak. A DNS hibajavító mechanizmusok megpróbálják a DNS-károsodást kijavítani úgy, hogy ne történhessen mutáció. A következőkben néhány tipikus DNS-károsodást ismertetünk a lehetséges javító-utakat is megemlítve.

Az egyik legáltalánosabb, gyakran UV-sugárzás okozta károsodás az ugyanazon a szálon, egymás mellett lévő bázisok (az esetek java részében timin-bázisok) dimerizációja. Ilyenkor a szomszédos bázisok gyűrűinek szénatomjai között kovalens kötések keletkeznek. A sérülést egy specifikus endonukleáz felismeri, és a sérült nukleotidok foszfodiészter kötéseit hasítva, teljesen kivágja őket a sérült DNS-szálból. Ezt a rövid, egyszálú szakaszt (ún. gap-et) a DNS-polimeráz befoltozza, a hiányzó foszfodiészter kötés (nick) a DNS-ligáz segítségével jön létre.

Egy másik gyakori sérülés az általában sav vagy hő hatására bekövetkező depurináció. Ilyenkor az adenin- vagy guaninbázisok az N-glikozidos kötés felhasadásával leszakadnak, és csak a dezoxi-ribóz foszfát marad vissza a láncban. Szintén nem ritka sérülés a dezaminálódás, ami például röntgensugárzás vagy alkilálószerek hatására jöhet létre. Ennek során a bázisok dezaminálódnak, ennek során például az adeninből hipoxantin, citozinból uracil keletkezik. Ennek következtében megváltoznak a bázispárosodási preferenciák, ami hibajavítás nélkül a replikáció során maradandó mutációt okozna. Emiatt a gyakori sérülés miatt nem tartalmazhat a DNS dezoxi-uracilt. A dezaminálódott citozin szintén elképzelhető bázis lenne, csakhogy a hibajavító enzimek nem tudnák, melyik nukleotidot (az újonnan képződött dUMP-t, vagy az eredeti dGMP-t) kell kicserélniük. A felismerés és a hibajavítás hasonló az előbb ismertetett módhoz; az idegen, vagy a sérült nukleotid kivágódik (előtte a sérült bázis lehasad), helyette új épül be.

A replikáció során a hibásan beépült, nem megfelelően párosodó nukleotidok észlelésének és javításának három szintje van.

Az első szint a már ismertetett 3’-5’ exonukleáz aktivitás, mely a polimerázokhoz kapcsolható.

A második szinten azok az enzimek találhatóak, melyek néhány másodpercen belül észreveszik a nem tökéletesen illeszkedő kettős szálat, és abból a feléből fognak nukleotidokat kivágni, amelyik a közelben tartalmaz egy nicket (szakadást) (eukariótákban még a vezető szálon is találhatók nickek, mivel több origóban kezdődött el a replikáció). Ilyenkor a nick és a hibás nukleotid közti rész leemésztődik, és a gap újra feltöltődik (12.9. ábra).


A harmadik szinten az a mechanizmus lép életbe, mely a replikáció után néhány perccel ismeri fel a hibás párosodást (mismatch). A szülői DNS-szál gyakran metilált egyes citozin és adenin bázisokon (a metiláció a bázispárosodást nem akadályozza). A replikáció során szintetizálódott új DNS-szál még nem metilálódott. Ennek alapján tudják a megfelelő enzimek kiválasztani a régi és az új szálat, és eldönteni, melyik a hibás nukleotid a nem párosodók közül.

Mutációk

Szinte csak felsorolásképpen érdemes megemlékezni néhány mutáció-típusról. A mutációkat fenotípusosan akkor láthatjuk, ha az valamely gén kódoló szakaszán vagy szabályozó régiójában történik. Az eukarióták genomját csak kb. 10%-ban alkotják a gének, és a génszakaszoknak is csak egy része íródik át fehérjévé, ezért a DNS hibajavítási mechanizmuson átcsúszott mutációk többsége semmiféle fenotípusos elváltozást nem okoz.

Pontmutációnak nevezzük azt, amikor egyetlen bázispár cserélődik ki másikra. Ez attól függően, hogy a megváltozott szekvencia más aminosavat kódol-e vagy ugyanazt az aminosavat, lehet miss-sense vagy same-sense mutáció. Ha olyan kodon keletkezik, amely nem kódol aninosavat, akkor non-sense mutációról beszélünk, ilyenkor STOP-kodon keletkezik.

Deléciónak nevezzük, ha egy vagy több nukleotidpár kiesik a szekvenciából, inzerciónak pedig azt, ha egy vagy több nukleotidpár beépül a szekvenciába. Ha a többlet, vagy hiányzó nukleotidpárok száma nem osztható hárommal, akkor úgynevezett kereteltolódás következik be; az átíródó polipeptidlánc szinte bizonyosan funkcióvesztett vagy súlyosan sérült lesz.

Mutációknak tekinthetők még a kromoszómatörések, illetve kromoszómafúziók; ezek szinte minden esetben súlyos genetikai rendellenességet, többnyire életképtelenséget okoznak.