Ugrás a tartalomhoz

Általános genetika

Deák Veronika (2014)

Typotex Kiadó

Több gén hatása ugyanarra a jellegre

Több gén hatása ugyanarra a jellegre

A gének nem magukban, hanem más génekkel együttműködve, azokkal kölcsönhatásban alakítják ki a fenotípust. Úgy is fogalmazhatunk, hogy az egyes jellegeket a legtöbbször nem egy, hanem több gén terméke alakítja ki. Ebből az következik, hogy a korábban megismert mendeli örökletesség a fenotípus szintjén sokszor módosul. Most olyan eseteket veszünk sorra, melyekben ugyanazt a jelleget befolyásoló géneket vizsgálunk dihibrid keresztezésekben. A fenotípus szintjén megfigyelhető módosult számarányok a génpárok közötti kölcsönhatás viszonyára utalhatnak. A kölcsönhatás típusának megállapítása nagyon hasznos információt szolgáltat. Egy jelleget érintő sok gén viszonyának szisztematikus feltárása elvezethet komplett biokémiai vagy genetikai útvonalak feltérképezéséhez.

Két gén hatása ugyanarra a jellegre független útvonalon

Egy példával A komplementáció című szakaszban már találkoztunk. Muslicában a szemszín egy jellegnek tekinthető. Több gént ismerünk, amely részt vesz e jelleg kialakításában, ilyenek a korábbiakban bemutatott white (w), scarlet (st) és brown (bw) gének. Ha a hivatkozott szakaszban ismertetett dihibrid keresztezést (P: stst bw+bw+ × st+st+ bwbw) megvizsgáljuk, és párhuzamba állítjuk a mendeli dihibrid keresztezésekkel, akkor a megfeleltethetőség nyilvánvaló. Függetlenül hasadó génpárról van szó, mert F2-ben megkapjuk az erre jellemző 9:3:3:1 fenotípusarányt. Mi a különbség a mendeli borsó kísérlettől? Az, hogy itt a két függetlenül öröklődő gén ugyanazt a fenotípus-jelleget (szemszín) érinti (szemben a borsószem színére és alakjára vonatkozó sárga–zöld/ráncos–sima jellegpárral), ezért abban az egy jellegben, a szemszínben tükröződik vissza mindkét gén allélösszetételének hatása.

A következő iskolapélda az ugyanarra a jellegre független útvonalon ható két génre a csirke tarajforma öröklődése. Hosszú múltra tekint vissza ez a terület, Bateson és Punnett már 1902-ben publikált a tarajforma öröklődés kapcsán két gén interakciójáról. Rózsa és borsó tarajú csirkék keresztezésekor az utódok egy új fenotípust, dió tarajat növesztettek (5.7. ábra). Az F1 inter se keresztezés utódai között 9:3:3:1 arányban jelent meg a dió:rózsa:borsó:egyszerű tarajforma.

Sematikusan:

P

RR pp

×

rr PP

rózsa

borsó

F1

Rr Pp

dió

F2

9

R– P–

dió

3

rr P–

borsó

3

R– pp

rózsa

1

rr pp

egyszerű

A gének jelölésének eredete: R rose, rózsa; P pea, borsó.

A háttérben álló molekuláris mechanizmusról sokáig nem tudtak semmit. Egy néhány éve megjelent publikáció számol be arról, hogy a borsó tarajformát egy fejlődéstanilag fontos gén (a SOX5 transzkripciós faktor gén) intronjában bekövetkező duplikáció okozza. Ez egy olyan domináns mutáció, mely a gén kifejeződésének szabályozását változtatja meg (ektópikus expressziót okoz). A SOX5 gén megfelel a fenti példában szereplő P génnek, domináns mutáns allélja a P-nek, recesszív vad allélja a p-nek. A cikk megtalálható a http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1000512 webhelyen.

5.7. ábra - Csirke tarajformák

Csirke tarajformák

A házi tyúk őse, az ázsiai esőerdőkben honos bankivatyúk (Gallus gallus) egyszerű tarajjal rendelkezik. A SOX5 mutáció minden bizonnyal a háziasítás kezdetén jöhetett létre, mert a borsó taraj elterjedtnek számít a tenyésztett fajtáknál világszerte. A kutatók ezt előnyös spontán mutációnak gondolják, mert a borsó tarajforma hidegebb éghajlatokon előnyösebb az egyszerű tarajjal szemben, a kisebb hűtési felület miatt. A rózsa tarajformát szintén egy, a vad típussal szemben domináns allél okozhatja. Emberben húsz SOX gént ismerünk. Ezek számos fejlődésbiológiai folyamat (ivarmeghatározás, neuronális fejlődés, sejtdifferenciáció) irányításában vesznek részt. A kutatók úgy vélik, hogy néhány SOX gén alkalmas lehet a gyermekkori agytumor kialakulásának korai diagnosztizálására, ezért ez intenzív kutatási terület napjainkban. A modellszervezeteken végzett génazonosítás és funkcionális jellemzés jelentőségét ez a példa is bizonyítja.

Komplementer öröklésmenet

Két fehér virágú borsó törzs keresztezésének utódai lehetnek bíbor virágúak, ami komplementációra utal. F2-ben 9:7 arányban kapunk bíbor:fehér virágú növényeket. Ez módosult dihibrid F2 számarány: a 7 a 3:3:1 genotípusok egymással megegyező fenotípusából adódik. A virágszín csak akkor bíbor, ha a genotípusban mindkét szóban forgó génnek legalább egy domináns allélja jelen van. Egyszerű jelölésekkel levezetve:

P

AA bb

×

aa BB

fehér

fehér

F1

Aa Bb

komplementáció

bíbor (vad)

F2

9

A– B–

bíbor

komplementáció

3

aa B–

fehér

3

A– bb

fehér

1

aa bb

fehér

A genotípusok szintjén tehát nem, csak a fenotípus szintjén érvényesül a módosult számarány.

A komplementer génhatás jelenség magyarázata az, hogy egy festék termeléséért két enzimre van szükség, és azok lineáris sorban egymás után fejtik ki hatásukat. Csak akkor keletkezik festék, ha mindkét enzim jelen van. Az A enzim hiánya is (aa funkcióvesztéses allélpár), akár a B enzim hiánya is (bb funkcióvesztéses allélpár), s mindkettő hiánya is (aa bb genotípus) megakadályozza a pigmentképződést, fehér virágszínt okoz (5.8. ábra).

5.8. ábra - Komplementer génhatás egy reakciósor két tagjánál

Komplementer génhatás egy reakciósor két tagjánál

Duplikált gének öröklésmenete

Nem ritka, hogy egy biokémiai lépést két vagy több gén terméke is képes végrehajtani. Az ilyen géneket redundáns géneknek nevezzük. Redundáns gének génduplikációval keletkeznek. A duplikált gének az evolúciós folyamatok kiváló nyersanyagai, mivel az egyik géntaggal „az evolúció szabadon bánhat”, ami új, az élőlény számára előnyös funkció kialakulásához is vezethet.

A megegyező funkciójú redundáns gének bármelyikének terméke elegendő a fenotípus kialakításához, például egy pigment termelődéséhez (5.9. ábra). Minden genotípus, amelyben A vagy B gén domináns allélja előfordul, színes fenotípusú, és csak a aa bb genotípusban nem termelődik aktív enzim, ezért nem keletkezik festékanyag. A fenotípus szintjén módosult F2 dihibrid számarány 15:1.

P

AA bb

×

aa BB

színes

színes

F1

Aa Bb

színes

F2

9

A– B–

színes

3

aa B–

színes

3

A– bb

színes

1

aa bb

fehér

5.9. ábra - A redundáns gének termékei azonos funkcióval rendelkeznek

A redundáns gének termékei azonos funkcióval rendelkeznek

Recesszív episztázis

Az episztázis jelentése: felette álló. A genetikában gének egymás feletti hatására használt kifejezés. Az egymás felett állás természetesen nem fizikai értelemben, hanem génfunkcióban értendő. Gyakorlatias megfogalmazásban: az A gén episztatikus B gén felett, ha a B gén allélösszetételétől függetlenül az A gén allélkombinációjának megfelelő fenotípus érvényesül. Úgy is mondhatjuk, hogy az episztatikus gén bizonyos allélösszetétele meggátolja egy másik gén fenotípusos kifejeződését. Az előző mondatban a „bizonyos allélösszetétel” arra utal, hogy megkülönböztetünk recesszív episztázist (ha az episztatikus gén recesszív allélja fejt ki episztatikus hatást) és domináns episztázist (ha az episztatikus gén domináns allélja fejt ki episztatikus hatást).

Nézzünk egy példát recesszív episztázisra!

Az emlősök szőrszínével korábban már foglalkoztunk. A C gén allélsora példát mutatott a többszörös allélizmusra, az A aguti gén AY allélja pedig a letális allélra). Most egy harmadik gént is bemutatunk: ez a brown (B) gén, melynek domináns allélja fekete pigment, recesszív allélja pedig barna pigment termelődéséhez vezet.

B gén alléljai:

B–

fekete

bb

barna

C gén alléljai:

C

intenzív szín

cch

csincsilla

ch

himalája

cc

albínó

A C és B bundaszín gének recesszív episztázisa:

P

CC bb

×

cc BB

barna

albínó

F1

Cc Bb

(komplementáció, mert barna és albínó nem allélikusak)

fekete

F2

9

C– B

fekete

3

cc B–

albínó

3

C– bb

barna

1

cc bb

albínó

(A fenti eset a többi szőrszín gén meghatározott genotípusa mellett érvényesül).

A recesszív episztázisra a 9:3:4 módosult F2 fenotípusos számarány jellemző. Ez úgy jön létre, hogy az egyik „3” és az „1” genotípusok fenotípusa megegyezik, jelen esetben albínó. A „4” arányban megjelenő fenotípus oka az, hogy ha az egyik gén recesszív homozigóta formában van jelen (itt cc), akkor a fenotípus a másik gén alléljaitól függetlenül (B– vagy bb) ugyanaz (itt albínó). A biokémiai hátteret szemlélteti az 5.10. ábra:

5.10. ábra - Recesszív episztázis egy reakciósor tagjai között

Recesszív episztázis egy reakciósor tagjai között

C gén recesszív allélja episztatikus B gén felett, ezért recesszív episztázisról beszélünk. B géntermék hatása szubsztrát hiányában nem érvényesül.

Domináns episztázis

A domináns episztázisban két gén között olyan episztatikus viszony áll fenn, melyben az episztatikus gén domináns allélja akadályozza meg a másik gén alléljainak fenotípusos kifejeződését.

Példaként a gyűszűvirág (Digitalis purpurea) pártaszínének alakulását tekintjük át.

Az egyik gén a D gén, melynek domináns allélja sötét lila, recesszív allélja homozigóta formában (dd) világos lila virágszínt eredményez.

Egy másik gén, a W gén, befolyásolja a képződött pigment lerakódását:

  • W domináns allélja megakadályozza a pigmentlerakódást, kivéve a virágtorokban, így a párta fehér

  • w allél nem gátolja a pigment lerakódását (így a D gén genotípusának megfelelő színű a virág).

Ebben a példában a W gén domináns W allélja episztatikus D gén felett. A D gén alléljainak hatása csak ww genotípus mellett érvényesül (5.11. ábra). A két génre nézve dihibrid önmegtermékenyítésekor az utódokban a domináns episztázisra utaló 12:3:1 számarányt kapjuk:

Ww Dd

inter se

9

W– D–

fehér

3

ww D–

sötétlila

3

W– dd

fehér

1

ww dd

világoslila

5.11. ábra - W allél domináns episztázisa D gén felett

W allél domináns episztázisa D gén felett

5.11. ábra:

Egy biokémiai útvonal genetikai analízise

Egy tudománytörténeti szempontból is nagy jelentőségű kísérletsor bemutatásával szemléltetjük a genetikai és biokémiai analízis ötvözésének erejét. Biokémiai útvonalon olyan több lépésből álló reakciósort értünk, melynek egyes lépéseit különböző gének termékei (különböző enzimek) katalizálják.

A példánkban szereplő kísérletsort George Wells Beadle és Edward Lawrie Tatum végezte még az 1940-es években. Ebben az időszakban még ismeretlen volt a gének mint a tulajdonságok átörökítéséért felelős faktorok molekuláris természete. A két kutató a gének és fehérjék közötti kapcsolat felderítését tűzte ki célul. Ha van direkt kapcsolat a gének és az enzimek között, akkor lehet olyan mutánsokat (öröklődő változásokat hordozó, tehát génjükben megváltozott) izolálni, amelyek specifikus enzimreakciókban hibásak. Eredményeik alapján ez a feltevésük be is igazolódott. Megalkották az ún. egy gén – egy enzim hipotézist. Munkájukért 1958-ban Nobel-díjat kaptak.

A kérdés tanulmányozására a Neurospora crassa mikroszkopikus gombát választották. Előnyös választás volt ez a modellszervezet, mert kis helyen, egyszerű eszközökkel nagy számban fenntartható, és aszexuális és szexuális szaporodási ciklusa is van. Aszexuálisan a haploid hifák által termelt spórákkal (vagy mikrokonídiumokkal) szaporodik. Szexuális ciklusában két párosodási típus hifái kétmagvú (dikarióta) hifává egyesülnek, s ezt magfúzió (kariogámia) követi. A sejtmagok fúziójából kialakulnak a diploid magok. Ezekből a sejtekből alakulnak ki az aszkuszok (tömlők). Az aszkusz olyan zsákszerű képződmény, melyben nyolc haploid aszkospóra jön létre. Az aszkospórák a kiindulási diploid sejt egy meiotikus osztódásával, majd azt követő egy mitotikus osztódásával keletkeznek. A faj jellemzője, hogy az aszkuszban a spórák nem keverednek, lineáris sorrendben helyezkednek el, mely elrendeződés tükrözi a megelőző osztódások és rekombinációs események térbeli viszonyait. Ennek Beadle és Tatum munkájában nincs jelentősége, de a térképezéssel és rekombinációval kapcsolatos vizsgálatoknál a szabályos elrendeződés meghatározó jelentőségű volt (erre itt nem térünk ki).

A kísérlet célja nagyszámú arginin auxotróf (arginin aminosavat előállítani nem képes) mutáns izolálása és jellemzése, ami elvezetett az arginin bioszintézis lépéseinek feltárásához. A mutánsok képződését röntgen mutagenezissel indukálták, ami megemelte a spontán mutációs rátát (lásd a Mutációk című fejezetet). Körülbelül 80000 darab röntgensugárzásnak alávetett mikrokonídiumot teszteltek a továbbiakban. Azért volt szükség ilyen nagy számú egyed átvizsgálására, mert a mutációképződés esélye még indukált esetben is kicsi. Ha keletkezik is mutáció egy mikrokonídiumban, akkor az a genom bármelyik részét érintheti, s az csekély valószínűségű, hogy a mutáció éppen az arginin bioszintézisben részt vevő valamely génben következzen be.

Több lépésben keresték a besugárzott mikrokonídiumok között az arginin auxotróf mutánsokat. Első lépésben kiválogatták az auxotrófokat: ezek azok a mikrokonídiumok, melyek csak komplett (a növekedéshez szükséges minden szerves és szervetlen vegyületet tartalmazó) táptalajon nőnek, minimál (csak alapvető szervetlen forrásokat tartalmazó) táptalajon nem (5.12. ábra).

5.12. ábra - Auxotrófok kiválogatása

Auxotrófok kiválogatása

Az auxotrófokat tovább szűrték: arra a csoportra volt szükségük, melyek az összes aminosavval kiegészített minimál táptalajon növekedni tudtak, mert ezek mindegyike valamelyik aminosav előállításában hibás (5.13. ábra).

5.13. ábra - Aminosav auxotrófok kiválogatása

Aminosav auxotrófok kiválogatása

Végül már csak az aminosav auxotrófokat kellett egyenként tesztelni arra, hogy közülük melyik arginin auxotróf, vagyis melyik képes kizárólag argininnel kiegészített tápközegben növekedni (5.14. ábra).

5.14. ábra - Arginin auxotrófok kiválogatása

Arginin auxotrófok kiválogatása

Miután találtak néhány arginin auxotrófot, két alapvető genetikai teszt elvégzése következett, melyek semmilyen klasszikus genetikai analízisből nem hagyhatók ki. Ezek célja:

  • igazolni, hogy az adott vonalban csak egy mutáció van jelen

Csakis olyan mutánssal érdemes dolgozni, melyben az adott fenotípus egyetlen mutációnak a következménye. A „kikeresztezést” (outcrossing) általában alkalmazzák indukált mutagenezissel induló mutánspark előállításakor. Ez azt jelenti, hogy ha kezünkben van az „érdekes” fenotípusú mutáns, akkor néhány generáción keresztül a vad típussal keresztezzük, minden generációban az „érdekes” fenotípusú egyedekkel megyünk tovább. Ezzel elérhető, hogy az „érdekes” fenotípust okozó mutáción kívül a genomból eltűnjenek az indukált mutagenezis során esetlegesen létrejött más mutációk. Neurospora crassa esetében a mutáns és a vad vonal párosításából származó utódok 1:1 arányú hasadása igazolja, hogy a mutánsban egy gént érint a mutáció (5.15. ábra).

5.15. ábra - Az 1:1 arányú hasadás igazolja, hogy egyetlen gén mutációja okozza az arginin auxotrófiát

Az 1:1 arányú hasadás igazolja, hogy egyetlen gén mutációja okozza az arginin auxotrófiát

  • a mutánsokat (pontosabban az általuk hordozott mutációkat) komplementációs csoportokba sorolni

A kopmlementációs csoportba sorolás célja annak megállapítása, hogy az izolált, azonos fenotípusú (itt arginin auxotróf) mutánsok közül melyek azok, amelyek ugyanabban a génben hordoznak mutációt, azaz allélikusak, és melyek azok, melyek különböző gének mutációi hatására lettek arginin auxotrófok. A komplementációs analízissel végeredményben azt állapítjuk meg, hogy a kezünkben lévő mutánsok által hány darab, az adott fenotípust befolyásoló gént azonosítottunk. Leegyszerűsítve, az egymást komplementáló mutációk különböző géneket érintenek, más kifejezéssel: különböző komplementációs csoportba tartoznak. Ha két mutáció esetén a komplementáció elmarad, akkor azok ugyanazt a gént érintik, azaz egy komplementációs csoportba tartoznak. Egy genetikai analízis során minél több komplementációs csoport, azaz a folyamatot érintő minél több gén azonosítása kívánatos, mert így tárható fel minél részletesebben a folyamat genetikai-biokémiai háttere. Páronként keresztezve példánkban az arginin auxotrófokat, az alábbi séma szerint végezhető el a komplementációs analízis (5.16. ábra):

5.16. ábra - Az arginin auxotrófok komplementációs csoportokba sorolásának kísérleti vázlata

Az arginin auxotrófok komplementációs csoportokba sorolásának kísérleti vázlata

Beadle és Tatum három olyan mutánst találtak, melyek különböző komplementációs csoportba tartoztak. A három komplementációs csoport egy-egy tagja által tehát három arginin bioszintézisben részt vevő gént sikerült „fülön csípni”. (Ezek az arg-1, arg-2, arg-3 gének, a mutánsokat jelöljük arg-1-, arg-2-, arg-3- jelöléssel, utalva arra, hogy három különböző génben hibásak.)

A mutánsok izolálása és jellemzése után következhetett a biokémiai munka. Az argininen kívül annak rokonvegyületeire nézve is tesztelték, hogy a három arginin auxotróf mutáns vajon menekíthető-e az argininen kívül más, hasonló szerkezetű vegyülettel is, például ornitinnal vagy citrullinnal (5.17. ábra).

5.17. ábra - Az arginin és két rokonvegyület, az ornitin és citrullin szerkezeti képlete

Az arginin és két rokonvegyület, az ornitin és citrullin szerkezeti képlete

A menekítési kísérlet eredményeit foglalja össze az 5.3. táblázat.

5.3. táblázat - A menekítési kísérlet eredményeinek összefoglalása (+ van növekedés, - nincs növekedés)

 

ornitin

citrullin

arginin

arg-1-

+++

arg-2

-++

arg-3

--+

Ez a menekítési mintázat egy bioszintézis útvonalra utal. Egy adott mutáns csak annak a vegyületnek a bioszintézisére képtelen, mely a prekurzorok sorában először képes minimál táptalajon a mutánst menekíteni. A bioszintézis útvonal elemeit az 5.18. ábrán látjuk sorbarendezve.

5.18. ábra - Az arginin bioszintézis útvonal elemeinek sorbarendezése

Az arginin bioszintézis útvonal elemeinek sorbarendezése

A bioszintetikus út minden egyes lépését egy-egy specifikus enzim végzi. Minden enzimet külön-külön egy-egy gén határoz meg. A modell az egy gén – egy enzim hipotézis néven vonult be a tudományág szóhasználatába. Más kutatók más rendszerekkel hasonló eredményeket kaptak. Az arginin bioszintetikus út helyességét is részletekbe menően igazolták, s a működésképtelen enzimeket is kimutatták.

A bemutatott kísérleti séma általánosan alkalmazható bioszintetikus utak felderítésére.

Egy genetikai útvonal episztázis analízise

Genetikai útvonalaknak tekintjük azokat a sejten belüli és sejtek közötti jeltovábbító rendszereket, melyek gének működésének megváltoztatását eredményezik. A biokémiai szintézis útvonalakhoz hasonlóan a jelátviteli rendszerek több elemből állnak, és az elemek szekvenciálisan működnek. (A valóságban ennél komplexebb a működésük a különféle visszacsatolási hurkok és a különféle jelátviteli útvonalak közötti kereszthatások miatt.) A genetikai útvonal elemei olyan jeltovábbító fehérjék, melyek a következő elem aktivitását befolyásolják annak függvényében, hogy ők maguk aktív vagy inaktív állapotban vannak-e. Ezt pedig az előző elem aktivitása határozza meg, és így tovább. Az útvonal utolsó tagja meghatározott gén vagy gének kifejeződését befolyásoló szabályozó fehérje (transzkripciós faktor, lásd a génkifejeződésről szóló fejezeteket). A génszabályozás célirányos megváltoztatásával érhető el egy szignál által kiváltott sejtválasz (például ilyen szignál a sejtet érő növekedési faktor, melynek hatására a sejt osztódik).

Ahhoz, hogy megértsük, hogyan lehet azonosítani egy genetikai útvonal elemeit, és hogyan lehet felderíteni a klasszikus genetika eszköztárával az elemek közötti gátlási-aktiválási viszonyokat, a Caenorhabditis elegans modellszervezetet vesszük példának.

A Caenorhabditis elegans modellszervezet bemutatása

A C. elegans körülbelül egy milliméter hosszú, a talajban élő fonálféreg. Minden szárazföldön elterjedt. Laboratóriumi fenntartásuk agar lemezen történik, a lemezre oltott E. coli baktériumokkal táplálkoznak. Óriási előny, hogy -80 °C-on is tárolhatók a törzsek. Hermafrodita alakjai (XX ivari kromoszómákkal) és hím (X0, vagyis egy X ivari kromoszómával rendelkező) alakjai vannak. A hímek csak 0,1–0,2 %-ban jelennek meg a természetes populációkban (ivari kromoszóma nondiszjunkció következtében). A kromoszómák szétválását érintő bizonyos mutáns törzseiben körülbelül 30% a hímek aránya. Ezek a törzsek szükségesek a genetikai munkában alkalmazott keresztmegtermékenyítéshez. A hermafroditák petéket raknak, ezekből lárva bújik ki. A lárva növekszik, többször vedlik, míg kifejlett állattá (adult) válik. A C. elegans esetében a szokásos laboratóriumi feltételek között egy életciklus mindössze körülbelül három napig tart, ami rövidnek számít, és igen előnyös a rajta végzett kísérletes munka szempontjából.

A kifejlett állat élettartama rövid, ezért viszonylag könnyű megnövekedett, illetve csökkent élethosszú (ún. age) mutánsokat izolálni. Emiatt az öregedéskutatás területén kedvelt modell. A kifejlett egyedek morfológiája nagyon leegyszerűsített. A hermafroditák testüregének nagy részét a gonádok teszik ki. Az ivarnyílást (vulva) a két gonádkarral az uterusz kapcsolja össze. A gonádok teljes hosszuk felénél visszahajlanak, disztális (az uterusztól távoli) és proximális (az uteruszhoz közeli) kart alkotnak. A proximális karokon az uterusz fele haladva petevezetéket és spermatékát találunk. A gonádok petesejteket és spermiumot egyaránt termelnek. A petevezetéket az uterusz felé növekvő méretű petesejtek töltik ki. A spermatékában tárolt spermiumok által történik a hermafroditák önmegtermékenyítése. Ha hermafrodita egyedet hímmel pároztatnak, akkor a hím spermiumai abszolút előnyt élveznek a hermafrodita saját spermiumaival szemben.

A felnőtt egyed testében csak nemosztódó sejtek vannak: hermafroditáknál 939 darab, hímeknél 1031 darab. A sejtek leszármazási sorsa invariáns, azaz szigorúan determinált, hogy melyik sejtből milyen szövetféleség lesz. Ezek a sejtvonalak teljes pontossággal reprodukálódnak. A sejtek leszármazása az alábbi technikákkal vizsgálható:

  • az embriót kiveszik az uterusból, blasztomerjeit megjelölik (riportergénnel, fluoreszcens jelöléssel), osztódások során az utódsejtek is jelölődnek

  • lézeres sejtléziókat hoznak létre az embrióban, és vizsgálják, mi történik hatására, mi nem fejlődik ki

  • Nomarski mikroszkópiával

Az egyedfejlődés során bizonyos sejtek (105 darab) egyértelmű sorsa, hogy programozott módon elhalnak. Emiatt a C. elegans a programozott sejthalál (apoptózis, jelentése lombhullás) kutatás kiváló modellje.

A C. elegans genomszekvenciája volt az első megismert szövetes eukarióta genomszekvencia (1998-ban határozták meg). A genom 97 Mbp méretű és 19000 gént tartalmaz. Egy génre átlagosan 5 kbp DNS esik. Az emberi gének körülbelül 70%-a rendelkezik C. elegans ortológgal. Genomjában a redundáns gének száma alacsony.

A közelmúltban három Nobel-díjat is kiérdemeltek az e modellszervezettel végzett kutatások:

  • 2002 (orvosi)

    Sydney Brenner – a féreggel végzett úttörő munkájáért

    John Sulston – a sejtleszármazások feltérképezéséért

    Robert Horvitz – a programozott sejthalál vizsgálatáért

    2006 (orvosi)

    Andrew Fire és Craig Mello – az RNS interferencia felfedezéséért (lásd az eukarióta génkifejeződés szabályozásáról szóló fejezetet)

  • 2008 (kémiai)

    Osamu Shimomura, Martin Chalfie és Roger Y. Tsien – a GFP (green fluorescent protein, zöld fluoreszcens protein) felfedezéséért és genetikai markerként való alkalmazásáért a féregben

A vulva (a hermafroditák ivarnyílása)

A genetikai útvonal, melynek analízisét bemutatjuk, a hermafrodita egyedek ivarnyílásának (vulvájának) fejlődését szabályozza. Normálisan egy vulva található a kifejlett féreg hasi oldalán, s kétféle, a vulvafejlődésben hibás mutánstípus bizonyult izolálhatónak (5.19. ábra):

  • vulvaless (Vul fenotípus) – vulva nélküli (az ivarnyílás hiánya miatt a hermafrodita nem tud lepetézni, a lárvák a testen belül fejlődnek ki, ami az anya pusztulásához vezet)

  • multivulva (Muv fenotípus) – egynél több vulvaszerű képződmény fejlődik a hasi oldalon

5.19. ábra - C. elegans vulvaless, vad típusú és multivulva egyedei (fentről le)

C. elegans vulvaless, vad típusú és multivulva egyedei (fentről le)

A vulva néhány sejtből kialakított csőszerű képződmény, mely az uteruszt köti össze a külvilággal. Kialakulása az L3 lárvastádiumban zajlik. Bizonyos sejtek (ún. vulva prekurzor sejtek) a környező sejtektől érkező molekuláris jelek hatására meghatározott sejtsorsot vesznek fel (ezt 1°, 2°, 3° jelölik), ami azt jelenti, hogy a jelnek megfelelő módon differenciálódnak. Normál esetben meghatározott sejtek veszik fel ezeket a sejtsorsokat. A szerv kialakulása, leegyszerűsítetten szólva, az adott sejtek meghatározott számú osztódásával történik (5.20. ábra).

5.20. ábra - A C. elegans vulvájának kialakulása

A C. elegans vulvájának kialakulása

A vulva egyszerű szerv, de a kialakulásában több jelátviteli útvonal játszik közre. Ha a jeltovábbító rendszerek valamely eleme(i) hibás(ak), akkor a sejtek nem a megfelelő módon differenciálódnak. E hibák következménye lehet, hogy egyáltalán nem fejlődik vulva, vagy az, hogy egynél több vulva fejlődik.

A továbbiakban bemutatjuk a genetikai analízis menetét lépésről lépésre.

Vulvafejlődésben érintett mutánsok izolálása, s azt követő komplementációs analízis

Tegyük fel, hogy izolálunk 10 vulva nélküli és 10 multivulva mutánst. Ezek a vonalak alkotják a kiindulási mutánsparkot. Mint azt már korábban többször láttuk, első lépésként a mutánspark tagjait komplementációs csoportokba kell sorolni. Ehhez páronként keresztezzük az azonos fenotípust mutató vonalak egyedeit. Az egymást nem komplementáló vonalakban egyazon gén tartalmazza a fenotípust kialakító mutációt (azonos komplementációs csoportba tartoznak). Az egymást komplementáló vonalak tagjaiban különböző gének mutációja vezet ugyanazon fenotípus kialakulásához. Az alábbi példában konkrét kísérleti eredményeket mutatunk be. A komplementációs analízis eredményeként a vulvaless mutánsok két, a multivulva mutánsok pedig három komplementációs csoportba sorolhatók. Ez azt jelenti, hogy öt vulvafejlődésben részt vevő gén érintett a mutánsok által. Minden komplementációs csoportból kiválasztottak egy képviselőt a további analízishez, ezek:

  • Vul (vulvaless) mutánsok: lin-45, let-23

  • Muv (multivulva) mutánsok: lin-1, let-60, lin-15

(a fenti jelölések a törzseket jelentik, a megfelelő géneket hasonlóképpen, de dőlt betűvel írjuk, a vad allél +, a mutáns allél - jelzést kap)

A kettős mutánsok fenotípusának megállapítása

A fenti öt gén termékéről tehát tudjuk, hogy mutációjuk milyen fenotípushoz vezet. Az episztatikus viszonyok megállapításához ismerni kell a kettős mutánsok fenotípusát. Ennek megállapítása az alábbiak szerint történik a lin-45 és a lin-1 példáján (5.21. ábra):

5.21. ábra - Kettős mutánsok fenotípusának megállapítása

Kettős mutánsok fenotípusának megállapítása

A két csoport tagjaival minden páros kombinációban el kell végezni a fenti séma szerinti kettős mutáns fenotípus-analízist. Az eredményeket az 5.4 táblázat foglalja össze.

5.4. táblázat - A kettős mutánsok fenotípusának összefoglalása

lin-1 Muv

let-60 Muv

lin-15 Muv

lin-45 Vul

Muv

Vul

Vul

let-23 Vul

Muv

Muv

Vul


Az episztatikus viszonyok megállapítása

Az 5.4. táblázatba foglalt eredmények szerint a kettős mutáns fenotípusok valamely egyes mutáns fenotípusával egyeznek meg. Páronként vizsgálva a géneket, az a gén episztatikus a másik gén felett, amelynek mutáns fenotípusával megegyezik a kettős mutáns fenotípusa.

Például:

lin-45-/lin-45-

egyes mutáns Vul

lin-1-/lin-1-

egyes mutáns Muv

lin-45-/lin-45- ; lin-1-/lin-1-

kettős mutáns Muv

A fentiekből az következik, hogy a lin-1 gén episztatikus a lin-45 gén felett, mert lin-1-/lin-1- genotípus (a lin-45 gén allélösszetételétől függetlenül) ugyanazon (Muv) fenotípus kialakulásához vezet.

A genetikai útvonalaknál az episztatikus viszonyokat másképp értelmezzük, mint ahogyan egy biokémiai reakciósor esetén láttuk (lásd a fejezet előző szakaszában). Genetikai útvonalaknál a downstream elem episztatikus az upstream elemhez képest. A downstream irányon a folyamatsor végéhez mutató irányt értjük, a legutolsó (the most downstream) elem a gének kifejeződését befolyásoló transzkripciós faktor. Ha például a transzkripciós faktor mutáns, akkor ahhoz kapcsolódik egy bizonyos fenotípus. Ha a transzkripciós faktor mutációján kívül egy – a folyamatsorban előbb lévő, more upstream – elem is hibás (kettős mutáns), akkor is a transzkripciós faktor mutációjának megfelelő fenotípus jelenik meg, vagyis a downstream elem episztatikus az upstream elem felett. Ez a logika a jelátviteli útvonal bármely két tagjára alkalmazható, és ennek alapján az elemek sorrendje meghatározható (5.22. ábra).

5.22. ábra - Egy jelátviteli útvonal elemeinek sorbarendezése a mutáns fenotípusok alapján

Egy jelátviteli útvonal elemeinek sorbarendezése a mutáns fenotípusok alapján

Az elemek közötti aktiválási és gátlási viszonyok megállapítása

Miután a szignáltól (upstream) a génkifejeződésig (downstream) sorba rendeztük a jelátviteli útvonal elemeit, az elemek közötti aktiválási, illetve gátlási viszonyokat is megállapíthatjuk. Ehhez célszerű a „the most downstream” elemtől „felfele” haladni, és az elem mutáns fenotípusából következtetni annak normális funkciójára. Példánkhoz az 5.23. ábra nyújt magyarázatot.

5.23. ábra - A jelátviteli útvonal elemek közötti aktiválási és gátlási viszonyok megállapítása

A jelátviteli útvonal elemek közötti aktiválási és gátlási viszonyok megállapítása

Végül hangsúlyozzuk, hogy a vulvafejlődés példáján azonosított jelátviteli útvonal elemei konzervált, sejtosztódást szabályozó útvonal elemeinek (a Ras-Raf-MAPK) felelnek meg. A lin-3 gén terméke az anchor sejt által kibocsátott epidermális növekedési faktor, ez az a jel, melyet a növekedési faktor receptor (példánkban a let-23 gén terméke) érzékel, és továbbít a sejtbe. A let-60 kódolja a Ras, a lin-45 pedig a Raf fehérjéket, melyek a jelátvitel fontos citoplazmatikus komponensei. A „the most downstream” elem, a lin-1 gén terméke, transzkripciós faktor, melynek aktivitása vagy inaktivitása meghatározza a sejtsorsot, ebben az esetben azt, hogy a sejt osztódjon-e vagy sem (5.24. ábra). Rákos sejtekben gyakori a tárgyalt jelátviteli útvonal elemeinek abnormális működése.

5.24. ábra - A vulvafejlődést konzervált jelátviteli útvonal szabályozza

A vulvafejlődést konzervált jelátviteli útvonal szabályozza