Ugrás a tartalomhoz

Fehérjebiotechnológia

Dr. Tőzsér József, Dr. Emri Tamás, Dr. Csősz Éva, Dr. Tőzsér József (2011)

Debreceni Egyetem

1. fejezet - 1. A fehérjék biokémiai tulajdonságai. A fehérjék szintézise. A prokarióta és eukarióta fehérjeszintézis közti különbségek áttekintése

1. fejezet - 1. A fehérjék biokémiai tulajdonságai. A fehérjék szintézise. A prokarióta és eukarióta fehérjeszintézis közti különbségek áttekintése

Tartalom

Az élő szervezetben a fehérjék változatos szereppel rendelkeznek. Lehetnek katalizátorok (enzimek), részt vehetnek a különböző molekulák sejten belüli vagy sejtek közötti transzportjában (pl. dinein, kinezin, transzferrin), rendelkezhetnek raktározási funkcióval (pl. ferritin) vagy bírhatnak mechanikai tartó szereppel (pl. kollagén). A sejtek mozgása, egymással történő kommunikációja, az idegimpulzusok keletkezése és terjedése, a sejtnövekedés és differenciáció kivitelezése és ellenőrzése mind fehérjéken keresztül megvalósuló folyamat. A szervezet védekezése a behatoló kórokozókkal szemben fehérjék (antitestek) révén valósul meg, de ugyancsak fehérjék összehangolt működése biztosította, hogy őseink el tudtak szaladni az őket üldöző állatok elől.

A fehérjék felépítése

A fehérjék 20 aminosav különböző kombinációjából épülnek fel. Az aminosavak L-illetve D-konfigurációval rendelkezhetnek, azonban a fehérjéket alkotó aminosavak, néhány kivételtől eltekintve, L-konfigurációjúak. A fehérjékben az aminosavak peptidkötés révén kapcsolódnak egymáshoz, amely egy síkot képez. A peptidkötés lehet transz és cisz peptidkötés. A transz forma energetikailag lényegesen kedvezőbb, ezért előfordulása is gyakoribb, kivéve a prolinnal kialakított peptidkötést, mely esetében jelentős mértékű lehet a cisz forma előfordulása is. Az aminosavak kémiai tulajdonságaik alapján rendelkezhetnek hidrofób vagy hidrofil jelleggel, lehetnek alifás, aromás, pozitívan töltött, negatívan töltött, poláros vagy apoláros molekulák (1.1. ábra).

1.1. ábra - 1.1.ábra. A fehérjéket felépítő leggyakoribb 20 aminosav.

1.1.ábra. A fehérjéket felépítő leggyakoribb 20 aminosav.

Az aminosavak kémiai jellegének a fehérjeszerkezet kialakulása során van jelentősége, ugyanis az élő rendszerekre jellemző vizes közegben a hidrofób aminosavak a molekula belsejében, a víztől elzárt helyen, míg a hidrofil aminosavak a molekula felszínén, a vízzel érintkező felületen helyezkednek el (1.2. ábra).

1.2. ábra - 1.2. ábra. A globuláris fehérjék szerkezete.

1.2. ábra. A globuláris fehérjék szerkezete.

A fehérjék csak akkor tudják ellátni funkciójukat, ha oldott állapotban vannak. A fehérjék oldékonyságát a fehérje aminosav összetétele és a vizes rendszerek fizikai és kémiai paraméterei együttesen határozzák meg:

  • pH – a fehérje oldékonysága az izoelektromos pontjuk (pI) körül a legkisebb;

  • Ionerősség – magas ionerősség csökkenti a fehérjék oldékonyságát

  • Aminosav összetétel – több hidrofób aminosavat tartalmazó fehérjék kevésbé oldódnak vizes rendszerekben

  • Detergensek (1.3. ábra) és redukáló ágensek jelenléte növeli a fehérjék oldékonyságát.

1.3. ábra - 1.3. ábra. A detergensek csoportosítása töltöttségük szerint.

1.3. ábra. A detergensek csoportosítása töltöttségük szerint.

A detergensek hatására a fehérjék szerkezete megváltozik, elveszítik a működésükhöz szükséges térszerkezetüket, denaturálódnak (I-4 ábra), de ugyanakkor megakadályozzák az izolált membránfehérjék aggregációját. A redukáló ágensek pedig redukálják a fehérjékben található S-S kötéseket, ezáltal a fehérjék denaturációját okozzák (1.5. ábra).

1.4. ábra - 1.4. ábra. A detergensek hatása a fehérjékre.

1.4. ábra. A detergensek hatása a fehérjékre.

1.5. ábra - 1.5. ábra. A redukálószerek hatása a fehérjék szerkezetére.

1.5. ábra. A redukálószerek hatása a fehérjék szerkezetére.

A fehérjék szintézise

A fehérjék szintézise az a folyamat, amelynek során a génekben kódolt, mRNS-re átíródó információ alapján a riboszómák egymáshoz kapcsolják az aminosavakat polipeptidláncot alakítva ki. A fehérjeszintézishez szükség van aminosavakra, tRNS és mRNS molekulákra, a genetikai kódra és riboszómákra. A DNS bázissorrendje a genetikai kód segítségével fordítódik le a fehérjék aminosav-sorrendjévé. A genetikai kódot a négyféle bázis összesen 64 lehetséges hármas kombinációja, a kodonok alkotják, amelyek mindegyike meghatározott aminosavat kódol. A tRNS vagy transzfer RNS, lóhere vagy fordított L alakú molekula (1.6. ábra), amely a fehérjeszintézis helyére szállítja a citoszólból a megfelelő aminosavat. A 61 féle tRNS molekula mindegyike rendelkezik egy aminosavkötő karral és egy antikodon karral, amely az mRNS megfelelő kondonjait ismeri fel specifikusan.

1.6. ábra - 1.6. ábra. A tRNS szerkezete.

1.6. ábra. A tRNS szerkezete.

Az aminoacil-tRNS kialakítása két lépésben történik, az aminosavakat először aktiválni kell, majd a megfelelő tRNS-t fel kell tölteni vele. Az aminoacil tRNS szintetáz enzim által katalizált reakcióban először megtörténik az aminosavak aktiválása, majd a tRNS feltöltése (1.7. ábra).

1.7. ábra - 1.7. ábra. Az aminosavak aktiválása, a tRNS feltöltése.

1.7. ábra. Az aminosavak aktiválása, a tRNS feltöltése.

A prokarióták és eukarióták mRNS-e eltérő szerkezetű: az eukarióta mRNS rendelkezik 5’ sapkával és 3’ poliA farokkal, míg a prokarióta mRNS nem. A prokariótáknál a riboszóma lokalizációját az 5’UTR (untranslated region – nem transzlálódó régió) régióban található Shine-Dalgarno szekvencia segíti; az eukariótáknál ezt a feladatot a hasonló régióban elhelyezkedő Kozak szekvencia látja el (1.8. ábra). A prokarióta mRNS policisztronos – egyetlen mRNS több fehérjét kódol, míg az eukarióta mRNS ezzel szemben monocisztronos. A prokaiótáknál a Start kodon fMet-t kódol és a Shine-Dalgarno szekvencia előzi meg. A belső, Met kódoló, AUG nem tartalmaz Shine-Dalgarno szekvenciát. Az eukariótáknál a Start kodon az 5’ sapka utáni első AUG és metioint kódol; belső AUG nem lehet iniciációs hely, mindig metioint kódol (1.9. ábra).

1.8. ábra - 1.8. ábra. A prokarióta és az eukarióta mRNS szerkezete.

1.8. ábra. A prokarióta és az eukarióta mRNS szerkezete.

1.9. ábra - 1.9 ábra. A prokarióta és eukarióta mRNS-ek közötti különbség.

1.9 ábra. A prokarióta és eukarióta mRNS-ek közötti különbség.

A riboszómák kis és nagy alegységből állnak, amelyeket számos rRNS és fehérje molekula alkot (1.10. ábra). A funkcionális riboszómában különböző helyek alakulnak ki (1.11. ábra), amelyek kötőfelületet biztosítanak a fehérjeszintézis szereplői számára és biztosítják az aminoacil-tRNS belépés (A hely), a peptidkötés kialakítás (P hely) és az üres tRNS távozás (E hely) összehangolását. A fehérjeszintézis iniciációja során prokariótákban a tRNSfMet kötődik a kis alegységhez az iniciációs faktor-2 (IF-2) segítségével, majd a kis alegység az mRNS Shine-Dalgarno szekvenciáját (AGGAGG) ismeri fel úgy, hogy a 16S RNS-e tartalmazza az anti-Shine-Dalgrano szekvenciát (UCCUCC). A komplementer szekvenciák kapcsolódásával megvalósul a kis alegység megfelelő pozicionálása a start (AUG) kodonhoz (1.12. ábra). Az eukariótákban a fehérjeszintézis iniciációja hasonló, a tRNSMet kötődik a kis alegységhez az eukarióta iniciációs faktor-2 (eIF-2) segítségével. A kis alegység az mRNS 5’ sapka utáni első AUG kodont ismeri fel (scanning). A Kozak szekvencia segíti a kis alegységet az mRNS-hez való kapcsolódásban (1.13. ábra). Az iniciáció a riboszóma komplex (70S ill. 80S) kialakulásával fejeződik be (1.14. ábra).

1.10. ábra - 1.10. ábra. A riboszómák szerkezete.

1.10. ábra. A riboszómák szerkezete.

1.11. ábra - 1.11. ábra. A működő riboszóma szerkezete.

1.11. ábra. A működő riboszóma szerkezete.

1.12. ábra - 1.12. ábra. A fehérjeszintézis iniciációja prokariótákban.

1.12. ábra. A fehérjeszintézis iniciációja prokariótákban.

1.13. ábra - 1.13. ábra. A fehérjeszintézis iniciációja eukariótákban.

1.13. ábra. A fehérjeszintézis iniciációja eukariótákban.

1.14. ábra - 1.14. ábra. Az iniciáció a riboszóma komplex (70S ill. 80S) kialakulásával fejeződik be.

1.14. ábra. Az iniciáció a riboszóma komplex (70S ill. 80S) kialakulásával fejeződik be.

A fehérjeszintézis második lépése: az elongáció, amikor a polipeptidlánc hosszabbodik (1.15. ábra). Az A helyre egy aminoacil-tRNS molekula kötődik, de az aminoacil-tRNS molekula riboszómához történő kapcsolódása energiaigényes folyamat és a Tu elongációs faktor segítségével valósul meg. Az A helyen levő aminosav olyan közel kerül a P helyen levő aminosavhoz, hogy lehetőség lesz a peptidkötés kialakítására. A peptidkötést a riboszóma peptidil transzferáz aktivitása katalizálja. A riboszóma transzlokációja során az A helyen levő polipeptidil-tRNS a riboszóma elmozdulásával a P helyre kerül át, és az A hely üresen marad.

A folyamat végén az üres tRNS az E helyre kerül, ahonnan a citoszólba távozik, a P hely tartalmazza a növekvő peptidláncot tRNS-hez kapcsolt formában, míg az üres A helyre bekötődhet a következő aminoacil-tRNS. Az elongáció során a fehérjék szintézise az amino-terminustól a karboxi-terminus felé tart, miközben a riboszóma az mRNS 5’ végétől a 3’ vég felé halad (1.16. ábra). Egy mRNS-ről egyszerre több riboszóma is képes fehérjét szintetizálni (poliszóma). Az elongáció energiaigényes folyamat, de ahhoz a lépéshez, amelyben a peptidkötés kialakul, nem szükséges energia.

1.15. ábra - 1.15. ábra. A fehérjeszintézis második lépése az elongáció.

1.15. ábra. A fehérjeszintézis második lépése az elongáció.

1.16. ábra - 1.16. ábra. Az elongáció jellegzetességei.

1.16. ábra. Az elongáció jellegzetességei.

A fehérjeszintézis harmadik, befejező lépése: a termináció. A terminációs faktorok (Release factor) pl. RF1 felismerik a stop kodont, hozzákapcsolódnak és a riboszóma-tRNS-mRNSkomplex szétesését eredményezik (1.17. ábra).

1.17. ábra - 1.17. ábra. A fehérjeszintézis harmadik lépése a termináció.

1.17. ábra. A fehérjeszintézis harmadik lépése a termináció.

Az eukarióták esetében a fehérjék szintézise a citoszólban, míg a transzkripció és az mRNS érése a sejtmagban történik (1.18. ábra). A sejtmagból csak a teljesen érett mRNS jut ki, ily módon, a hibásan szintetizálódott vagy félkész mRNS nem szolgálhat templátként a fehérjék szintéziséhez. A prokariótáknál a transzkripció és transzláció helye megegyezik (1.19. ábra).

1.18. ábra - 1.18. ábra. A fehérjeszintézis helye az eukariótákban.

1.18. ábra. A fehérjeszintézis helye az eukariótákban.

1.19. ábra - 1.19. ábra. A fehérjeszintézis helye a prokariótákban.

1.19. ábra. A fehérjeszintézis helye a prokariótákban.