Ugrás a tartalomhoz

Biokatalízis, biokonverziók, biotranszformációk

Rákhely Gábor (2012)

Szegedi Tudományegyetem

DNS direkt, vektor nélküli bevitele sejtekbe

DNS direkt, vektor nélküli bevitele sejtekbe

A DNS direkt bejutása a sejtbe azt jelenti, hogy a meztelen DNS biológiai közreműködés nélkül, pusztán fizikai-kémiai-biokémiai alapon jut be a sejtbe valamilyen valószínűséggel. A géntechnikus ezt a valószínűséget igyekszik megnövelni az erre a célra kidolgozott és alkalmazott géntechnikákkal, receptekkel. A transzformációval történő DNS bejuttatás célja mind klónozás, mind expresszió lehet.

Baktériumok transzformációja plazmid DNS-sel Baktériumok DNS-sel való transzformációja a természetből is jól ismert folyamat. Holt sejtekből kiszabadult lineáris kromoszómatöredékeken lévő gének is képesek a közegből (vér, szennyvíziszap, gyümölcslevek, stb.) baktériumok belsejébe kerülni, ott rekombinálódni a kromoszómával és kifejeződni. A kompetens baktériumok tehát spontán is felvehetik a DNS-t megfelelő körülmények között. A géntechnikus viszont képes ennek a ritka folyamatnak a valószínűségét megnövelni a folyamat részleteinek optimálása útján. A kompetens baktérium olyan fiziológiai állapotban van, hogy a külső térből való DNS felvétele maximális. Ilyen fiziológiai állapotba úgy kerülhet, hogy a szaporítás megfelelő szakaszába hozzuk és olyan pufferoldatban szuszpedáljuk, ami a DNS sejtbe lépését elősegíti. A DNS alakja, mérete, koncentrációja a közegben szintén jelentős faktor. A klónozás során mindig plazmid DNS-sel transzformálunk, arra kapcsoltuk a klónozandó DNS-t. A plazmid a sejtben önreplikációra képest, ez a klónozás sikerét jelenti. A bejutás sikerét a plazmid azzal növeli, hogy kisméretű, kompakt molekuláról van szó, mely viszonylag védett a roncsolódással, töredezéssel szemben. A mebránon való átjutást zárt gyűrű vagy szuperhélikális formája is segíti a lineáris DNS-sel összehasonlítva. Meg kell itt jegyeznünk, hogy a r DNS technikákban alkalmazott a természetes plazmidok nagy részével ellentétben olyan mutánsok, melyekből kiírtották a sejtből sejtbe átkerülésért, a mozgékonyságért felelős géneket. Ennek biztonsági okai vannak: annak megelőzésére szolgálnak, hogy a bélbe bekerülve ne tudjanak egy másik bélbaktériumba átkerülni és elterjedni a bélmikroflórában. A DNS sejtbe kerülését nagyban befolyásolja a közeg összetétele. Mandel és Higa (1970) megfigyelték, hogy kalcium (Ca) jelenlétében sokszorosára növekszik az E. coli DNS felvétele. Az elérhető hatásfok kezdetben 105-107 transzformáns/ug plazmid volt, további optimálással ezt az értéket 107-108-ra lehetett felvinni. A hatásfok értékelésénél vegyük figyelembe, hogy a sejteknek csak egy kis része valóban kompetens, még optimális szaporodási szakaszt tekintve is, és hogy a közegben oldott plazmid DNS-ek közül mindössze minden 10 000-dik kerül be sejtbe. A kalcium hidakat képez a sejt felületének makromolekulái és a DNS között. A sejt felületére kötött DNS molekulák bejutásának nagyobb a valószínűsége, mint a közegben oldott és statisztikus eloszlást mutató molekuláké. A membránon való átjutást a membrán adekvát módon történő fellazítása, fluiditásának megnövelése segíti. A membránt felépítő lipidek szénhidrogénláncait a hőérséklet emelésével lehet fluiddá, folyóssá és emiatt átengedőbbé tenni. A hősokk néhány percig tartó hőfokemelés jelent, az optimális 30 oC-róló 42-43oC-ra. Ekkor a sejt felületére tapadt plazmidok hőmozgásuk és a megfolyt membrán miatt nagyobb valószínűséggel lépik át a membránt és kerülnek a sejt belsejébe. A plazmid transzformációval történő baktériumba juttatását a laborgyakorlatok leírását tartalmazó mappában találhatjuk. ftp://intranet.ch.bme.hu/oktatas/konyvek/mezgaz/dnsklon/laborgyak/trafo Sejtfúzióval összekötött DNS bevitel, azaz transzformáció akkor valósul meg, ha baktériumokat DNS jelenlétében fúzionáltatják. A baktériumokat fúzió előtt protoplasztokká alakítják,azaz sejtfalbontó enzimmel, pl. lizozimmel leemésztik a sejtfalat. A sejtfúzió elősegítéséhez polietilén-glikol (PEG) adagolnak a közeghez, melyben a sejtek protoplasztjai szuszpendálva vannak. Ha sejtek fúziója, vagyis membránjaik összeolvadása a transzformálandó DNS oldatában történik, akkor akkor a fúziós termékek magukba zárnak valamennyit a közegből és a benne oldott DNS-ből.

Az élesztő szferoplasztjai, vagyis a cellulóz sejtfaltól megszabadított sejtjei is képesek felvenni a hozzáadott DNS-t. CaCl2 és polietiléglikol (PEG) javítják a folyamat hatékonyságát, a polietilén-glikol átjárhatóvá teszi a sejtmembránt, ezzel elősegíti a DNS bejutását. Az élesztősejtbe mind élesztőplazmid, mind E. coli plazmidok bevihetőek transzformációval. E. coliban működő plazmidok transzformálhatóak élesztőgombába és ott önreplikációra is képesek, ha ráültetik az élesztőben felismerhető origót. Ilyen ingázó plazmidok, melyek mind az E. coli, mind az élesztő replikációs origóját tartalmazzák, alkalmasak arra, hogy a klónozás E. coliban, ebben a nagyon jól jól ismert gazdasejtben történő előkészítése és ellenőrzése mellett az expressziót élesztőben oldják meg. Az élesztőplazmidok (ld. plazmidok) egyik fajtája autonóm replikálódó (ARS) formában, egy másik pedig kromoszómába épülve megmaradhat. Replikációs kezdőponttal rendelkező élesztőplazmidok transzformációs gyakorisága elérheti akár az 1 %-ot is.

Növényi sejtek transzformálása A növényi szövettenyésztés, a növényi biotechnológiák lehetővé teszik, hogy egyetlen izolált növényi sejttel úgy dolgozzunk, olyan génmanipulációkat vigyünk véghez, mint bármelyik mikroorganizmuson, és ha már a manipuláció megtörtént, akkor az izolált sejtből regeneráljuk a teljes növényt. Izolált növényi sejtek protoplasztjaiba tetszés szerint DNS-t tudunk bejuttatni, biztositani a bevitt gének expresszióját. A növények génmanipulálásának célja lehet a hagyományos nemesítési célokkal egyező, például betegségekkel szembeni rezisztencia kialakítása egy olyan gén bevitelével, mely megakadályozza a patogén hatását, vagy rezisztencia bizonyos növényvédöszerekkel, például gyomirtószerekkel szemben, hogy a vetemény gyomoktól való megszabadítására szelektíven lehessen alkalmazni azt a bizonyos szert, hiszen az csak a gyomokat fogja károsítani. A betegségek, a növényi kártevő rovarok elleni védekezés egyik megoldása, hogy rezisztens fajokból, vagy vad ősökből kinyerni a betegség elleni rezisztenciáért felelős gént és azt beültetni az érzékeny kultúrfajtába. Ez főleg bakteriális és gomba kártevőkkel szemben adhat megoldást. A másik lehetőség, hogy teljesen új gén segítségével érjük el az ellenállóképesség kialakulását. Ilyen gén lehet a Bacillus thuringiensis toxinjának a génje. A toxin a rovarok bebábozódását akadályozza meg. A bakteriális gént sikeresen beültették dohányba és paradicsomba, majd burgonyába is. A Bacillus thuringiensis toxint termelő dohány már kereskedelmi forgalomban is van az USA-ban. Ennek engedélyeztetése, lévén, hogy nem eszik meg, hanem elégetik, tehát nem az élelmiszer minőségi kritériumoknak kell eleget tennie, tehát viszonylag enyhébb biztonsági és egészségkritériumoknak. A toxin génjének beültetésétől eltérő stratégia egy olyan enzim génjének a beültetése, mely megtámadja a kártevőt. A kitináz enzim génjéről van szó, mely képes lebontani a kitinvázas rovarokbélburkár a növény emésztése során. Vannak olyan fehérjék, főleg enzim-inhibitorok, amelyek a kártevő bélcsatornájában hatnak, amikor az már emészti a növényt. Ezek a fehérjék a rovar valamelyik életfontosságú enzimjét gátolják, például tripszin-inhibitorok. Csak a géntechnikák segítségével elérhető új tulajdonságok kialakítása is lehet a cél. Kutatók ezrei dolgoznak például a légköri nitrogén megkötéséért felelős, azt lehetővé tevő gén növényekbe ületetésével, melynek segítségével a növények majd a „levegőből” is megélnek, hiszen annak nitrogéntartalmát fogják testükbe építeni, nem pedig az energiaigényes nitrogén-műtrágyákat. A DNS növényi sejtbe történő bejuttatásának legfőbb akadálya a sejtfal. A vastag, merev sejtfal nem teszi lehetővé, hogy a növény a baktériumokhoz hasonlóan DNS-t vegyen fel a környezetéből. A növényi sejtek génsebészeti átalakításához tehát az izolált növényi sejtből először protoplasztot kell készíteni olyan ozmotikus viszonyok között tartva ezt, hogy a sejt hártyájára a belső ozmózisnyomással azonos nyomás nehezedjen, továbbá meg kell akadályozni a sejtfal spontán visszaépülését, vagyis a sejtfalbontó enzimek koncentrációját állandó értéken tartani. Ha ezy sikerül megcsinálni, akkor következhet a DNS bejuttatása a protoplasztba. Ennek leggyakoribb módszerei az egyszerű transformáció, azaz a DNS direkt bejuttatása, a mikroinjektálás, az elektroporáció és a génpuska (biolisztika). Biológiai közvetítéssel az Agrobacterium tumefaciens felhasználásával történhet növényekbe génbevitel. Növényi protoplasztok transzformálása idegen DNS-sel lehetséges a sejtfal eltávolítása után. Egyes esetekben egyszerűen a DNS hozzákeverésével is megtörténik, természetesen megfelelő körülmények között. Növények mikroinjektálása leggyakrabban vagy DNS tartalmú liposzómákkal történik, ilyenkor a sejt citoplazmája a cél, vagy közvetlenül a sejtmagba. Utóbbi nehézkesebb, de jól kontrollálható a beinjektált DNS mennyisége. A biolisztika, vagyis a génpuska alkalmazása nem olyan hatékony eszköz a növényeknél, mint az állatok esetében. A nüvényi sejtbe jó hatásfokkal és könnyűszerrel bejut a DNS, de a kromoszómába épülés hatásfoka általában gyenge, így transzgénikus növények előállítására nem alkalmas.

Emlőssejtek transzformálása, transzgénikus állatok Az emlőssejtek transzformálásának jelentősége igen nagy, gondoljunk csak a génterápiára. Egyes örökletes genetikai betegségek oka, egy hiányzó, vagy hibás gén. Az ilyen betegséget a sejtekbe bevitt ép génekkel lehet gyógyítani, a hiányzó vagy kiesett funkciót pótolni. Ilyenkor egy soksejtű lény egyes szöveteibe, vagy összes sejtjébe be kell juttatni az ép gént és biztosítani kell annak expresszióját. Az olyan állatot, amely sejtjeiben egy másik organizmusból származó gént tartalmaz, transzgenikus állatnak nevezzük. Ez a kifejezés nem általánosodott az összes élőlényre, csak kimondottan transzformált állatok illetve állati sejtek esetében használják. Állatok esetében viszont akkor is használják, ha a gén bevitele vírusok vagy tumosrsejtek segítségével történik. Az első emlőssejt transzformációs kísérletek sejttenyészetben folytak a Herpes simplex vírus (HSV) timdinkináz enzimjének génjével. Timidinkináz deficiens mutáns emlőssejttenyészetet hoztak össze a herpeszvírus timidinkináz génjével, acélból, hogy a hibás emlőssejteket kijavítsák. Az emlőssejtek a DNS-t képesek felvenni, ha az kalcium-foszfát csapadék formájában kerül a sejttel kapcsolatba. A kalciumfoszfát csapadék formát valószínűleg fagocitózissal kebelezi be a sejt, és az így bekerült DNS egy része integrálódik a kromoszómába. A felvett vírus eredetű timidinkináz gén véletlenszerűen épült be az emlőssejt kromoszómájába. Ha ehhez a timidinkináz génhez bármilyen más gént kapcsoltak, a kapcsolt gén is könnyűszerrel bejutott a kompetens sejtekbe és rekombinálódott a kromoszómával. Az is világossá vált, hogy a timidinkináz génnek nem is elsősorban vektor, hanem inkább marker szerepe van, azaz jelzi az idegen gén beépülését. Az idegen gén akkor is beépül transzformációval a kromoszómába, ha nincs előzetesen hozzákapcsolva a timidinkináz génhez. Érdekes, hogy ilyen esetben is egymás mellett épülnek be a transzformált sejt kromoszómájába, ez azt jelenti, hogy a DNS-ek a sejten belül ligálódnak. Ezt a folyamatot kotranszformációnak nevezik. Transzgénikus állatok előállítása nem olyan egyszerű, mint a növényeké, ahol a teljes növény regenerálható egyetlen izolált sejtből a növényi sejt úgynevezett totipotenciálja miatt. Ahhoz, hogy az egész állat transzgénikus legyen, a csírát, a petesejtet, vagy a spermiumot, vagy a megtermékenyített zigótát kell megváltoztatni, vagyis transzformálni a szükséges gént tartalmazó DNS-sel. A kifejlett állat egyes sejtjeinek transzformálása általában nem megoldás egy hiányzó gén pótlására. A fent említett kalciumfoszfátos DNS csapadék sejtbe juttatásán kívül más fizikai-kémiai eljárások is alkalmazhatóak DNS állati ivarsejtbe, vagy zigótába juttatására, illetve a bejuttatás hatékonyságának növelésére. Ilyen módszerek a mikroinjektálás, az ivarsejtek transzformációja (transzfekciónak is nevezik), az elektroporáció, kromoszómák injektálása, embrionális sejtek összekeverése kiméra kifejlesztése céljából. Láthatjuk ebből a felsorolásból, hogy a transzgénikus állatok előállításánál az egyetlen gén bevitelétől egy teljes genom beviteléig teljes a stratégiai skála.

Mikroinjektálás Idegen DNS emlőssejtbe juttatására meglepő módon igen hatékonynak bizonyult a mikroinjektálás, vagyis az, hogy egy igen vékonyra kihúzott üveg mikropipettával egyenesen a sejtmagba injektáljuk a DNS-t. Ezt mikroszkópra szerelt mikromanipulátorral lehet kivitelezni. Aki ügyes kézzel tudja csinálni a mikroinjektálást, az óránként 500-1000 sejtbe is képes injektálni. Az injektált sejtek felébe stabilan beépül a bevitt gén. Nagy előnye, hogy bármely gén bevihető bármilyen sejtbe. Hátránya a kivitelezés nehézkessége. Ha a mikroinjektálás a megtermékenyített petesejtre irányul, akkor a teljes állat transzgénikussá tehető. Már az 1970-es évek elején bebizonyították, hogy korai embriókba injektált gének a nevelőanyában kifejlődött egerek 40 %-ában megtalálhatóak voltak. Az eredetileg beinjektált gének a megszületett egér legkülönfélébb szöveteiben fordultak elő, stabilan beépültek és öröklődtek. A mikroinjektálás első tapasztalatai után a technikát úgy módosították, hogy az injektálást petesejt megtermékenyítése utánra időzítették, amikor a már egyesült ivarsejtek magjai még nem olvadtak össze. A klónozott gént rendszerint a spermiumból származó sejtmagba injektálják, mert az bonyolult átalakulások után egyesül a petesejt magjával és ezek az átalakulások segítik az idegen gén beépülését. A manipulált petesejtet ezután vagy a petevezetékbe transzplantálják, vagy a blasztula stádium elérése után a méhbe ültetik be. Kutatási célból bármilyen gén petesejtbe injektálása megoldható, történelmi jelentőségű volt az emberi interferon és az inzulin génjének, a nyúl béte-globingénjének, a Herpes simplex vírus timidinkináz génjének vagy az egér leukémia vírus cDNSének mikroinjektálása. Ezekből a kezdeti kísérletekből meg lehetett állapítani, hogy 5 000 - 50 000 bázispár nagyságig lehet DNS-t bejuttatni, hogy a bejuttatott gének integrációja nem kromoszómaspecifikus és, hogy a bevitel hatásfoka igen jó, még a kezdeti kísérletek átlaga is eléri a 10 %-ot, ami 1-2 %-os beépüléstől egészen 40 %-os beépülésig változó hatásfok átlagát jelenti. Manapság már rutinszerűen alkalmazzák a mikroinjektálást marha, birka, kecske és disznó esetében. A mikroinjektálás két fő céllal szokott történni. Az egyik a háziállatok nemesítése, a másik hogy ezeket a génmanipulált állatokat expressziós rendszerként alkalmazzák.

Biolisztika, génpuska A kifejezés a ballisztika elferdítése. A ballisztika hajított testek és lövedékek mozgásának leírásával foglalkozó tudomány. A biolisztika névre keresztelt eljárás lényege, hogy a sejtbe juttatandó DNS-t összekeverik apró, mikron átmérőjű fém-részecskékkel, például tungstennel. Ezután ezt a DNS-fém keveréket nagy sebességgel belövik a sejtekbe, mint a lövedéket. Ez a lövedék a sörétre emlékeztet legjobban. Bejuttatása részecske pisztollyal történik. Ezek az apró sörétszemcsék átlyuggatják a sejt határoló felületét és a sejt plazmájába juttatják a DNS-t. Előnye, hogy bármilyen sejttípusra alkalmazható, baktériumok, gombák, növényi és állati sejtek egyaránt kezelhetőek ilyen módon. Még sejtrészecskéket, sejtszervecskéket, például a mitokondriumot vagy a sejtmagot is meg lehet célozni a speciális génpuskával. Ennek az eljárásnak vannak egyéb változatai is, például, amikor nem mechanikus fegyverrel lüvik be a részecskéket, hanem elektromosan kiváltott gyújtószikra segítségével hirtelen elpárologtatott vízcseppből felszabaduló gőz energiájával. Ebben az esetben az elektromos energia nagyságával lehet szabályozni a mini-robbanás erejét és beállítani az optimális bejuttatási hatásfokot. Belövéssel izolált sejteken kívűl szövetekbe, sőt élő szövetekbe is be lehet juttatni DNS-t. Növények esetében nem nagyon hatákony eljárás, mert annak ellenére, hogy bejut a DNS a sejtbe, a kromoszómába rossz hatásfokkal épül be. Kisérletekben sikerült egér bőrébe és fülébe DNS-t juttatni megfelelően átalakított génpuskával. A DNS jó néhány napig aktív maradt a sejtekben, mígnem később lebomlott. Ezek a kísérletek azt sugallják, hogy a génpuska alkalmas megoldás lehet az emberi szomatikus génterápia során a DNS élő szervezetbe juttatására. Ma még vannak hátrányai ezeknek a génpuskáknak, például azok a szöveteket roncsoló mellékhatások, melyet nem maga a bevitt részecske okoz, hanem a génpuska működése közben fellépő légáramok vagy gőzbuborékok. A Cornell Egyetemen kidolgozott módszer alapján a Du Pont kereskedelmi forgalomban is elérhető eljárást sé eszközt dolgozott ki.

Elektroporáció A transzformációt, vagyis a meztelen DNS-nek a közvetlen sejtbe juttatását az elektromos erőtér alkalmzása elősegíti. A sejtfúzió hatékonységénak növelésére is alkalmazzák. A körülményeket optimálni kell, nehogy a sejtek megsérüljenek, felrobbanjanak az elektromos erőtérbe kerülve. A transzformálandó sejteket a DNS-t tartalmazó oldatba teszik, majd az egészet elektromos erőtérbe helyezik, például váltóáramot adnak rá. Az elektromos erőtér módosítja a sejt lipidmembránjának állapotát, megnövelve sejthártya átjárhatóságát, részecskéknek, molekuláknak a külső térből való felvételét (pinocitózis). Főleg növényi sejtekbe való DNS bejuttatásnál sikeres és elterjedt az elektroporáció, történelmileg is a növényi sejtfúziónál (szomatikus hibridek, poliploidok előállítása) történő alkalmazásából fejlődött tovább. Egyéb sejttípusoknál, például mikróba- és állati sejteknél más módszerek kapnak prioritást (ld. transzformáció, transzfekció).