Ugrás a tartalomhoz

Fermentációs biotechnológia

Dr. Kutasi József (2007)

Glia Kft.

Enzimek

Enzimek

Az enzimek az élő szervezetekben lejátszódó biokémiai reakciókat irányító katalizátorok, kémiai természetüket tekintve globuláris fehérjék. Enzimeket széles körben állítanak elő ipari fermentációval. A mosószerek nagy mennyiségben tartalmaznak fermentációs proteázokat, az állattakarmányokba pl. amilázokat, cellulázokat, xilanázokat, glüko-amilázokat adagolnak a jobb takarmányhasznosulás érdekében, és pektinázokat, lipázokat a gyümölcslevek előállításánál. Mindezeket baktériumok és gombák fermentációjával lehetséges előállítani.

A gombák és baktériumok anyagcsere folyamataikban alapvető szerepük van az enzimeknek. A biotechnológiában elsősorban a sejten kívüli (extracelluláris) enzimtermelést alkalmazzák, mikor a fermentlébe vagy a szilárd közegbe választódnak ki a hatékony enzimek, enzimcsoportok.

Extracellularis enzim gyartásának folyamatábrája

Extracellularis enzim gyartásának folyamatábrája

Fehérjebontó enzimek, proteázok, peptidázok

A mosószerek 70-80%-a tartalmaz fermentációs proteázokat, ezért ezek termelési mennyiségüket tekintve a legjelentősebb enzimcsoport. 1915-ben Otto Röhm szabadalma indította el a modern mosóporgyártást és gyártanak azóta is mosóporadalékot proteolitikus enzimeket termelő mikrobák segítségével. Proteázokat még a tejipar is hasznosít, valamint a takarmányipar (lásd később).

Ezek az enzimek a fehérjéket hasítják, illetve a peptidek keletkezésén át aminosavig bontják a proteineket. A proteinázok az eredeti fehérjemolekulákat (endopeptidázok), a peptidázok (exopeptidázok) viszont a peptideket hasítják. A termelő szervezetek szerint megkülönböztetünk bakteriális és gomba eredetű, valamint savas, semleges illetve lúgos környezetben aktív proteázokat. A mosószerekhez adagolt lúgos proteáz elsősorban Bacillus baktériumok fermentációjából származik, így a legismertebb bacillopeptidázok a Subtisilin Carlsberg (B. licheniformis), a Subtilisin Novo és BPN (B. amyloliquefaciens). Ezek az enzimek lúgos tartományban (pH 8-11) hatnak és magasabb hőmérsékleten is stabilak, tekintve a mosógépekben alkalmazott körülményeket (90 C-os főzőmosás). Nagy proteáz aktivitású fermentleveket fehérje tartalmú tápközegben szubmerz rendszerekben az oxigén nagy parciális nyomása mellett állítanak elő.

Semleges kémhatású proteázokat Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces baktériumok és Aspergillus gombák állítanak elő. Elterjedésük korlátozott, főleg a bőrgyártásban cserzésre használják.

Bacillus subtilis baktériumok.

Kisméretű (2-4 mikrométer) bacillusok.

Pseudomonas sp. baktériumok.

Hajlott jellegzetes pálcák.

Bacillus subtilis mozgása.

Pseudomonas sp.

A gombákból nyerhető savas proteázokat az állattakarmányozásban (lásd lent) és a sajtgyártásban alkalmazzák. A tejfehérje, a kazein kicsapásához a tejet koaguláló rennin (a borjú gyomrának kivonatát, a rennit használták régen) típusú proteázokat kevernek a sajt fajtájának megfelelő starterkultúrával (pl. Lactobacillusok) már savanyított tejhez. Ilyen savas peptidázok termelésére Mucor, Aspergillus vagy a legújabb kutatások szerint hőtűrő, ezért stabilabb proteázt termelő Thermomyces, Humicola gombák is alkalmasak.

Thermomyces(Humicola) lanuginosus xilanáz enzimtermelő gomba fonalai.

A gombafonalak kusza szövevénye jól megfigyelhető, nem spórázik.

Thermomyces(Humicola) lanuginosus enzimtermelő gomba agarlemezen és spórái.

Xilanáz enzim termelésére képes. A szaprofiton Thermomyces lanuginosus ( Humicola lanuginosa ) fajok egysejtű, sötét szinű, gömbölyű konidiumai a Phaeosporarae (Vajna L. 1987) nemzetségre jellemző bélyeg. Az ebbe a nemzetségbe tartozó Epicoccum, Humicola, Tricholadium és Clasterosporium fajok konidiumai magánosan alakulnak ki, a konidiumanyasejteken fejlődő duzzanatok formájában (Scmiedeknecht M, 1975). A csúcsi konidium alatt és oldalán még egymás után további konidiumok is képződhetnek, ilyenkor a konidiumtartó csúcsán konidiumfürtök jönnek létre. A konidiumok módosult csúcssejtek, a vegetativ tenyésztest részei, nem új képletek. Széles alapon izesülnek a hifához, csak a telep szétesése után válnak szabaddá. Ezek az aleuriokonidiumok úgynevezett tallospórák, melyek a hifák feldarabolódásával jönnek létre ( Vajna L. 1987 ). Ezen fajok mindegyike növényi maradványokon él és a szaprofitonok közé sorolandók, gyakran fordulnak elő magasabbrendű növények levelein pl: kukoricalevélen. Sok fajuk termofil, hőrezisztens mikroorganizmus, mely alapvetően megkülönbözteti őket más mezofil vagy pszichrofil fajoktól ( lásd izolálási procedúra). Potato dextróz agaron vörösbarna pigmentképzésre képes.

Történeti érdekesség a Taka proteáz, amelynek előállítását Takamine dolgozta ki már az 1900-as évek elején. Ez a rizsalapú penészkorpás SSF eljárás a japánok ősi rizserjesztő penészkultúráját a híres szaké (rizspálinka) előállításához használatos koji-t hasznosítja.

Keményítőbontó poliszacharidázok és oligoszacharidázok

keményitőbontó enzimek hasitási helyei

keményitőbontó enzimek hasitási helyei

A keményítőhidrolizátumok nagy szerepet játszanak az élelmiszeriparban, mint adalékok. Ma már az édesítőanyagokat és cukrokat nagyrészt kukorica- és kisebb részt burgonyakeményítőből állítják elő fermentált keményítőbontó enzimek segítségével, míg a cukorrépa felhasználásának részaránya egyre kisebb. Ezek az anyagok határozzák meg az édesipari és konzervipari termékek ízét, édességét és állagát.

A burgonya és kukorica keményítőtartalmát amilázokkal dextrinné, majd maltózzá és glükózzá lehet hidrolizálni. Régen az amilázos kezelés legfőbb módja a sörgyártásból jól ismert malátázás volt, ahol a maláta amiláztartalma biztosítja az enzimaktivitást. A cukorgyártásnál már mikrobiális amilázzal hidrolizálnak.

A keményítő glükóz egységekből álló poliszacharid, amelyben 1,4 és 1,6 glükozidos kötések váltakoznak. Az alfa-amilázok a keményítő 1,4 glükozidos kötéseit bontják és mind Bacillus, Micrococcus baktériumok és mind Aspergillus, Trichoderma fonalas gombák termelik. A legfontosabbak a B. amyloliquefaciens, B. licheniformis és az Aspergillus oryza. Fermentációjukat szubmerz módon végzik, nem glükóz alapon, mivel az u.n. katabolitrepresszió miatt az indukáló szénhidrát, a keményítő jelenlétében termelődik csak amiláz. A termelést Bacillusokkal magas 45 C-os hőfokon végzik. Az Aspergillusok fermentációja alacsonyabb hőfokon, de több napon át tartó folyamat. Az 1,6 glükozidos kötések bontását a béta - amilázok végzik, ezek növényi eredetűek.

Aspergillus sp . gombafonalak.

Az Aspergillus kannapenész fonalai vastagok, szintén kuszán úsznak tenyészetükben.

Az amilázokkal elfolyósított keményítőt glüko-amilázokkal lehetséges elcukrosítani, ekkor a hidrolízis köztes terméke a maltóz végterméke a glükóz szirup. Az Aspergillus awamori-al vagy Rhizopus gombatörzsekkel lehetséges keményítőalapú 3-5 napos fermentációs előállításuk.

A glükóz a répacukorhoz mérten kb. 70% édesítőerejű, ezért szükséges egy részét a szacharóznál kétszer olyan édes fruktózzá alakítani (lásd izocukor előállítás). Ezt a glükóz-izomeráz enzimmel végzik, amelyet nagy mennyiségben a Bacillus coagulans baktérium tenyésztésével állítanak elő. Rengeteg baktérium képes ilyen enzim előállítására pl. Streptomyces, Arthtrobacter, Micromonospra, Nocardia, Brevibacterium, Micrococcus. A fermentáció attól különleges, hogy xilóz alapú, ahol a xilán és a xilóz tartalmú búzakorpa biztosítja a glükóz-izomeráz (xilóz izomeráz) indukcióját.

Izocukor előállítás

Széleskörben alkalmazott enzimtechnológiai eljárás az izocukor előállítása. Az izocukor glükóz-fruktóz elegy tömény vizes oldata, amelyet az élelmiszeriparban nagy mennyiségben édesítőszerként használnak. Előnyös tulajdonsága, hogy nehezen kristályosodik, illetve erős nedvszívó képessége miatt megakadályozza a készítmény vízvesztését. A felhasznált nyersanyag: kukorica. A szemekből eltávolítják a fehérjetartalmú csírát, amelyet állati takarmányként hasznosítanak. A csírátlanított szemeket megőrlik, és a keményítőt elkülönítik, majd gondosan tisztítják. Ezután α-amiláz enzimet adnak hozzá, és 85-94 °C-on, 5-6 pH-n előhidrolizálják a keményítőt. Ezt az enzimet hevítéssel inaktiválják, és a lehűtött oldathoz amiloglükozidáz készítményt adnak, amely glükózig viszi tovább a hidrolízist. Az így kapott glükóz-oldatot immobilizált glükóz-izomeráz enzimmel feltöltött oszlopokon engedik át, aminek hatására egyensúlyi reakció során a glükóz egy része fruktózzá izomerizálódik. A kapott oldatot tisztítják és töményre (körülbelül 64 m/m %-osra) bepárolják.

Pektinázok és lipázok

A pektin számos növényi sejtfal alkotórésze, így zöldségek, gyümölcsök és takarmányok nagy mennyiségben tartalmazzák. A pektin részlegesen metilezett galakturonsav, amely az arabinoxilánokkal áll, mint struktúra összetartó réteg szoros kapcsolatban. A pektinázok legnagyobb felhasználási területe a gyümölcslékészítő ipar, mivel a pektinek ezeket a folyadékokat besűrítik, így enzimes elbontásukkal a viszkozitás lecsökkenthető.

A pektinázokat régebben penészgombák pl. Aspergillus niger szilárd felületi tenyésztésével állították elő, de ma már a szubmerz pl. Rhizopus fermentációt alkalmazzák. A penészgombák készítményei legalább 6 féle pektináz típusú enzimet tartalmaznak, amelyek a poligalakturonsav hasítási helyei szerint exo és endo peptidázok egyaránt lehetnek.

Aspergillus penészgomba telepek.

Az enzimtermelő fonalas gomba Aspergillus niger fehér szálas telepei jól látszódnak fekete háttérrel.

A lipázok a növényi és állati eredetű olajokat (glicerin–észtereket) zsírsavakra és gliceridekre hasítják. Felhasználásuk korlátozott, bár mind a humán gyógyászatban, mint emésztés elősegítő, mind a takarmányiparban (lásd következő fejezet) hasznosítják. Előállításuk elsősorban penészgombák fermentációjával lehetséges, úgy, mint Aspergillus, Penicillium, Rhizopus törzsek, de amennyiben a táptalajt olajokkal vagy zsírokkal egészítjük ki élesztőgombák (Torulopsis, Candida) és baktériumok (Micrococcus, Lactobacillus) is kiválasztják fermentlevükbe.

NSP (nem keményítő típusú) enzimek

A nem keményítő típusú (NSP) poliszacharidok, amelyeket többféle módon osztályoznak a következők: szénhidrát egységek és kötések alapján van a cellulóz (1-4 kötések), egyéb béta-glükánok (kevert 1-3, 1-4 kötések), pentozánok (arabinoxilánok), galaktomannánok és pektinek. A legelterjedtebb hemicellulózok a xilánok és xiloglükánok (arabinoxilánok). Összekötőként szerepelnek a pektin és cellulóz frakció között. A lebontás során mindezen rost anyagokat bontani kell, a következő enzimekkel: 1. pektinázok (lásd előző fejezet) 2. xilanázok (endo-1,4-beta-xylanáz) 3. cellulázok (Mivel több enzim csak együtt képes megbontani a cellulózt, ezért többféle enzim alkotja együttesen a cellulázok csoportját: cellobiohidroláz (exo-1,4-beta-cellobiohidroláz), glükanáz (endo és exo1,4–beta-glükanáz) glükozidáz (beta –glükozidáz).

Az NSP enzimeket ipari méretekben gombák tenyésztésével biotechnológiai úton állítják elő (12, 17). Az előállított gomba enzimkeverékek fő összetevői: celluláz, xylanáz, 1,4-béta-endoglükanáz, béta-glükozidáz, alfa-amiláz és alfa-galaktozidáz. Ezek közül a celluláz és xylanáz enzim a legtöbb termékben dominánsan van jelen (4, 12, 14). Az enzimtermelő gombatörzsek elsősorban a mikroszkopikus és tömlősgombák közül kerülnek ki, mint például az Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Trichoderma viridis és Humicola insolens, melyeket víz alatti fermentációval tenyésztenek fel (3, 17). Ugyanakkor ezen gombák szilárd közegű tenyésztése (pl. penészkorpás) is célravezető lehet (1, 11, 15). Mindezeket az enzimeket elsősorban a papírgyártás során a faanyagok feldolgozásánál, a ruhaiparban a pamutanyagok pl. farmerek koptató kezelésére, illetve a takarmányiparban (lásd lent) hasznosítják.

Enzimtermelő gombatenyészetek oltása ferdékről rázott lombikokba.

Enzimek a takarmányozásban

A takarmányok NSP, fehérje, olaj tartalma az állatok bélrendszerében önmagukban lassan és csak részlegesen tud csak lebomlani. Ennek fő oka, hogy egyrészt a bélcsatorna emésztőenzimjei ezekhez a nehezebben bontható anyagokhoz nem képesek hozzáférni, másrészt a gabonafélék magvait döntő részét alkotó struktúraalkotó poliszaharidokat csak speciális enzimtermelő mikrobák képesek lebontani. Az állatok csak a bélcsatornájukban élő mikroorganizmusok segítségével képesek felhasználni a növényi sejtfal szénhidrátjait. Azokban az állatfajokban, amelyekben a bélcsatorna kiürülése gyors és kevés a bélben élő mikroorganizmus, korlátozott a nem keményítő típusú szénhidrátok lebomlása.

A proteáz enzimeket az állattakarmányozásban a jobb takarmányhasznosulás érdekében, elsősorban baromfi és sertés takarmányadalékaként is használják. Ezeknek a monogasztrikus állatoknak az emesztőenzimjei képesek ugyan bontani a növényi fehérjéket, de hasznosulásuk fokát jelentősen növelik az állatok takarmányába kevert enzimkészítmények. Az állattakarmányozásban felhasználandó proteáz enzimeknek működőképesnek kell maradniuk a monogasztrikus állatok gyomrában uralkodó savanyú kémhatáson, ezért igen fontos olyan enzimek alkalmazása, amelyek savas kémhatáson is működőképesek maradnak (gomba enzimek),

2.1. táblázat - A főbb gabonafélék rostalkotó és NSP tartalma (Fekete 1994)

Összetevő (% sza.)ZabÁrpaRozsBúza
Összes rost29,617,212,810,6
Glükóz*[a]12,27,93,93,1
Uronsav**[b]1,10,50,80,4
Lignin8,41,21,70,9
Béta-glükán3,23,81,30,8
Arabinóz***[c]1,52,22,62,1
Xilóz***5,44,54,53,3
Mannóz0,30,50,60,5
Galaktóz0,70,40,60,5

[a] a cellulóz részeként

[b] a hemicellulóz részeként

[c] az arabinoxilán részeként


A gabonafélék béta-glükán és arabinoxilán tartalma a genotípus és a termesztési körülmények függvényében széles határok között mozoghat. Az árpában és a zabban főleg béta-glükánok, kisebb mértékben arabinoxilánok fordulnak elő. A rozsban tritikáléban és a búzában nagyobb mennyiségben találhatók az arabinoxilánok.

Mindezek indokolttá teszik az NSP enzimek alkalmazását. Ugyanakkor a gabonatakarmányok keményítő és más keményítő típusú anyagainak lebontásának meggyorsításához és így a hozam fokozásához - bár az állatok bélrendszerében lévő enzimek erre képesek –, a takarmányokat alfa-amilázokkal is kiegészítik.

A takarmányokhoz a nagyüzemekben nagy mennyiségben adagolt szója relatív alacsony 30-35% poliszacharid tartalommal rendelkezik, amelyben csak kis mennyiségben van jelen keményítő. Az NSP tartalom eléri a 18-22 %, így a szemes takarmányokhoz mérten, hasonló mennyiségben van jelen nehezen bontható rostanyag, amelynek jelentős része galaktomannán. Így itt, a megfelelő takarmányhasznosulás eléréséhez a speciális alfa- galaktozidáznak, mint galaktomannán bontó enzimnek jelentős szerepe van.

A szemestakarmányok napraforgó- és kukorica-olaj tartalmának lebontásának gyorsításához lipázokat is alkalmaznak a nagyüzemekben.

A legújabb kutatások szerint a baromfitápok szemestakarmánya nagy mennyiségű foszfort tartalmaz, de ennek 60-75%-a fitinsavhoz kötött. A fitinsavhoz kötött foszfor és egyéb komplex kötésben lévő elemek (Fe, Ca, Zn) felszabadításához a speciális fitázenzimre van szükség. (19, 58).

Ez az enzim, amely a fitátot inositolra és szervetlen foszforra hidrolizálja, kis mennyiségben megtalálható a növényi takarmányokban, mikroorganizmusok is termelik, a baromfiban azonban csak kis mennyiségben fordul elő, így a baromfi (és a monogasztrikusok) a fitinkötésben levő foszfort alig tudják hasznosítani. Más foszforforrásokkal kell az állatok igényét kielégíteni, ami több problémát is felvet. Költséges, esetleges túladagolása az egyéb ásványi anyagok felszívódását is befolyásolja, a hasznosítatlanul kiürülő foszfor a környezetet terheli. (19) (56).

Előállításuk is nagy hozzáadott értéket képvisel, mivel bár különböző gombatörzsek képesek termelni, legtöbbször a penészgomba fitáz génjét bakteriális vagy élesztő genomba transzformálva rekombináns fitáz fehérjét állítanak elő szubmerz módon (lásd rekombináns termékek).

Fitinsav

Fitinsav

2.2. táblázat - A főbb gabonafélék rostalkotó és NSP tartalma (Fekete 1994)

EnzimMikroorganizmus példák
Keményítő bontó alfa-amiláz, glüko-amiláz, glükóz-izomeráz, stb. Gombák

Saccharomyces cerevisiae

Aspergillus niger Aspergillus oryzae

Aspergillus awamori

Baktériumok

Bacilus coagulans

Streptomyces sp.

Thermomoospora sp.

Pseudomonas spp

Bacillus subtilis

Bacillus cereus

Bacillus licheniformis

NSP hidrolizáló enzimek xilanáz, celluláz, béta-glükanáz, alfa-galaktozidáz, pektináz stb. Gombák

Thermomyces lanuginosus

Thermomyces aurantiacus

Aspergillus niger

Aspergilus oryizae

Talaromyces emersoni

Aureobasidium pullulans

Trichoderma spp.

Humicola insolens

Baktériumok

Chlostridium thermocellum

Bacillus subtilis

Bacillus stearothermophilus

Lipáz, Proteáz Gombák

Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

Thermomyces lanuginosus

Trichoderma spp.

Baktériumok

Bacillus subtilis

Bacillus stearothermophilus

Fitázok Gombák

Saccharomices cerevisiae

Aspergillus ficuum

Aspergillus niger

Baktériumok

Pseudomonas spp

Bacillus subtilis