Ugrás a tartalomhoz

Növényi biotechnológia és géntechnológia

Dudits Dénes, Heszky László

Agroinform Kiadó

5. Az ivartalan szaporodás biotechnológiája (Heszky L.)

5. Az ivartalan szaporodás biotechnológiája (Heszky L.)

5.1. Az in vitro mikroszaporítás alapjai

A kertészeti növények hagyományos vegetatív szaporítása az elmúlt évszázadok során kifinomult és mindig is viszonylag fejlett technológiai szinttel párosult. Valószínűleg ezzel is magyarázható a steril mikroszaporítási eljárások meglepően gyors térhódítása az egész világon.

A steril vegetatív mikroszaporítás a növényi biotechnológiának az a területe, amelyet széles körben alkalmaznak a gyakorlatban, illetve az üzemi technológiák részévé vált.

Elméleti szempontból maga a szaporítás elve tulajdonképpen azonosnak tekinthető a hagyományos in situ technikákkal. Az elkülönítést az indokolja, hogy a szaporításra felhasznált inokulumok olyan kicsik, hogy csak steril körülmények között tarthatók életben, illetve nevelhetők fel.

A vegetatív mikroszaporítás fő technikái a merisztéma- és hajtáskultúrák, a század végére a járulékos szervek, illetve a szomatikus embriók tenyészeteivel bővültek. A módszerekkel elvben korlátlan (milliós, milliárdos) nagyságrendű szaporulat érhető el évente. Az in vitro kultúrák kiváló feltételeket teremtettek a kórokozó-mentesítésre, továbbá a kórokozó-mentesített tenyészetek tartós tárolására (génbank) is.

Mivel az említett technikák ma már az üzemi technológia részévé váltak, e fejezetben a mikroszaporítás különböző technikáinak bemutatásán kívül foglalkozunk a vírusmentesítés új eljárásaival és az in vitro génbankokkal is (5/1. ábra).

Kép

5/1. ábra: A kórokozómentes mikroszaporítás és szaporítóanyag előállítás fontosabb technológiai egységei (1–4), és azokban használatos fontosabb biotechnológiai módszerek

Növényklónozás in vitro

A vegetatív szaporítás ivartalan szaporodást jelent, tehát az új egyed nem a zigótából, hanem a testi (szomatikus, vegetatív) sejtekből alakul ki. Ennek természetes következménye, hogy az utódok genetikailag azonosnak tekinthetők, elvben sem egymástól, sem a kiinduló növénytől nem különbözhetnek. A magasabbrendű növények egy részének hagyományos szaporítási eljárásai hagymával, gumóval, hajtással, rüggyel, gyökérsarjjal, tőosztással stb. ivartalan, ún. vegetatív szaporításnak (klónozásnak) tekinthetők.

Az in vitro mikroszaporítás a növény különböző vegetatív (testi, szomatikus) szerveinek, szöveteinek, illetve sejtjeinek tenyésztését jelenti steril és kontrollált feltételek között. A klónozás elvi lehetőségét az adja, hogy a növények különböző részei, rügyei, merisztémái, bizonyos szövetei, illetve sejtjei – megfelelő in vitro feltételek között – teljes növény regenerációjára képesek. A mikroszaporítás célja a tenyésztett vegetatív szervekből, szövetekből, illetve sejtekből a lehető legtöbb növény regenerálása.

Az utóbbi csaknem harminc év során a mikroszaporításnak számos módszere alakult ki, amelyek bizonyos téren eltérnek egymástól a főbb növénycsoportokat (pl. dísznövények, zöldségfélék, fás növények stb.), és fajokat (pl. burgonya) illetően.

5.1.1. Története

Loo volt az első, akinek 1945-ben sikerült folyamatosan növekedő és fejlődő merisztématenyészetet előállítania. Az aszparágusz viszonylag nagy, 5 mm-es hajtáscsúcsát sikerrel nevelte szervetlen sókat és szacharózt tartalmazó táptalajon. A folyamatos tenyésztést az in vitro fejlődött hajtások 5 mm-es csúcsi részeinek 23 naponkénti átoltása tette lehetővé.

Később, 1946-ban BALL sikerrel tenyésztette a Lupinus albus három levélprimordiumot is tartalmazó merisztémáját, azonban még ez is túl nagy izolátumnak tekinthető. Kisebb hajtáscsúcsok, ténylegesen a merisztémák tenyésztése azt követően vált lehetővé, hogy alkalmazni kezdték a kókuszdiótejet, majd a gibberellinsavat a táptalajban.

A negyvenes évek végén és az ötvenes évek elején e kutatások két irányban folytatódtak. A kutatók egy része a vegetatív merisztémák in vitro továbbfejlődésével foglalkozott, különös tekintettel a generatív merisztémák és a virágfejlődés in vitro indukciójára és fenntartására. A másik kutatási irány a merisztéma tenyésztésen alapuló vírusmentesítés volt. A kutatók feltételezték, hogy a hajtáscsúcsok merisztémáinak legfiatalabb részei vírusmentesek akkor is, ha a növény fertőzött. Ezekből a merisztémákból tehát vírusmentes növények regenerálhatók in vitro. Ezt az elméletet igazolva, az ötvenes években sikerrel vírusmentesítettek különböző Solanum, Dahlia és Dianthus fajokat.

A vírusmentesítéssel kapcsolatos kutatások vezettek a mikroszaporítás felfedezéséhez 1960-ban. A francia MOREL egy orchideafaj, a Cymbidium vírusmentesítése során az izolált merisztémákon olyan szervek (protokormok) kialakulását figyelte meg, amelyek a csírázó orchidea magvakra voltak jellemzőek. MOREL később azt is bebizonyította, hogy ezeknek a protokormoknak a feldarabolásával a Cymbidium szaporítható, mert mindegyik kis darab újabb protokormokat regenerált. Az így szaporított protokormokból a táptalaj módosításával bármikor növényeket tudtak regenerálni. A módszert már a hatvanas évek végén, a hetvenes évek elején az egész világon és hazánkban is széles körben alkalmazták a virágtermelő üzemek. A módszer hazai adaptálója, továbbfejlesztője és terjesztője MARÓTI professzor volt.

Az orchideák mellett több száz azoknak a kertészeti, erdészeti és szántóföldi fajoknak a száma, amelyekre mikroszaporítási módszert dolgoztak ki.

A primer merisztéma tenyészeteket követően a szaporítás már általában nem a merisztémák átoltásával történik. Legalább olyan jelentőségre tettek szert a hajtástenyészetek, amelyek nodális szegmentekkel, járulékos vagy oldalhajtással, vagy a járulékos szervtenyészetek (hagyma, gumó), továbbá a sejt- és embriótenyészetek, amelyek járulékos embriókkal klónozhatók.

Mikroszaporítási célból az utóbbi évtizedben speciális kereskedelmi laboratóriumok alakultak az egész világon és hazánkban is. Évente a világon előállított növények száma 1987-ben már meghaladta a 200 milliót, és a század végére elérte az 500 milliót (Európa és Észak-Amerika).

5.1.2. A zárvatermők apikális merisztémájának anatómiája

A zárvatermők csúcsmerisztémáinak felépítésére sokáig a klasszikus tunika-corpus elméletet használták. Ennek lényege, hogy a tenyészőkúp csúcsi részéhez egy jól elkülönülő kerületi merisztématáj, a kizárólagosan antiklinális falakkal osztódó, egy vagy több sejtsoros tunika, s ez alatt a minden irányban osztódó központi merisztéma, a korpusz található. Az elmélet – részben az in vitro merisztématenyésztés eredményeinek hatására – módosult. Eszerint a tunika és a korpusz iniciális anyasejtjeinek csoportján kívül a kétszikűek hajtástenyészőkúpjában további, legalább 5 iniciálissejt-csoport működik (prokambium iniciális, protoderma iniciális, kéreg iniciális, szubprotoderma iniciális és bélsugár anyasejtek), amelyekből a hajtáscsúcs további merisztémazónái alakulnak ki (átmeneti merisztéma, bélmerisztéma, oldalmerisztéma, protoderma és prokambium, 5/2. ábra).

Kép

5/2. ábra: Zárvatermők hajtáscsúcs-merisztémájának vázlatos anatómiai ábrázolása. ti – tunika- (protoderma-), iniciális ki – kéreg iniciális, bas – bélsugár-anyasejtek, pk – prokambium, om – oldalmerisztéma, pki – prokambium iniciális, pt – protoderma, km – kéregmerisztéma, bm – bélmerisztéma

A belső alaktani elmélet fejlődése tehát egyre jobban közelít az in vitro tenyésztés által felvetett gondolathoz, nevezetesen, hogy az apikális merisztémában hol helyezkednek el az osztódó, illetve az organogén régiók. Ez utóbbi szempontból a zárvatermők hajtásmerisztémája három fő részre osztható (5/3. ábra):

Kép

5/3. ábra: Zárvatermők hajtáscsúcs-merisztémájának a szövettenyésztés szempontjából legfontosabb régiói 1 – centrális zóna (merisztéma iniciális), 2 – organogén zóna (oldalmerisztéma), 3 – bélmerisztéma

1. Csúcsi axiális zóna (centrális zóna), amelynek mitotikus aktivitása kicsi, általában vastagfalú, a sejtmegnyúlás fázisában levő vakuólumos sejtekből áll.

2. Oldalmerisztéma, amely apró, citoplazmával telt merisztémasejtekből áll. Ez az ún. iniciális gyűrű (iniciális hélix), amelynek sejtjei intenzíven osztódnak. Az in vitro morfogenezis szempontjából a legorganogénebb területnek tekinthető, egyben a levélprimordiumok organizációs helye is.

3. Bélmerisztéma, amely a centrális zóna alatt helyezkedik el. Ez a terület általában a virágindukcióig inaktív.

5.2. Merisztématenyésztés

A merisztématenyésztés mint kifejezés – sajnos a szakmai körökben is – a mikroszaporítás szinonimájaként használatos. Ez több szempontból is téves, mert a merisztémakultúra nemcsak mikroszaporításra, hanem vírusmentesítésre, fenntartásra, fagyasztásra és sok más kísérleti célra is használható. Helytelen továbbá azért is, mert a mikroszaporításnak a merisztémakultúrán kívül más módszerei is vannak (hajtástenyésztés, járulékoshajtás-differenciálás, szomatikus embriógenezis stb.). Ma már nem tévedünk, ha azt állítjuk, hogy a mikroszaporítás konkrétan nem is merisztématenyésztést jelent. A merisztématenyésztés nem több, mint néhány mikroszaporítási módszer első lépése (tenyészetek indítása), amelyet a szaporítás során többet nem kell alkalmazni. Ezen indokok alapján a merisztématenyésztés úgy tekintendő, mint a mikroszaporítás, a vírusmentesítés, és a tartós megőrzés céljából létesített tenyészetek indítására alkalmazott in vitro módszer.

A nyitva- és zárvatermő növények földfeletti részeinek növekedése a csúcsmerisztémákban lejátszódó osztódások, sejtmegnyúlás és differenciálódás következménye. A merisztéma átmérője átlagosan 0,1 mm, hoszszúsága 0,25–0,3 mm.

A növény élete folyamán az első apikális merisztéma az embrióban alakul ki, és általában a növény egész élete folyamán megtartja növekedését és fejlődését. Az apikális merisztémák megtartják továbbá totipotenciájukat is, amely a merisztématenyésztés egyik elvi lehetőségét adja. A másik lehetőség a merisztematikus sejtek feltételezett genetikai stabilitása, amely az identikus klónozás alapja.

A merisztématenyésztés a generatív és a vegetatív úton szaporított fajoknál egyaránt alkalmazható módszer, amelynek sikerét a következőkben tárgyalt főbb körülmények befolyásolják.

Merisztémaizolálás

a) A generatív úton szaporított fajoknál a sterilizált és sterilen csíráztatott magvakból fejlődő 4–5 napos hajtásokból általában 0,2–0,5 mm hoszszúságú apikális merisztémákat kell kipreparálni, steril körülmények között, sztereomikroszkóp alatt. A leggyakrabban használt táptalajok az MS és a B5 szilárd változatai. A hajtás- és a gyökérfejlődést különböző komplex serkentőkkel, növekedésszabályozó anyagokkal és a tenyésztési feltételekkel lehet befolyásolni.

b) A vegetatív úton szaporított fajoknál, fajtól függően, hajtásmerisztémákat izolálhatunk fejlődő hajtásból (burgonya), hajtás hónaljrügyből (dísznövények), hajtásrügyből (gyümölcsfajok) stb.

A csúcsmerisztéma mérete a tenyésztés kritikus pontja. Az izolálható merisztéma mérete a fajtól és a tenyésztési céltól függ. Vírusmentesítéskor azt a legkisebb méretet kell választani, amelyből még növényt tudunk felnevelni. Ez a méret a manióka esetében 0,2 mm, a szója esetében 0,4 mm. E méretek alatt a merisztémák elkalluszosodnak, illetve csak gyökereket regenerálnak. E méretek felett a hajtás regenerálása általában nem jelent nehézséget.

Táptalaj. A legáltalánosabban használt táptalaj az MS és a B5, amelyet 0,6–0,8% agarral szilárdítanak. Azoknál a fajoknál, amelyek viszonylag nagy mennyiségű fenolvegyületet vagy pigmentet választanak ki a táptalajba, folyékony tápoldat alkalmazása célszerű. Ez utóbbi esetben a növekedésserkentők koncentrációit csökkenthetjük. Az optimális pH 5,6–5,8 között van.

Növekedésserkentő anyagok. A merisztémák proliferációja, a hajtásfejlődés általában az auxinok és a citokininek megfelelő arányának a függvénye. Mivel az izolátum endogén hormontartalma és annak változása a tenyésztés folyamán nem ismert, az irodalomban javasolt koncentrációk csak megközelítő adatul szolgálhatnak. Ezért most csak felsoroljuk azokat az anyagokat, amelyekkel kedvező eredményeket értek el: naftilecetsav, indolecetsav, indolvajsav, gibberellinsav, benziladenin, zeatin és kinetin.

Tenyésztési feltételek. Általánosan a tenyészeteket 26 °C-on, 16 órás megvilágítással, 3000–4000 lux fényintenzitáson inkubálják. A növényregenerációt növelni lehet a hőmérséklet változtatásával. A fényben alkalmazott 20–26 °C-kal szemben sötétben 15 °C-ra célszerű csökkenteni a hőmérsékletet. A hajtásindukciót a kék, a gyökérfejlődést a vörös fény stimulálja.

5.3. Rejuvenilizáció

A donor növényekről származó merisztémák morfogenetikai potenciálja a növény egyedfejlődésének különböző szakaszaiban, illetve szezonálisan változhat. A szezonalitás a donor növények kontrollált körülmények közötti nevelésével (fitotron) kiküszöbölhető. Az egyedfejlődés korai, intenzív vegetatív növekedési szakaszában az izolált merisztémák általában sokkal jobban regenerálnak, mint a virágzáskori vagy az azt követő szakaszban.

Fás növények mikroszaporítása során bebizonyosodott, hogy a teljesen kifejlett (termőre fordult) növényekről izolált tenyészetek lassú növekedést, rossz gyökeresedést és néha eltérő fenotípust is mutatnak. Napjainkban a fás növények mikroszaporításának egyik legnagyobb akadályát a felnőtt korú és termőrefordult fák izolátumainak rossz tenyészthetősége jelenti. A problémát a fák, vagy tenyészetek visszafiatalításával vagy más néven rejuvenilizálásával próbálják megoldani.

A fás növények termőre fordulása (maturation) átmeneti folyamatot jelent, mely során a fiatal növényekből termőképes fák lesznek. E folyamat során a fás növényekben morfológiai és fiziológiai változások következnek be, melyek végeredménye a termőképesség (termőre fordulás). Ezek a változások különösen a hajtásmerisztémákban kifejezettek. A Sequoia és Hedera fiatalkori hajtáscsúcsainak – az idős fákkal szemben – kisebb a merisztematikus zónája, a csúcssejtek nagyobbak, a sejtek a hajtáscsúcs egész felületén osztódnak és több levélkezdemény alakul ki stb.

A juvenilis fázis – leegyszerűsítve – addig tart, ameddig a növény virágozni nem kezd. A juvenilis szakasz hosszúsága növénycsoportonként különböző. Legrövidebb az egyéves lágyszárú növényeknél és folyamatosan nő a következő sorrendben: évelő lágyszárú növények, cserjék és végül leghosszabb a fák esetében.

Biotechnológiai értelemben a rejuvenilizálódás (visszafiatalodás) azt jelenti, hogy az in vitro tenyészetek elveszítik a kifejlett fákra jellemző tulajdonságaikat. Ez a változás azokban a járulékos hajtás-, illetve sejttenyészetekben következett be, melyekben a szaporítást dedifferenciálódás előzte meg.

Genetikai szempontból a fák termőrefordulása (maturation), illetve a felnőtt fák visszafiatalítása (rejuvenation) tulajdonképpen csak génexpresszió változást jelent és nem magukban a génekben következik be változás. A génműködés szabályozásának megváltozása viszont nem öröklődő genetikai, hanem epigenetikai módosítást jelent. A dedifferenciálódást majd redifferenciálódást igénylő in vitro technikák esetében az izolátum eredeti sejtjeiben törlődik az izoláláskori génregulációs mintázat. Ezt követően a szomatikus embriógenezisnek, illetve organogenezisnek (járulékos hajtástenyészetek) megfelelő gének kapcsolnak be. Ilyen értelemben egy új élet indul, mely természetesen juvenilisnek tekinthető. Azokban a tenyészetekben viszont, melyekben ezek a folyamatok nem következnek be, mint pl. merisztématenyészet és hajtáskultúra, a ,,maturation” okozta problémák továbbra is fennmaradnak. A növekedési erély rövidebb vagy hosszabb ideig visszaállhat a tenyésztési feltételek és a táptalajhoz adagolt hormonok hatására, de ez a problémát tartósan nem oldja meg.

Összefoglalva, a felnőtt fák izolátumai a tenyészetekben járulékos embriógenezissel (szomatikus embriótenyésztés) vagy járulékos organogenezissel (járulékos hajtástenyésztés) visszafiatalíthatók. Maga a folyamat epigenetikai változást jelent, viszont a tenyésztett sejtek genetikai instabilitása miatt az ilyen típusú tenyészetekben tényleges genetikai változások következhetnek be (lásd szomaklonális variabilitás, 6.1 pont).

E két módszert sikerrel alkalmazták a tenyészetek visszafiatalítására az alábbi fajokon (AH=adventív hajtás, SE = szomatikus embrió):

Asparagus officinalis AH

Betula pendulaA H

Brassica spp. AH

Cardamine pratensis AH

Citrus spp. SE

Coffea arabica SE

Elaeis guineensis SE

Eucalyptus longan SE

Hedera helix AH

Larix spp. AH

Malus domestica AH

Musa spp. AH

Myriophylium heterophyllum AH

Phoenix dactylifera AH

Populus ciliata SE

Prunus cerasus SE

Pyrus communis AH

Quercus petraea SE

Sequoia sempervirens AH

Thuja plicata AH

Vitis vinifera SE

5.4. A mikroszaporítás módszerei

A vegetatív mikroszaporítás fő technikái napjainkra kialakultak és az üzemi technológiák részévé váltak. A steril technikák egyes lépései fajonként, fajtánként, szaporító laboratóriumonként változhatnak, és a kisebb-nagyobb eltérések miatt az összkép rendkívül gazdag.

Egyes technikai lépések vagy egész technológiák szabadalmakat és know how-kat jelentenek, ezért jórészt titkosak. A könyv terjedelme nem teszi lehetővé, hogy a legfontosabb növénycsoportokra, -fajokra kidolgozott módszereket részletesen ismertessük. A következőkben a legújabb összefoglaló munkákat soroljuk fel, amelyekben ezek megtalálhatók: Vasil (1984), Conger (1986), Whithers és Anderson (1986) Green et al. (1987), Bajaj (1991, 1992 a,b,c, 1997a,b).

Bármilyen növénycsoporttal, illetve fajjal is dolgozunk, a mikroszaporítás négy jól megkülönböztethető tenyésztési eljárásra alapulhat és ötféle módon történhet (5/4. ábra).

Kép

5/4. ábra: A mikroszaporítás módszereinek csoportosítása a szaporításra használt izolátum alapján

Hajtástenyészetek. Általában merisztéma izolálással indulnak, és a szaporítást az in vitro fejlődött hajtásokon kialakult hónaljrügyekkel, illetve a fejlődő hajtásokkal végzik.

Járulékos hajtástenyészetek. A növény szöveteinek izolálásával indulnak, a szaporítás – kalluszfázison keresztül – a differenciálódó hajtásokkal vagy oldalhajtással történik.

A járulékos szervtenyészetek általában valamilyen primer hajtástenyészetből indulnak. A cél a járulékos szervek differenciálódása (pl. gumó, hagyma stb.), melyekkel a szaporítás történik.

Szomatikus embriógenezis. A növény szöveteinek, sejtjeinek tenyésztésével indul. A szaporítást a sejtszuszpenzióban indukált és fejlődött szomatikus embriókkal végzik.

A következőkben a hajtástenyésztést, a járulékos hajtás- és szervtenyésztést mutatjuk be. A szomatikus embriógenezist a Mesterséges mag (5.9) c. fejezetben részletezzük.

5.4.1. Hajtástenyésztés

A hajtástenyészet általában gyökér nélküli hajtások növekedését és fejlődését jelenti táptalajon, steril és kontrollált feltételek között. Az izolátumok merisztémáiból közvetlenül hajtások fejlődnek.

A mikroszaporítás a tenyészetekben fejlődő hajtásokon, illetve az azok levélhónaljában differenciálódó rügyeken alapul.

A hajtástenyészetek legfontosabb jellemzője, hogy a tenyésztés folyamán a hajtások normális növekedését tartjuk fenn, illetve serkentjük. Tehát nincs de-, illetve redifferenciálódás. Napjainkban a hajtástenyésztés és a mikroszaporítás az in vitro génbank legáltalánosabban használt módszerévé vált, mind a kertészeti (dísznövények, gyógynövények és burgonya), mind az erdészeti fajok között. Néhány fontosabb nemzetség a következő: Anthurium, Chrysanthemum, Dianthus, Fuchsia, Gerbera, Gloxinia, Phlox, Saxifraga, Allium, Asparagus, Rheum, Fragaria.

Inokulum

A hajtástenyészeteket általában merisztémát tartalmazó explantátumokból (embrió, mag, hajtáscsúcs, nódusz) indítjuk. A magvak steril csíráztatása során fejlődő hajtásokat, illetve csíranövényeket általában a hipokotilnál, illetve az epikotilnál vágjuk el és helyezzük táptalajra. A hajtáscsúcsból vagy hónaljrügyből a merisztémákat kell kipreparálni; méretük elérheti az 5 mm-t is. A ,,természetes” izolátumok mellett létesíthetünk hajtástenyészeteket olyan in vitro kultúrákból is, amelyekben embriók, illetve hajtáscsúcsok differenciálódtak. Ez utóbbiak szolgálhatnak a hajtástenyészetek kiinduló izolátumaként.

Táptalaj és tenyésztési feltételek

A hajtástenyészetek leggyakoribb táptalaja az MS, de jó eredményeket értek el a White, LS-, B5-, N6 és SH-tápközegekkel is. Az általánosan használt kiegészítések a tiamin és a mezoinozit. Az inkubáció átlagos jellemzői: 8000 lux, 16 órás megvilágítás, 18–30 °C-os hőmérséklet.

Szaporítás

A szaporítás az in vitro fejlődött hajtásokkal, oldalhajtásokkal, illetve azok hónaljrügyeit tartalmazó nodális szegmentekkel történik. Az átoltások gyakorisága 3–5 hét, amely a szaporítási ciklusban 10 napra is csökkenhet. Fás növényeknél a csúcsdominanciát meg kell szüntetni ahhoz, hogy a hónaljrügyek kihajtsanak, majd a szaporítást a fejlődött oldalhajtások átoltásával végzik.

Genetikai szempontból a változások valószínűsége a hónaljrügyek és a hónaljhajtások esetében a legkisebb, tulajdonképpen a spontán rügymutáció szintjén tartható. A veszélyt a hajtástenyészetek alapi részén kialakuló interkaláris kallusz jelentheti. Az ezekből regenerálódott ,,járulékos” hajtások genetikai azonossága – a kalluszsejtek genetikai instabilitása miatt – már megkérdőjelezhető. A genetikai változások bekövetkezésének valószínűsége a tenyészetek öregedésével növekszik.

Az a tény, hogy a tenyészetekben a hajtások és a levelek morfológiája jelentősen eltérhet a faj-, illetve a fajtabélyegektől, önmagában nem jelent genetikai változást. E modifikációk általában epigenetikaiak, és az eltérő élettani környezet által meghatározottak. Ezekben az esetekben a növények a kiültetést követő néhány hét után (pl. burgonya) általában már a megfelelő fenotípust mutatják. Ez az idő azonban néha 1–2 év is lehet (pl. szőlő).

Gyökereztetés

A felszaporított hajtásokat a kiültetés előtt gyökeresíteni kell. Erre azért van szükség, mert az intenzív hajtásfejlődéshez szükséges kiegészítések általában gátolják a gyökerek differenciálódását és növekedését. Sok esetben a gyökeresedés hormonelvonással egyszerűen kiváltható, más esetekben gyökeresítő kiegészítések (pl. naftilecetsav, indolvajsav stb.) szükségesek. Abban az esetben, ha a gyökeresítés sem in vitro, sem in situ nem sikerül, egyetlen megoldás marad, az oltás.

Alkalmazás

A hajtástenyészet viszonylag egyszerű és megbízható technika, mely a többi módszerhez képest genetikailag a legstabilabb klónozást biztosítja. Az eltérő színű virág megjelenésének gyakorisága a gerbera in vitro növényeiben 1:5000 és 1:500000 között van, genotípustól függően.

5.4.2. Járulékos hajtástenyésztés

A járulékos hajtástenyészetek annyiban térnek el a klasszikus hajtástenyészetektől, hogy a hajtásregenerálódás nem az eredeti inokulumokból, hanem a belőlük fejlődött kalluszból történik.

Szomatikus növényi tenyészetekben a tenyésztett sejtekből, szövetekből a növényregenerálásnak kétféle alternatív útja lehet, az organogenezis és az embriógenezis. Elvben mindkettő felhasználható mikroszaporítási célokra. A járulékos hajtástenyészetek organogenezissel alakulnak ki.

Az organogenezis a növényregenerálás leggyakoribb útja, amely nemcsak izolált sejtből, hanem különböző szervekből és szövetekből is indukálható. A mikroszaporítási felhasználás szempontjából a járulékos hajtásfejlődésre alapozott technika a meghatározó, amely a következő főbb szakaszokra osztható:

− a hajtáscsúcs differenciálódásának indukciója;

− a hajtáscsúcsok fejlődése és sokszorozódása;

− a hajtások gyökereztetése.

Természetesen a különböző fajok és felhasználási célok alapján jelentős eltérések lehetnek a módszerekben, ezért az általános érvényűeket ismertetjük.

Inokulum

Tulajdonképpen a növények minden olyan része használható inokulumként, amely merisztéma-, kambiális, parenchima- stb. szövetet tartalmaz. A leggyakrabban használt izolátumok a következők: levél-, szár- vagy gyökérszegmentum, virágrészek, embriók, sziklevél, epikotil, hipokotil stb. Minél fiatalabbak ezek a szervek, annál könnyebb a szervdifferenciálódás indukciója.

A tenyészetek indításának kritikus pontja a sterilitás. Ennek biztosítása azért is nehéz, mert általában viszonylag nagy és in situ fejlődött, tehát ,,fertőződött” növényi részeket kell sterilen táptalajra helyezni. A különösen nehezen sterilizálható részeket célszerű rövid ideig antibiotikumot, illetve fungicidet tartalmazó táptalajon tenyészteni. Kórokozókkal (vírus, baktérium, gomba) fertőzött izolátum esetén a tenyészetek is vírusfertőzöttek lesznek, ezért a mentességre, illetve mentesítésre különösen kell ügyelni.

Táptalaj

A leggyakrabban használt táptalajok közül a legrégebbiek, a White-1943, Heller-1953, továbbá a megnövelt sókoncentrációjú MS és annak különböző módosított változatai, így a B5 és az SH érdemelnek említést. Az organogenezis sikeres indukciója és a hajtások normális fejlődése céljából a táptalajoknak tartalmazniuk kell:

− makro- és mikroelemeket (MS, B5);

− szén- és energiaforrást (szacharóz 2–4%) ;

− vitaminokat (tiamin, nikotinsav, piridoxin stb.) ;

− redukált formájú nitrogént (kazeinhidrolizátum, glutamin, adenin stb.);

− növekedésserkentőket és -gátlókat (2,4-diklórfenoxi-ecetsav, naftilecetsav, indolecetsav, indolvajsav, benziladenin, kinetin stb.);

− komplex kiegészítéseket (pl. kókuszdiótej 2–15%).

Az eddigi tapasztalatok azt bizonyítják, hogy a járulékos hajtásfejlődésre legnagyobb hatással a növényi hormonok vannak. A vizsgált növényfajok csaknem 75%-ában a hajtásdifferenciálódást a citokininek (kinetin és benziladenin) 0,05–46 µM-os, az auxinok (indolecetsav, naftilecetsav) 0,06–0,27 µM-os koncentrációtartományában lehetett sikeresen indukálni. Az egyszikű növények hajtásindukciójához általában kisebb citokinin koncentráció szükséges.

Különböző fajoknál sikerrel használták a purinokat, a pirimidineket, az ureát, a gibberellinsavat, abszcizinsavat, fólsavat stb. a hajtásdifferenciálódás kiváltására, illetve fenntartására.

A fejlődő hajtások gyökereztetéséhez általában az indolvajsav és a naftilecetsav használható sikerrel.

Exszudátumok okozta nekrózis

Számos zárvatermő faj izolátuma megbarnul, vagy belőle nagy mennyiségű exszudátum diffundál a táptalajba. Ennek gyakori következménye az izolált szövet részleges vagy teljes elhalása. Ez a probléma a következő módszerekkel küszöbölhető ki:

– az explantátum izolálás előtti áztatása antioxidánsok (aszkorbinsav, citromsav, cisztein, glicin) oldatában;

– a táptalaj kiegészítése egy vagy több antioxidánssal 1 µM – 10 mmol koncentrációban, amelyet a tenyésztés folyamán az izolátumok rendszeres átoltásával folyamatosan csökkentünk;

– a tenyésztés elején a táptalaj kiegészítése aktív szénnel (3%), amelyről az izolátumokat aktív szénmentes táptalajra kell átoltani, mivel a táptalaj néhány fontos komponensét (cukor, hormon) is megköti. Ennek ellenére néhány fajnál állandó kiegészítésként, kis koncentrációban alkalmazott aktív szénnel jelentősen serkenthető a járulékos szervek fejlődése;

– folyékony táptalaj használata és gyakori cseréje.

Tenyésztési feltételek

Leggyakrabban 0,6–1% agarral szilárdított táptalajt használnak. A folyékony táptalaj általában lassú rázatást igényel, és pH-ja alacsonyabb (5,0) a szilárd változat pH-értékénél (5,8).

A tenyészetek nagy relatív páratartalmát és a bizonyos mértékű folyamatos steril légcserét általában nem nehéz elérni a megfelelő záró eszközök (vatta, alumíniumfólia, parafilm, háztartási fólia, műanyag tető stb.) felhasználásával. Célszerű azonban a tenyésztőhelyiségben – a fertőzések kiküszöbölése végett – száraz légteret biztosítani.

A különböző gázok (etilén, széndioxid, acetaldehid) koncentrációjának növekedése a tenyészetekben – megfelelő gázcsere hiányában – általában gátolja a morfogenezist.

A megvilágítás nagyon fontos tényező, különösen a szervdifferenciálódás időszakában. A gyökérfejlődéshez és a kallusztenyésztéshez vagy sötét, vagy gyenge világítás (néhány száz lux) szükséges. A többi tenyészet általában igényli a megvilágítást. Hatása függ az erősségtől, az időtartamtól és a spektrális összetételtől. Az organogenezis folyamán 1000–3000 lux, a hajtástenyészetek edzésekor 3000–10 000 lux fényerősség a célszerű. Általában megfelelő a 16 órás megvilágítás. A fény minősége annál jobb, minél jobban megközelíti a természetes fény összetételét. A kék tartomány inkább a differenciálódási folyamatokat, a vörös pedig a megnyúlást serkenti.

A tenyésztés optimális hőmérséklete fajonként és a tenyésztés céljától függően változik, általában 20–30 oC között van.

Szaporítás

A járulékos hajtásokkal, oldalhajtásokkal, vagy egy- esetleg többrügyes hajtásdarabbal történik, hasonlóan a klasszikus hajtástenyészetekhez. A genetikai megváltozás nagyobb valószínűsége a járulékos hajtásfejlődésre alapozott szaporítás során a következőkkel magyarázható. Az organogenezis sejtszinten redifferenciálódást jelent. Ahhoz, hogy a redifferenciálódást indukálni lehessen, differenciálatlan sejtekre van szükség. Az izolátumban tehát először dedifferenciálódásnak kell bekövetkeznie. A dedifferenciálódás, a differenciálatlan sejtes állapot és a redifferenciálódás folyamán pedig gyakoriak a genetikai változások.

Növényregenerálás

Az organogenezis az egyik leggyakoribb formája a növényregenerálásnak. Napjainkban talán az ezret is elérte azoknak a fajoknak, genotípusoknak a száma, amelyeknek szomatikus szövetéből, szervéből járulékos hajtásfejlődéssel növényt regeneráltak.

Ezekre az eredményekre a gyakorlati alkalmazás ismertetésekor még visszatérünk. Részletes faj- és fajtaszintű felsorolások a dísznövényekre, a gyümölcsfajokra, a zöldség- és szántóföldi növényekre, továbbá az erdei fás növényekre vonatkozóan CONGER (1986) és JÁMBORNÉ (1993) összefoglaló munkájában találhatók.

5.4.3. Járulékos szervtenyészetek

A járulékos szervtenyészetek mint másodlagos tenyészetek a hajtástenyészetekre alapulnak. A szervek egy része ugyanis módosult hajtás, tehát in vitro is csak hajtások felhasználásával indukálható. A szaporítás az in vitro fejlődött szervekkel (protokorm, hagyma, gumó) történik. A legismertebb így szaporított fajok az orchideák, a fokhagyma és a burgonya.

Protokorm tenyészet

A mikroszaporítás története tulajdonképpen a járulékos szervek in vitro differenciálásával kezdődött. Az orchideák mikroszaporítása folyékony táptalajban fejlődött protokormokkal történt és történik. A protokorm tulajdonképpen sok rügyet, rügykezdeményt tartalmazó aggregátum, mely folyékony tenyészetben differenciálódik. A szaporítás a protokormok feldarabolásával és tenyésztésével történik. Végül a protokorm rügyeiből szilárd táptalajon hajtások fejlődnek. Abból a célból, hogy a folyékony tenyészeteken ne fejlődjenek hajtások vagy levelek, célszerű a táptalajba növekedésgátlókat adagolni. A protokorm-típusú mikroszaporítás kivitelezhető bioreaktorban is, mellyel jelentős költségmegtakarítás érhető el (pl. Gladiolus).

Mikrogumó előállítás

A burgonya mikrogumó differenciálódás folyamata és technikája a 3.5.2 fejezetben ,,A járulékos szervek differenciálódása” cím alatt került bemutatásra. Ezért itt csak a mikroszaporítási alkalmazására térünk ki.

A mikrogumóval (1 cm átmérő) való szaporítás előnyei a következők:

  • a mikrogumók bármikor előállíthatók,

  • kórokozómentes inokulum esetén garantáltan kórokozómentes szaporítást biztosít a visszafertőződés veszélye nélkül,

  • a mikrogumók hónapokig tárolhatók és

  • könnyen szállíthatók.

Mikrohagyma előállítás

A hagyma differenciálódást a fokhagyma tenyészetek 4-6 hónapos hidegkezelésével (4 oC) lehet kiváltani.

A hagymák kialakulása a fokhagyma hajtástenyészetekben általában a tenyésztés 2–15. hónapjában következik be. Optimális tenyésztési feltételek esetén ez az idő 2–4. hónapra csökkenthető. A hagymák fejlődését a magasabb hőmérséklet (25 oC), erősebb megvilágítás és nagy szacharóz koncentráció (12%) is gyorsítja.

A növényi növekedésszabályozóknak nincs hatása az indukcióra, velük a fejlődő hagymák mérete és száma befolyásolható.

Az in vitro fejlődött hagymák nyugalmi periódust igényelnek. A kisebb hagymák (150 mg alatt) 1 hónapos, 4 oC-on való tárolás után is csíráztak. A 150 mg feletti hagymák nyugalmi periódusának megszakítása 2 hétig 35 oC-on, 2 hétig 20 oC-on, majd 4 hétig 4 oC-on való tartással érhető el.

Az in vitro hagymákkal való szaporításnak a vírusmentes fokhagyma szaporítóanyag tömeges előállításában van jelentősége. Előnye, hogy közvetlenül vethető a földbe, mert nem igényel akklimatizációt. Az in vitro hagymával a szántóföldi termelés ezért olcsóbb, mint in vitro növényekkel. A hagyományos technológiával szemben hátránya az, hogy az in vitro fejlődött hagymák kisebbek, mint a kereskedelmi szaporításban használatosak és előállításuk drágább. Ezért üzemi felhasználásuk a következő években nem várható.

5.5. Kórokozó-mentesítés

A kórokozó-mentesítés fertőzött növényekből vírus-, baktérium- és gombamentes növények előállítását jelenti hagyományos (hőkezelés, kemoterápia) és biotechnológiai (merisztématenyésztés) módszerekkel, illetve azok kombinált felhasználásával (5/5. ábra).

Kép

5/5. ábra: Kórokozó (vírus) mentes növény előállításának módszerei

Az egészséges növényanyag előállítása különösen a vegetatív úton szaporított szántóföldi (burgonya, csicsóka), kertészeti (gyümölcsfajok) és erdészeti fafajok esetében általában nehézségekbe ütközik. Ennek oka, hogy a kórokozók a fertőzött növények szaporításra használt vegetatív részeiben is jelen vannak. Tehát klónjaik elvben 100%-ban fertőzöttek lesznek, ami jelentős terméskieséssel járhat. Ezért különös jelentőségű a szaporítás kiinduló anyagául szolgáló növények vírus-, baktérium- és gombamentesítése és a mentesség pontos diagnosztizálása.

A maggal szaporított növényeknél, az esetek többségében ez azért nem olyan nagy horderejű probléma, mert az ismert vírusok többsége maggal nem terjed. Ez azt jelenti, hogy a vírusfertőzött növények magjaiból kelt csíranövénykék nagy valószínűséggel vírusmentesek lesznek.

Természetesen ez a probléma nem újkeletű, és ennek megfelelően megoldására különböző technikákat (pl. hőterápia) dolgoztak ki és alkalmaztak. A biotechnológiai mentesítési és diagnosztizálási technikák áttörést jelentettek és jelentenek e területen. Felhasználásukkal lehetővé válhat vírusmentesítési nemzeti programok realizálása a legfontosabb fajoknál, törzsanyagok, törzsültetvények kórokozó-mentesítése, kórokozómentes felszaporítása, a kórokozómentes nemzetközi szaporítóanyag-kereskedelem stb.

A kórokozó-mentesítés két fő területre osztható, mentesítésre és diagnosztizálásra. Mivel a diagnosztizálás kivitelezése nem tartozik a biotechnológiai eljárások közé, ezért azokkal e könyvben nem foglalkozunk.

A mentesítés technikái a kórokozók eltávolítását, a diagnosztizálás technikái pedig a mentesség, illetve a fertőzöttség pontos meghatározását teszik lehetővé a kórokozó detektálásával és azonosításával.

A mentesítés módszerét tulajdonképpen különböző vírusokra dolgozták ki, ezért a közhasználatban a vírusmentesítés kifejezés terjedt el. A vírusmentesítés nagy valószínűséggel baktérium- és gombamentességet is jelent, tehát teljes kórokozó-mentességgel járhat.

A növényeket károsító vírusok egy része nem okoz tüneteket, és a jelenlegi módszerekkel nem mutatható ki. Tehát amikor vírusmentességről beszélünk, az mindig az ismert vírusoktól való mentességet jelenti. Szakmai szempontból talán helyesebb lenne ezért a vírusmentes kifejezés helyett a vírustesztelt növények terminológiát használni.

A vírusmentesség nem jelent immunitást a vírusokkal szemben. A mentesített állomány ellenállóképessége, illetve fogékonysága a kórokozókkal szemben e módszerek hatására elvben nem változik. Azért csak elvben, mert előfordult, hogy a vírusmentes növények fogékonyabbá váltak a gombás fertőzésekre. A burgonya esetében megfigyelték, hogy az X- és Y-vírustól mentes állományban a gumók Fusarium-ellenállósága csökkent a vírusfertőzöttekéhez képest.

A vírusmentesítés módszerei

A jelenleg alkalmazott terápiákat a hőkezelés, a merisztématenyésztés, az antivirális anyagok, illetve ezek kombinált felhasználása jelenti.

5.5.1. Hőkezelés

A hőterápia a fertőzött növényeknek, illetve azok különböző vegetatív részeinek inkubációját jelenti a vírusok számára kritikus (36–52°C) hőmérsékleten. Hatására a kezelt anyagokban a vírus részlegesen vagy teljesen eliminálódik, illetve inaktiválódik.

A hőkezelés (30 percig 50–52 °C-os vízben) kedvező hatásáról elsőként cukornádnál számoltak be a múlt század kilencvenes éveiben. A 20. század első évtizedeiben sikerrel alkalmazták a módszert különböző gyümölcsfajoknál. Ebben az időben bizonyították be, hogy a rövid ideig tartó 50 °C-os vízben való áztatás helyett eredményesebb, és a növényeket kevésbé károsítja a 35–38 °C-os léghőmérsékleten való hosszabb ideig (2–4 hét) tartó kezelés. Ezek a kísérletek azonban még csak feltételezték a hőkezelés virológiai következményeit.

Az első tényleges bizonyítékot a burgonya levélsodródás vírus (PLRV) hőkezeléssel kiváltott inaktivációja jelentette a burgonyagumókban az 1950-es években. Azóta 100-nál is több azoknak a vírusoknak a száma, melyekkel szemben sikeres hőkezelésről számoltak be a világon.

Az elmúlt évtizedek kutatásai azonban bebizonyították, hogy hőkezeléssel csak az izometrikus vírusok eliminálhatók, a nem izometrikusak kevésbé vagy egyáltalán nem (pl. dohány–mozaikvírus). A sikeres terápia megfelelő hőmérséklete 35–40 oC között változhat, időtartama pedig néhány naptól néhány hónapig tarthat.

A vírusok legkönnyebben a hajtáscsúcsból eliminálhatók. Gyümölcsfajoknál a kezelést követően a hajtáscsúcsokat célszerű gyökereztetni, vagy vírusmentes alanyra oltani.

A hagyományos hőterápia tehát eljutott a hajtáscsúcs kezelésig. A kezelt ,,merisztémák” in vitro gyökereztetése, illetve oltása azonban csak a növényfajok egy részénél alkalmazható. Kézenfekvő volt tehát, hogy azt az évszázad második felében a gyorsan fejlődő in vitro technikákkal kombinálják. Ezek közül különösen a merisztématenyésztés jelentett kapcsolódási lehetőséget, amely azonban hőkezelés nélkül is alkalmas bizonyos vírusoktól való mentesítésre.

5.5.2. Hidegkezelés

A hőkezelés eredménytelennek bizonyult a burgonya borsós gumójúságát okozó viroiddal (PSTVd) szemben. Az utóbbi években előrehaladást jelentett az a felismerés, hogy a viroid koncentrációja függ a hőmérséklettől és a fényintenzitástól. Fertőzött burgonyahajtásokban a viroidok mennyiségét sikerült a kimutathatósági szint alá csökkenteni, ha a hajtásokat 3–6 hónapig 5 °C-on nevelték. A teljes elimináció azonban csak akkor volt sikeres, ha a fertőzött növényeket 6 hónapig 5 oC-on nevelték, majd a kezelt hajtásokból merisztématenyészeteket létesítettek. A merisztématenyésztéssel kombinált hidegkezelés végeredményben lehetőséget adott a viroidmentesítésre. A módszer további tökéletesítését jelentheti a jövőben a fényintenzitás csökkentése a tenyésztés során, mert a viroidkoncentráció – hasonlóan a hőmérséklet hatásához – arányban áll a fényintenzitással is.

5.5.3. Merisztématenyésztés

A merisztématenyésztés történetét, fontosabb módszertani kérdéseit, eredményeit az előzőekben már tárgyaltuk. Ezért e helyen csak a vírusmentesítési célból történő alkalmazás speciális kérdéseire térünk ki.

WHITE 1943-ban dohány–mozaikvírussal fertőzött, in vitro fejlődő dohány gyökérszegmentumok vizsgálata alapján arra a megállapításra jutott, hogy a tenyészőkúp vírusmentes. Később a hajtástenyészetek hajtáscsúcsain is igazolták ezt az eredményt. Erre alapozva állította fel elméletét a francia MOREL 1952-ben, amely szerint a vírusfertőzött növényekből a hajtáscsúcsok izolálásával és tenyésztésével a kiinduló növényekkel identikus, vírusmentes növények állíthatók elő. Feltételezését dálián sikerült bizonyítania. A merisztémákból fejlődő kis, gyökér nélküli hajtásokat vírusmentes növényekre oltva egészséges egyedeket kapott. Úttörő munkásságát követően a módszer széles körben elterjedt.

Azóta bebizonyosodott, hogy minél kisebb merisztémát izolálunk, annál valószínűbb a vírusmentesség. Az ideális méret a 0,1 mm átmérő és a 0,25 mm hosszúság. Ennek az izolátumnak a túlélése és gyökeresedése azonban nagyon csekély, illetve nagy a valószínűsége a kalluszosodásának, ezért a gyakorlatban a nagyobb izolátumok preparálása terjedt el.

Az elimináció azonban vírusfüggőséget és fajtafüggőséget mutat. A burgonya – egy levélprimordiumot is tartalmazó – merisztémái a levélsodródásvírustól általában 100%-ban mentesek, 70–80%-uk mentes továbbá az A- és az Y-vírustól, de nem mentesek az X- és S-vírusoktól.

Fajtafüggő eliminációt figyeltek meg a szamócánál, a krizantémnál és a szegfűnél. A víruselimináció hatékonyságát befolyásolja még az izolált merisztémák eredete (csúcsrügy, hónaljrügy), a szezonális hatás, a tenyésztési feltételek stb. is.

Összefoglalva megállapítható, hogy néhány vírus, mint pl. a burgonya levélsodródás vírusa, amely a merisztémákban nincs jelen, merisztématenyésztéssel is eliminálható. Vannak azonban olyan vírusok, melyek a 0,1 mm-nél kisebb merisztémákban is kimutathatók (pl. burgonya A-, Y-, X- és S-vírus). Ezek egy része szerencsés esetben a tenyésztés során eliminálódhat.

Víruselimináció az in vitro tenyésztés folyamán

A merisztémaizoláláson alapuló mentesítés a vírusok egyenlőtlen eloszlásán alapul a fertőzött növényekben. Ez a megállapítás azonban a vírusoknak csak egy részére vonatkozik. A 0,1 mm-nél kisebb merisztémacsúcsokban is jelen lévő vírusok eliminációjához más módszerekre van szükség.

Az első sikeres eliminációt a burgonya A- és Y-vírusa esetében figyelték meg a hetvenes években. Négyhetes tenyésztést követően elektronmikroszkópos vizsgálatokkal már nem lehetett vírusrészecskéket kimutatni a merisztéma 0,1 mm-nél kisebb csúcsi részében. Ebből arra következtettek, hogy a tenyésztés során a vírus eliminálódott, mely folyamatra jelenleg még nincs egyértelmű magyarázat.

Feltételezik, hogy maga az explantátum termel inaktiváló anyagot, de nem zárható ki a táptalaj egyes komponenseinek hatása sem. A jelenleg elfogadott nézet szerint a rendkívül kicsi merisztémákban az izolálás és a tenyésztés hatására a sejtek anyagcsere- és növekedési folyamatai megváltoznak. Ennek lehetséges következménye, hogy a vírus replikációjához szükséges feltételek módosulnak a sejtekben, ami a vírus szaporodásának gátlását eredményezheti.

5.5.4. Kemoterápia

A vírusokat szelektíven pusztító vegyületek jelenleg nem állnak a mezőgazdaság rendelkezésére. A különböző vírusok megjelenése és terjedése ezért is jelent különös veszélyt. A kemoterápia a fertőzött növényekben antivirális vegyületekkel próbálja a víruskoncentrációt csökkenteni, illetve a vírusok teljes eliminációját elérni.

Az antivirális vegyületek széleskörű felhasználásának jelenleg az a legnagyobb akadálya, hogy általában magát a növényi sejtet, illetve annak anyagcserefolyamatait is károsítják. Mivel a vírusok tulajdonképpen nukleinsavból (DNS, RNS) és fehérjéből állnak, az antivirális anyagok nem hathatnak másra, mint a nukleinsavakra vagy a fehérjékre, illetve ezek szintézisére. A használt vegyületek, a 8-azaguanin (purinanalóg), 5-fluorouracil és 2-tiouracil (pirimidin-analógok), a para-fluorofenilalanin sajnos nem vírusspecifikusan hatnak a sejtben lévő makromolekulák szintézisére. Magától értetődő, hogy a vírusszintézis gátlásával egyidejűleg a növényi sejt anyagcserefolyamatai (nukleinsav- és fehérjeszintézis) is jelentősen károsodnak.

A nyolcvanas években előrelépést jelentett egy szintetikus ribozidnak (nukleozid analóg), a virazolnak vagy más néven ribavirinnek az alkalmazása. Sterilen szűrve, 205 µM-os koncentrációban alkalmazva a fertőzött burgonyamerisztémák táptalajában, a 100%-os fertőzöttséget 9-29%-ra sikerült csökkenteni az X-, Y-, S- és M-vírusok esetében. Annak ellenére, hogy a virazol hatásával és alkalmazásával kapcsolatos néhány éves eredmények még ellentmondásosak, annyi bizonyos, hogy sikeres kezelés esetén a vírusok viszonylag széles spektrumára hat.

5.5.5. Kombinált kezelés

Továbbra is a burgonya példánál maradva, folytassuk ott a vírusmentesítést, hogy a burgonyán – mai ismereteink szerint – legalább 23 vírus és viroid okoz betegséget. Ezek közül a levélsodródás vírus (PLRV) hőkezeléssel, az A- és Y-vírus pedig 0,3 mm-nél kisebb merisztémák izolálásával és tenyésztésével eliminálható. Önmagában azonban egyik módszer sem alkalmas az X- és S-vírusok eliminálására.

A fertőzött hajtások 4-6 hetes hőkezelését követően, a hőkezelt hajtásokból izolált merisztémák tenyésztésével viszont ezektől a vírusoktól és egyéb hőrezisztens törzsektől mentes növényeket lehetett előállítani.

A kombinált alkalmazás kedvező eredménye azzal magyarázható, hogy a hőkezelés ideje alatt a vírus szaporodása lelassul, illetve gátolt. A növény azonban – ha lassan is – de tovább nő. Ennek következményeként a hajtásmerisztéma nagyobb (0,3–0,6 mm) része lesz vírusmentes. Ilyen méretű merisztémák már könnyen izolálhatók, és táptalajra helyezve kalluszosodás nélkül, 50–80%-os túléléssel intakt növénnyé nevelhetők.

A kombinált kezelés gyakorlati kivitelezése során a hőkezelésre általában gyökeresített, intenzíven fejlődő hajtásokat használunk. A hőkezelést klímakamrában célszerű kivitelezni, ahol napi 16 órán át, 36 oC-ot és 2000–4000 lux megvilágítást, majd 8 órán keresztül megvilágítás nélkül 33 oC-ot kell biztosítani 6-8 héten át. A 2–3. héten a kezelt hajtások csúcsát célszerű eltávolítani az oldalhajtás-fejlődés serkentése céljából. A 6. héttől az oldalhajtások hónaljrügyeiből a 0,3–0,6 mm-es merisztémák 1–2 levélkezdeménnyel izolálhatók. Táptalajként az MS kisebb módosítással használható. A merisztémákból fejlődő hajtások in vitro továbbszaporíthatók és gyökeresedés után üvegházba kiültethetők.

A vírusmentességet természetesen vagy az in vitro tenyészetekben vagy az üvegházban fejlődő növényeken ellenőrizni, pontosabban bizonyítani kell. A különböző vírustesztekben mentesnek bizonyult növények, illetve tenyészetek használhatók fel szaporításra. A vírusmentes hajtástenyészetek éveken keresztül a vírusmentes szaporítóanyag kiinduló bázisai lehetnek egy adott fajta esetében, tehát elég az egyszeri mentesítés. Egy-egy fajta mentesített steril törzsanyagai évi 2–3-szori átoltással a visszafertőződés veszélye nélkül korlátlan ideig fenntarthatók in vitro. Ez adja az in vitro génbankok létesítésének elvi lehetőségét, amit később még részletesen tárgyalunk.

5.6. Az in vitro mikroszaporítás technológiája

A mikroszaporítás üzemi technológiája – figyelemmel a szaporítás módjára – az alábbi főbb lépésekből és fázisokból áll:

1. Anyanövények kiválasztása

  • Fajtaazonos, egészséges legyen.

2. Anyanövények vizsgálata

  • A kórokozómentességet megfelelő módszerekkel tesztelni kell;

  • Fertőzöttség esetén a kórokozót azonosítani kell;

  • Szükség esetén kórokozómentesíteni kell (pl. vírusmentesítés).

3. Steril törzstenyészetek létesítése

  • Izolátum sterilizálása és átoltása táptalajra;

  • Az izolátumokban látens formában előforduló kórokozók azonosítása, mentesítése;

  • A primer tenyészetekből a molekuláris azonosításhoz szükséges DNS mintázat (RFLP, AFLP stb.) készítése.

4. A törzstenyészetek fenntartása

  • Minimális tenyésztési feltételek biztosítása;

  • Genetikai stabilitás biztosítása;

  • Genetikai azonosság ellenőrzése;

  • Visszafertőződés megakadályozása.

5. Steril mikroszaporítás

  • Átoltások és tenyésztési ciklusok ismétlése annyiszor és addig, amíg a kívánt mennyiségű szaporítóanyagot elő nem állították;

  • Újrafertőződés megakadályozása;

  • Fertőződés esetén antibiotikummal a kórokozó visszaszorítása.

6. Előkészítés a kiültetésre

  • A tenyésztés fizikai paramétereinek (erősebb megvilágítás, csökkentett citokinin és cukor koncentráció) módosítása, a hajtásmegnyúlás segítése, fotoauxotróf tenyészetek előállítása;

  • Gyökeresítés in vitro;

  • Szaporítóanyagok postázása (ha szükséges).

7. Kiültetés, ex vitro nevelés

  • Edzés, szoktatás (akklimatizáció 4-8 hét) üvegházban;

  • Takarás (kevés fény, nagy páratartalom, magas hőmérséklet);

  • Ex vitro szaporítás, miután a fotoszintézis normális, az új gyökerek működnek, kialakul a viaszréteg a levéllemezen és a sztómák működése is normális.

A technológia kritikus pontjai:

  • Az anyanövény, illetve a törzstenyészet nem kórokozómentes (garantáltan és hivatalos dokumentumokkal nem alátámasztott).

  • A törzstenyészetek fenntartása során véletlen csere (rossz átoltás, hibás címkézés) történik.

  • A fenntartás vagy a mikroszaporítás fázisában baktériumos vagy gombás fertőzés következik be.

  • A szaporított hajtástenyészetek nem gyökeresednek.

  • A kiültetéskori túlélési százalék alacsony.

5.7. Az üzemi mikroszaporítás gazdasági jelentősége

A világon 600–700 millió növényt állítanak elő évente in vitro. Ennek okai a mikroszaporítás előnyeiben keresendők, természetesen nem elhallgatva a hátrányokat.

5.7.1. A steril mikroszaporítás előnyei

  • Helyigénye kicsi, mert a szaporítás az in vitro növények különböző részeivel, illetve sejtjeivel történik.

  • Hatóságilag igazolható kórokozómentes végtermék állítható elő, mert a törzstenyészetek kórokozómentes anyanövényekről származnak.

  • Nincs visszafertőződés, mert a szaporítás és a törzstenyészetek fenntartása steril, kondicionált körülmények között történik.

  • Azonos minőségben reprodukálható, mert a tenyésztés és mikroszaporítás folyamata szabályozott feltételek között történik.

  • Évszaktól és éghajlattól független, mert a mikroszaporítás steril, kondicionált és irányított körülmények között történik.

  • Folyamatos előállítást tesz lehetővé, mert az in vitro törzstenyészetekből a szaporítás bármikor elindítható.

  • Új fajok vegetatív szaporítása válhat lehetővé, melyek a hagyományos módszerekkel nem voltak klónozhatók.

  • Új genotípusok (GM növények) felszaporítását teszi lehetővé, változatlan formában.

  • A folyamat gépesíthető és automatizálható, mert a rendszer folyamatosan ismétlődő elemekből áll.

  • Gyors szaporítást jelent, különösen a fás növények esetében.

  • A felszaporított tenyészetek könnyen szállíthatók (pl. repülővel).

5.7.2. A steril mikroszaporítás hátrányai

1.Fertőződés léphet fel ami az egész szaporítási folyamatot tönkreteheti.

2.Szomaklonális variabilitás jelentkezhet: a szaporított növényanyag, vagy annak egy része genotípusában eltér a kiinduló fajtától.

3.A kiültetéskori veszteség nagy, mert általában kidolgozatlan a gyökeresítés, edzés és az akklimatizáció.

4.Nagy az előállítási költség, mert a módszer intenzív laboratóriumi munkán alapul.

5.Specializált laboratóriumi feltételeket igényel: steril, kontrollált körülmények.

6.Képzett munkaerőt igényel: izolálás, sterilizálás, átoltás stb.

5.7.3. Üzemi mikroszaporítás a világon és hazánkban

A magasabbrendű növények mikroszaporítása MOREL 1960-as közleményével, az orchideákkal kezdődött, aki lehetségesnek tartotta egy hajtáscsúcsból – járulékos merisztéma-differenciálódás indukciójával - 1 év alatt 4 millió Cymbidium növény előállítását. Felfedezését követően már az 1960-as években számos üzemi laboratórium alakult, főleg az orchideák szaporítására.

Az elméletileg előállítható növények száma azóta óriási mértékben növekedett. Burgonya nodális szegmentummal való szaporításának kidolgozásakor havi tízszeres szaporítási rátát értünk el, amely elvileg egy év alatt 10 milliárd növény előállítását teszi lehetővé. Természetesen ilyen nagyságrendű üzemi realizálás nehezen képzelhető el, és nincs is rá szükség. Bizonyítja azonban, hogy az in vitro módszerek elméletileg milyen léptékű szaporítást tennének lehetővé. Évente a világon az in vitro előállított orchideák száma 20–30 millió között van. Természetesen az orchideák mellett számos más növény vegetatív mikroszaporítását és annak nagyüzemi technológiáját is kidolgozták (5/6. ábra). Az 1987-es párizsi biotechnológiai kiállítás szakembereinek véleménye szerint a világon évente csaknem 300 millió palántát állítottak elő steril klónozással.

Kép

5/6. ábra: A vírusmentes burgonya szaporítóanyag előállítás – biotechnológiai módszerekre alapozott – technológiájának fő lépései

A vegetatív mikroszaporításra specializálódott biotechnológiai laboratóriumok, cégek száma gyorsan növekszik a világon. A nemzetközileg jegyzett kereskedelmi laboratóriumok száma 1986-ban 130 körülire volt tehető, kapacitásuk százezertől néhány millió növény volt évente. Az európai országok közül Nagy-Britannia, Franciaország, Belgium, Olaszország, Hollandia rendelkezik a legnagyobb kapacitású laboratóriumokkal. Egy francia laboratórium 70 milliós nagyságrendet ért el a nyolcvanas évek közepén.

 Az üzemi laboratóriumok éves teljesítményét azonban ma már nemcsak azok kapacitása – mert az bővíthető –, hanem a piac igénye is meghatározza. Többmilliós kibocsátás már nemzetközi piackutatást és a termelőfolyamat automatizálását igényli.

Európában, ahol Morel professzor is dolgozott, a 60-as években a Cymbidium-mal kezdődött az üzemi termelés. A hetvenes évek elején még csak 1–4 millió növényt állítottak elő, viszont 1979-ben a holland, belga, francia és német fejlesztéseket követően már 20 milliót. A fejlődés az 1990-es évek elejéig gyors és folyamatos volt. Az EU termelés ekkor elérte az évi 230 milliót, melyből csak Hollandia évi 100 milliót állított elő. A századfordulón a legnagyobb tömeget az élelmiszernövényekből (100 millió), a gyümölcsfajokból (300 millió) és a dísznövényekből (25 millió) állítanak elő. A 90-es évek második felében azonban csökkent a termelés Hollandiában és Németországban, mivel megjelentek az új indiai és dél-afrikai laboratóriumok termékei a piacon.

Az Egyesült Államokban is az orchideákkal kezdődött a mikroszaporítás az 1960-as években. Jelenleg évente körülbelül 100 kereskedelmi laboratóriumban 120 millió növényt állítanak elő. Az USA 26 államában működik üzemi méretű laboratórium, melyek közül Florida foglalja el a vezető helyet évi 6 millió feletti növénykibocsátással. Államonként átlagosan 5–10 kereskedelmi labor működik. Ezek 10%-a évi 2,5–6 millió, 30%-a évi 0,5–2,5 millió és 60%-a az évi 0,5 milliónál kevesebb növényt állít elő. Az éves termelés 50%-át (63 millió) a dísznövények jelentik, az üvegházi növények, gyógynövények, cserjék és fák, zöldségnövények és végül a gyümölcsfajok együttesen jelentik a másik 60 milliót.

A Közel-Keleten évente 23 millió növény előállításához elegendő laborkapacitás létesült a 80-as években, melyből 20 milliót izraeli laborok jelentenek. Az arab országokban a növényfajok közül a datolyapálma a meghatározó. További fontosabb fajok a banán, szamóca, burgonya, pisztácia és a rózsa. Az izraeli mikroszaporítás meghatározó fajai a szegfű, krizantém és a gladiólusz.

Indiában az elmúlt 10 évben 105 laboratórium létesült, évi körülbelül 200 milliós kapacitással, főleg fásszárú növények szaporítására.

A termelésben és a kereskedelemben tehát megindult a verseny a nemzetközi piacokért. E folyamat során lassan kiemelkednek a vezető kereskedelmi laboratóriumok, amelyek vagy saját nemzetközi hálózatot építenek ki, vagy integrálódnak a különböző világkereskedelmi cégekhez.

A módszer széleskörű, gyors gyakorlati alkalmazását és terjedését megkönnyítette, hogy a technológia uniformizálható, programozható és automatizálható. Komplett kereskedelmi laboratóriumok teljes felszereléssel, technológiával vásárolhatók és telepíthetők az egész világon, Európától Ázsiáig, Afrikától Amerikáig. A technológia bevezethetősége nem az elhelyezéstől, az ország fekvésétől, a termesztett növény fajaitól függ, hanem a szükséges infrastruktúra meglététől.

Magyarországon – Maróti professzor munkásságának eredményeként – már a 60-as években megindult az üzemi mikroszaporítási technikák kidolgozása és alkalmazása az orchidea, szegfű, gerbera stb. fajoknál. A napjainkig eltelt időszak (30 év) két szakaszra osztható.

Az első szakaszban (1965–90) a dísznövények üzemi mikroszaporítása gyorsan terjedt a tőkeerős mezőgazdasági, valamint kertészeti Termelő Szövetkezetekben, mint pl. Sasad TSz (1968, orchideák stb.), Óbuda TSz (1973, szegfű, gerbera stb.), Szombathelyi Kertész Mg.Tsz (1972, orchidea, bromélia stb.), Rozmaring TSz (1972, szegfű, gerbera, levéldísznövények stb.). Ezeknek a laboratóriumoknak a termelése általában a TSz saját üzemének igényeit szolgálta.

A Zöldségtermesztési Kutató Intézetben – a mikroszaporítás kézi munkaerőigényének csökkentésére – FárI Miklós vezetésével dolgozták ki a Propamatic-rendszert, mely automata táptalajfőző, automata táptalaj adagoló (Clonmatic) és gázsterilizátor egységekből állt. Hollandiában 1985-90 között 30 üzem alkalmazta a Propamatic rendszert. A gyümölcstermő-, dísz- és erdészeti növények vírusmentes szaporítóanyagainak előállítása a Kertészeti Kutató Intézetben, 1979-ben kezdődött. A hazai mikroszaporítás (kb. 4–5 millió palánta/év) a Meriklón GT (dísznövény, szőlő, burgonya, gyümölcs) felépülésével és működésével érte el csúcspontját 1980-88 között. Felszámolásával a hazai mikroszaporítás első szakasza is lezárult.

A második szakaszban, 1990-től a mikroszaporítás hazai súlypontja kisebb üzemi laboratóriumokra és magánvállalkozásokra (pl. Flora GMK) helyeződött át (szegfű, gerbera, levéldísznövények stb.). Az előbbiek általában saját felhasználásra az utóbbiak zömében külső megrendelésre (levéldísznövények, vízinövények stb.), illetve exportra (banán, kivi, fás növények, gyümölcsfajok stb.) termelnek. Számuk országosan 30 körüli, éves becsült termelésük 3 millió palánta.

A 90-es években lendületet adott a hazai mikroszaporításnak a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen a Jámborné Benczúr Erzsébet által vezetett laboratórium. A Tanszéken a graduális és posztgraduális oktatás mellett számos különböző dísznövény faj mikroszaporítási eljárását dolgozták ki a 90-es években. Az ő érdeme a Magyar Növény-Mikroszaporítók Egyesülete megalakítása 1993-ban.

5.8. A mikroszaporítás a XXI. században

A kilencvenes években az üzemi mikroszaporítás elérkezett a technológia automatizálásához. Ennek legfontosabb irányát az alábbi megközelítések jelentik.

5.8.1. Rita tenyésztési rendszer

A mikroszaporítás nagyon munkaigényes technológia. Az összes költség 50–80%-át a laborköltség jelenti: főképpen a szilárd táptalaj és azzal járó feladatok. CIRAD-ban (Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement, Franciaország) az 1990-es évek második felében kidolgoztak egy olyan rendszert, mely folyékony táptalajt használ úgy, hogy azzal mindenféle típusú szövettenyésztéses technika kivitelezhető anélkül, hogy a tenyészetek hidratáltakká válnának.

A Rita-nak nevezett „szakaszosan tápláló tenyésztő rendszer” (Temporary Immersion System) jelentősége egyszerűségében és praktikusságában van.

A rendszer egy speciális tenyésztő edényen alapul, mely két részből áll. Az alsóban van a tápoldat, a felsőben pedig a tenyésztendő növényanyag. A RITA kapacitása 250 ml és 1,0 l között változhat. A két részt csövek és nyílások kötik össze. A tenyészetek táplálása úgy történik, hogy meghatározott időközönként egy automatizált rendszer túlnyomást létesít. Ennek következtében az alsó részből a tápoldat feljut – a csöveken keresztül felnyomódik – a felső részbe. A nyomás megszűntével a tápoldat magától visszaáramlik az alsó részbe (5/7. ábra).

Kép

5/7. ábra: A RITA in vitro tenyésztő rendszer és működési elve (VITROPIC-CIRAD, 1999 nyomán) (részleteket lásd a szövegben)

A rendszerre egyszerre több Rita típusú tenyésztőedény kapcsolható. A tenyészetek levegőztetése külön rendszerrel, sterilizált levegővel történik.

Az eddigi eredmények rendkívül biztatóak mind a klasszikus hajtástenyészetekkel, mind a járulékos szervtenyészetekkel (pl. gumó) kapcsolatban. A szomatikus embriógenezis esetében kiválóan alkalmas az embriók érlelésére és csíráztatására. A Rita-val emellett jelentősen növelhető a mikroszaporítási ráta, valamint erősebb és egészségesebb növények kaphatók.

5.8.2. Vitron 501 mikroszaporító robot

A robotot 1997-ben Ausztráliában fejlesztették ki, fás növények mikroszaporítására. A robot, mely egy elektromos-pneumatikus és mechanikus konstrukció, 11 külön meghajtott és külön vezérelt egységből áll. Az egységeket 2 db 486-os számítógép irányítja DOS-rendszerben.

A robot gyökeres, egy hajtással rendelkező növényeket állít elő, nodális szegmentumokból. A gyártó For Bio cég a Monsantoval közösen 4 robotot működtet Indonéziában, melyek éves teljesítménye összesen 15 millió növény (eukaliptusz, akác és tikfa).

5.8.3. Fotoautotróf mikroszaporítás

A fotoautotróf tenyésztés bevezetése és térhódítása a XX. század végi heterotróf és fotomixotróf típusú növényi szövettenyésztés egyik legnagyobb módszertani fejlesztése.

Lényege, hogy a tenyésztett növények szénforrását a levegőből biztosítják, azaz a táptalaj semmiféle cukrot nem tartalmaz. A táptalaj szervetlen komponenseit is csökkentett, 50%-os koncentrációban használják (fél MS). A fotoautotróf körülmények között tenyésztett nodális szegmentumokból nagyobb levelű, erőteljesebb növények fejlődnek, a hajtások tövénél nem tapasztalható kalluszosodás.

 A CO2 tartalom és a megvilágítás növelése kedvezően hatott az eukaliptusz, a kávé és a banán tenyészetek friss súly növekedésére, a hajtás hosszúságára, a levélfelületre, a nettó fotoszintetikus rátára, a gyökeresedésre, illetve a kiültetéskori túlélésre.

A fotoautotróf körülményeket (CO2 koncentráció és megvilágítás) optimalizálva még jobb eredmények érhetők el. A kávé esetében a levegő 350–450 µmol mol-1 CO2 koncentrációjához képest a CO2 tartalom jelentősen növelhető volt (1450 µmol mol-1), 150 µmol m2s-1 fotoszintetikus foton flux (PPF) megvilágítás mellett is. A megvilágítás erőssége a 400–700 nm-es fotoszintetikus hullámtartományban viszont még jelentősen elmarad a természetes megvilágítástól.

Tehát a fotoautotróf tenyészetekben a szénforrás és a fényforrás szabályozásával javítható az in vitro növények fejlődése, minősége, mely jobb túlélést eredményezve csökkenti az in vitro tenyésztés költségeit és javítja versenyképességét más klasszikus szaporítási rendszerekkel szemben.

A jövőben tehát nemcsak a mikroszaporítás során, hanem minden növényi szövettenyésztéssel foglalkozó kutató és fejlesztő laboratóriumban is mérni és szabályozni kell e tenyészetekben a CO2 tartalmat és a páratartalmat, továbbá a fotoszintézis szempontjából hasznos fénytartományban a fényerősséget. Ez alapjaiban fogja megváltoztatni az in vitro tenyésztési technikát, laboratóriumokat és szemléletünket.

5.8.4. Mikroszaporítás bioreaktorban

A bioreaktorban való szaporítás elterjedésének legnagyobb akadályát a tenyészetek hiperhidratáltsága jelenti. A folyékony közegben fejlődő növények egyrészt abnormálisan fejlődnek, másrészt a kiültetést nem, vagy csak nagyon kis százalékban élik túl.

A fentiek miatt egy új, kétlépéses szaporítás van kialakulóban. A kiindulás tulajdonképpen bármelyik szaporításra használt izolátummal történhet: levelek (páfrány), rügyek (filodendron, gladiolusz), gyökér (nyár), nóduszos hajtásdarab (burgonya).

Az első lépésben a merisztémák differenciálódását indukálják (citokininnel), és azok proliferációját tartják fenn a fermentorban. A hajtások fejlődését növekedés gátlókkal és gibberellin inhibitorokkal gátolják.

A fermentoros tenyésztés során merisztematikus sejtaggregátumok, illetve rügyekből álló aggregátumok fejlődnek. Az aggregátumok folyamatosan szaporodnak. Bizonyos fajok (pl. banán, Brodiaea) az orchideákhoz hasonló protokormokat fejlesztenek. A rügyaggregátumok proliferációja rendkívül gyors, ami korlátlan szaporítást tesz lehetővé.

A második ütemben ezekből a rügyaggregátumokból – a hajtásfejlődés gátlásának feloldásával, szokásos mikroszaporítás eljárásokkal – növényeket nevelnek fel.

Összefoglalvamegállapítható, hogy a század végére végül is az elméleti ismeretek fejlődése és számos gyakorlati próbálkozás tapasztalatai alapján körvonalazódnak azok a megközelítések, melyek szintáttörést jelentő lehetőségeket jelentenek a növényi mikroszaporítás versenyképességének javításához és általánossá válásához.

Talán nem tévedünk nagyot, ha jelenlegi ismereteink alapján úgy fogalmazunk, hogy a XXI. századi üzemi méretű mikroszaporítás kombinálni fogja a rügyaggregátumot eredményező fermentoros szaporítást a fotoautotróf folyékony tenyésztéssel. Mind a két eljárás és folyamat automatizálható és végül is egy robotban összekapcsolható. E rendszer jelentősen csökkenteni fogja a laboratóriumi élőmunkát, folyamatos és nagy szaporítási rátát fog biztosítani, valamint erős, egészséges palánták előállítását teszi lehetővé.

5.9. A mesterséges mag

Az előző pontokban már utaltunk arra, hogy a szomatikus embriók in vitro differenciálódását először az ötvenes évek végén figyelték meg és írták le. A tudományos közvélemény azonban csak a megrendíthetetlen bizonyítékok hatására, a hatvanas évek közepén fogadta el a morfogenezis in vitro indukálható alternatív útjaként.

A magasabbrendű zárvatermő fajok szaporítószerve a mag, tulajdonképpen embrióból, az azt körülvevő tápláló szövetből és védőburokból, a maghéjból vagy terméshéjból áll. A kutatókban viszonylag korán felmerült a mesterséges mag laboratóriumi előállításának lehetősége. Mivel a gazdasági haszon óriásinak tűnt, a hetvenes évek közepén a Monsanto és a Union Carbide intenzív kutatást indított ezen a területen. Az első sikeres eredményekről a nyolcvanas évek elején számoltak be.

A mag felépítése és működése azonban sokkal bonyolultabb szabályozó rendszer létezését igényli, mint amire a kutatók először gondoltak. Ennek a csodálatos összhangban működő rendszernek mesterséges szimulálása a XX. század végén reménytelen vállalkozást jelent. Ez az oka, hogy a mesterséges mag előállítása jelenleg is kutatási stádiumban van.

Kép

5/8. ábra: A mesterséges mag felépítése

A mesterséges mag a szövettenyészetekben fejlődött embriót, valamint az azt burkoló – tápláló és védő – anyagot jelenti (5/8. ábra). A mesterséges (artificial) kifejezés helyett használatos a szintetikus (synthetic) vagy szomatikus (somatic) mag megjelölés is. Ez utóbbi egyben azt is jelzi, hogy a mesterséges mag a testi sejtek genomját tartalmazza, tehát a vele való szaporítás klónozást, vagy vegetatív szaporítást jelent.

 A mesterséges mag előállításának a siker érdekében tehát nem a természet másolása a célja, hanem a mag titkait ellesve, olyan működő rendszer kialakítása, mely alkalmas speciális gyakorlati alkalmazásokra. A kutatások 3 fő területrekoncentrálódnak (5/9. ábra):

Kép

5/9. ábra: A szomatikus embriók és a mesterséges mag előállításának, valamint felhasználásának alternatív lehetőségei

a) érett szomatikus embriókelőállítása;

b) mesterséges magvak elő-állítása;

c) mesterséges magvak csí-ráztatása.

5.9.1. Érett szomatikus embriók előállítása

Először egy jól működő in vitro embriogén rendszert kell kidolgozni, melynek célja a kiinduló embriogén kallusz, vagy sejtszuszpenzió előállítása és korlátlan idejű fenntarthatóságának biztosítása (5/10. ábra).

Kép

5/10. ábra: A szomatikus embriógenezis indukciója és a mesterséges mag előállítása a vadgesztenye sejttenyészetében A: szomatikus embriókon fejlődő járulékos embriók; B: embriogén sejtszuszpenzióból a kiszélesztést követően fejlődő szomatikus embriók tömege; C: nem szinkronizált szomatikus és adventív embriótenyészet, melyben a gömbtől a szikleveles stádiumig minden fejlődési fázis megtalálható; D: kapszulázott (Na-alginát) torpedó stádiumú szomatikus embrió (Kiss J. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növénynemesités Tanszék, Gödöllő

E folyamat kritikus lépései a következők:

  •  Az embriógenezis indukciója úgy, hogy a tenyésztett sejtek közel 80–100%-ában lehetőleg azonos időpontban következzék be. Ennek célja, hogy a tenyészet az inkubáció végén nagyszámú és lehetőleg azonos fejlettségű embriókat tartalmazzon. Ezek a feltételek a specifikus embriogén típusú sejtek arányának növelésével, illetve a sejtek szinkronizálásával érhetők el.

  •  A szomatikus embriógenezis folyamata optimális feltételeinek biztosítása in vitro abból a célból, hogy a tenyészetben fejlődő embriók minél kisebb százalékban legyenek morfológiailag vagy anatómiailag hibásak, torzak.

  •  A kifejlett szomatikus embriók érlelése abból a célból, hogy minél nagyobb százalékban váljanak csírázóképessé.

Kép

5/11. ábra: A kapszulázott sárgarépa embriók előállításának folyamata és hatékonysága fermentorban (Onishi N. Y. és mtsai 1994, PCTOC 39: 137–145 alapján)

Az 5/11. ábra szemlélteti ezt a folyamatot, bizonyítva, hogy milyen rossz a szomatikus embrió kihozatal.

Japán kutatóknak (Osuga és Komamine 1994) viszont sikerült a sárgarépa szomatikus embriógenezist úgy szinkronizálni, hogy a kiinduló sejtek közel 100%-ából embriókat kaptak. A sárgarépára kidolgozott nagy hatékonyságú szinkronizált embriógenezis rendszer lényege a következő:

1.Embriogén sejtszuszpenzió létesítése 0,05 mM 2,4-D-t, 1 mM zeatint és 0,2 M mannitolt tartalmazó táptalajon.

2.A kicsi, kerek és különálló embriogén sejtek izolálása – a jól növekvő embriogén aggregátumokat tartalmazó tenyészetekből szűréssel, majd Percoll oldatban sűrűség gradiens centrifugálással – és tenyésztése az 1. pontban jelzett táptalajon.

3.A fejlődő embriogén sejtaggregátumok izolálása szűréssel és sűrűség gradiens centrifugálással Ficoll oldatban, majd azt követő alacsony fordulatszámú centrifugálással.

4.A szelektált sejtaggregátumok (2x103 ml–1) 0,1 mM zeatint tartalmazó, auxinmentes táptalajon rövid idő alatt – szinkronizáltan – gömbstádiumú embriókká fejlődnek.

5.Torpedó stádiumú embriókat tartalmazó tenyészet előállítása a gömbstádiumú embriók izolálásával, szűrésével és tenyésztésével (150 embrió ml-1 ).

A kereskedelmi célú előállítást fermentor alkalmazása jelenti. Napjainkig a fenyőfajok azok, amelyekre a fermentor-technológiát (1–2 l-es fermentor) kidolgozták és sikerrel alkalmazzák. Ezek részben mechanikus, részben levegőztetett és air-lift bioreaktorok. A fenyőfélék fermentorban előállított nagyszámú szomatikus embrióinak érlelését a tápoldatba adagolt PEG-gel (MV 4-8000, 10–20%), aktív szénnel (0,05–1,0%), ABA-val (2,5–100 mg/l) és GA3-val (10–20 mg/l) biztosítják. Ezzel jelentősen növelik a táptalaj ozmolaritását.

Fontosabb fajok, melyek szaporítása már szomatikus embriógenezissel is lehetséges a Picea mariana, Picea glauca x engelmannii, Pinus radiata, Picea sitchensis és a Preudotsuga menziesii.

A szomatikus embriógenezis molekuláris szabályozásával kapcsolatos eredmények is biztatóak. A szomatikus és zigotikus embriógenezisben működő gének összehasonlításakor nyilvánvalóvá vált, hogy a késői stádiumú szomatikus embriókban csak a közepes stádiumú zigotikus embriók génjei működnek. A késői zigotikus embriókra jellemző transzkriptumok sajnos nem mutathatók ki a késői szomatikus embriókban. Tehát a tenyésztés körülményeit ennek megfelelően kellene módosítani.

Egyre több ismerettel rendelkezünk azokról a génekről is, melyek a szomatikus embriogenezis során expresszálódnak. Komanine ezeket három csoportba sorolta:

  •  Az első csoportba a sejtosztódás génjei (21D7, CEM6) tartoznak, melyek az indukciót követően kapcsolnak be és a gömbstádium kialakulásáig működnek. Szerepük a szomatikus embriógenezis indításában, az intenzív sejtosztódásban, illetve a totipotencia realizálásában van.

  •  A második csoportba a szervkialakulás génjei (CAR, 3,4,5,6 CHB 4,5) tartoznak, melyek a késői torpedó stádiumban működnek, akkor, amikor a gyökér, a hajtás és a hipokotil differenciálódása kezdődik. Exogén auxin adagolás esetén, ami az embriógenezist leállítja, ezek a gének kikapcsolnak.

  •  A harmadik csoportba a homeobox gének (CHB2, CEM6) tartoznak, melyek glicingazdag fehérjét kódolnak – ez valószínűleg egy glikoprotein – és így specifikus szignálszekvenciát tartalmaz. A CEM6 gén antiszensz génjével történő transzformációt követően a sejtek elvesztették embriogén jellegüket, ami egyértelműen bizonyítja a gén kulcsszerepét az embriógenezis folyamatának indításában.

A csíraképes embrió kihozatalt image analízissel is próbálták növelni. A kidolgozott szelekciós rendszer célja, hogy a szomatikus embrió-szuszpenzióból mechanikailag el lehessen különíteni az abnormális (torz, degenerált) és normális torpedó stádiumú embriókat. Sárgarépa esetében az eredeti 30%-os normális embrió arány az image analízissel 80%-ra volt növelhető.

5.9.2. A mesterséges mag előállítása, típusai

A mesterséges mag előállítását szomatikus embriókból az egyes kutatócsoportok különböző fajokon, eltérő módon közelítik meg. Ennek megfelelően eltérő rendszerek vannak kialakulóban, amelyek közül a kapszulázott szomatikus embriók és a szárított szomatikus embriók érdemelnek említést (5/12. ábra).

Kép

5/12. ábra: A mesterséges mag előállításának és felhasználásának főbb lépései A tenyésztett növényi sejtekből n gyszámú szomatikus embrió fermentorban állítható elő, melyek szárítva vagy kapszulázva juttathatók ki a talajba

1. Kapszulázott embriók

A kapszulázást sokan a jelenlegi legfejlettebb rendszernek tartják. Az embriók ebben az esetben egy gélszerű anyagba vannak beágyazva.

A módszert lucerna- és zellerembriókon dolgozták ki. Lényege, hogy élelmiszerek szilárdítására használt nátrium-alginát burokkal – amely nem toxikus – veszik körül az embriókat.

A kapszulázás úgy történik, hogy az embriókat nátrium-algináttal keverik össze, majd valamilyen kálciumsó [(Ca(NO3)2, CaCl2)] oldatába helyezik. A kalciumfürdőben az embriók körül átlagosan 4 mm átmérőjű gélszerű burok alakul ki, amely a továbbiakban megfelelő védelmet nyújt. A kis golyók felülete szilárd, belül az embrió körül kocsonyás marad. Újabban hőmérsékletfüggő gélekkel, hűtéssel is elérhető a kapszulázás (5/10 D. ábra).

Automatikusan felnyíló alginát kapszulát is sikerült előállítani. Ennek lényege, hogy a Ca2+-mal szilárdított alginátból csapvízzel kimossák a kalciumot, melyet K+-mal helyettesítenek úgy, hogy KNO3 200 mM-os oldatába helyezik a magvakat 60 percig. Az ilyen kapszula később, amikor nedves környezetbe kerül, azért ,,pattan fel”, mert a K+ nagyobb hidrátburka miatt több vizet vesz fel, ami az alginátot szétfeszíti.

A gélbe juttatott különböző anyagokkal befolyásolhatjuk, serkenthetjük az embrió fejlődését. A szomatikus embriót körülvevő, különböző tápanyagokat tartalmazó köpenyt mesterséges endospermiumnak nevezzük. Bizonyos magvak (pl. zeller) esetében a szomatikus embriók megfelelő csírázásához pl. szacharóz is szükséges, melyet a kapszula is tartalmazhat. A kapszulákat kívülről víztaszító (hidrofób) membránnal kell bevonni a gyors kiszáradás és a korai felrepedés megelőzése végett.

2. Szárított embriók

Az embriók fejlődése in vivo vízvesztéssel is jár, ami azok érését segíti elő. A száradás a zigotikus embriógenezist leállítja, és az embriókat képessé teszi a csírázásra. Ezért kézenfekvőnek tűnt a szomatikus embriók szárítása, elősegítve ezzel érésüket. A szomatikus embrió szuszpenziókat 2,5% polioxietilénből (a polietilén-oxid homopolimerje) készült lemezeken szárítják. A lemezek rehidratációját követően az embriók kicsíráznak.

A szárítás könnyen károsíthatja az embriókat. Az embriók szárítási toleranciája növelhető a fejlődésük során a táptalajba adagolt ABA-val, illetve a szacharóz koncentráció növelésével. A szomatikus embriók 15%-os víztartalomra szárítva jól tárolhatók szobahőmérsékleten és annak megfelelő páratartalom mellett, anélkül, hogy életképességüket elvesztenék.

A szárított embriók tárolhatók és felhasználhatók csupaszon, illetve valamilyen szintetikus anyaggal bevonva. Az embriók bevonására alkalmas anyagként háromféle polimer típust próbáltak ki, a polivinil-kloridot (PVC), a polivinil-acetátot (PVA) és a polioxietilén glikolt. E filmszerű bevonatok vastagsága azonban kritikus a csírázás során.

Mivel a szárítás hatására a csíranyugalom feltehetőleg megszakad, e módszer azoknál a fajoknál érdemel különös figyelmet, amelyeknél a szárítás stimulálja az embriók további fejlődését (pl. szőlő).

5.9.3. A mesterséges mag csírázása

1. Kapszulázott embriók vetése

A módszer tulajdonképpen a folyékony vetést (fluid drilling) jelenti, amelyet előcsíráztatott és védőgéllel bevont csíranövények vetésére dolgoztak ki. Végül is a fluid drilling a kapszulázott embriók szuszpendálását jelenti a talajba, amelyet speciális géppel végeznek.

Legnagyobb hátránya, hogy nem teszi lehetővé a tőszám pontos meghatározását, viszont a gélhez adagolt tápanyagokkal, peszticidekkel és növekedésszabályozó anyagokkal a túlélési százalék jelentősen javítható.

 Az e módszerrel vetett – előcsíráztatott magvakból fejlődött – növények egyszerre kelnek, gyorsabban fejlődnek, koraibbak, és nagyobb termést hoznak. Ezeket a tulajdonságokat paradicsom, zeller, hagyma, sárgarépa és saláta zigotikus embriókból fejlődött növényállományaiban figyelték meg. Feltételezik, hogy a szomatikus embriók esetében is realizálhatók lesznek ezek az előnyök.

A kapszulázott lucernaembriók 90% -a kicsírázott in vitro, nem steril földbe való ültetés esetén azonban a túlélés csak 15–25%-os volt. Más fajokkal – pl. sárgarépa és tömjénfenyő (Pinus taeda) – még ezeket az értékeket sem lehetett elérni. A tömjénfenyőé egyáltalán nem, a sárgarépa szintetikus magja is csak 3–10%-ban csírázott in vitro. Sikerrel kapszulázták az utóbbi években a kömény, a gyapot, a saláta, a kukorica és a káposztafélék szomatikus embrióit is.

2. Szárított embriók csíráztatása és palántázása

A szárított embriók közül a legjobb túlélést azokkal érték el, amelyeket semmilyen anyaggal sem vontak be. A csomós ebír embrióinak 32%-a, a szőlőéinek 28%-a fejlődött növénnyé in vitro.

A különböző fenyőfajoknál a fermentorban fejlődött embriók sejtszuszpenzióban nem csíráztak. A csírázóképesség elérése céljából az embriókat félig szilárdított táptalajra kellett helyezni, és 7–10 napig sötétben tartani. A fényre helyezést követően a szomatikus embriók kicsíráztak, és 6–10 hét múlva a növénykék kiültethetők voltak a talajba. A duglászfenyő egy szaporítási ciklusát követően 30000 növényt lehetett kiültetni.

3. Palánták előállítása Rita-rendszerben

A szomatikus embriógenezisre alapozott szaporítás számára, főleg azoknál a növényeknél, melyeket palántáznak, pl. fenyőfélék, banán, kávécserje és Citrus-fajok stb., várhatóan gyorsan el fog terjedni a Rita rendszer, melyet Franciaországban dolgoztak ki (CIRAD) a 90-es évek második felében. A rendszer sikerrel kombinálja a folyékony tenyészetek minden előnyét úgy, hogy kiküszöböli hátrányukat (részletesen lásd az 5.8.1. fejezetben).

A szomatikus embriók esetében már sikerrel alkalmazták a banán, kávé, Citrus-félék, olajpálma stb. fajoknál. Magát a szomatikus embriógenezisre képes sejtszuszpenziót célszerű hagyományos módon lombikban előállítani és fenntartani. A Rita különösen a szikleveles stádiumú szomatikus embriók előállítására és az embriók csíráztatására alkalmas. Egy Rita edényben 5000 kávé szomatikus embriót és 500 banán csíranövényt lehetett előállítani.

5.9.4. Gazdasági jelentősége

1. Általános jelentősége

A mesterséges mag, pontosabban a fermentorokban folyamatosan, milliárd számra előállítható szomatikus embriókkal végzett vetés és palántázás a XX. század végén a fenyőféléknél már elérte a gyakorlati alkalmazást.

Az utóbbi néhány év eredményei sejtetni engedik, hogy a jelenlegi problémák leküzdésével a XXI. században számos faj szaporítóanyagát klónozással, automatizált fermentor rendszerekben fogják előállítani. Ezzel lehetővé válhat :

  • a heterózis felhasználása a növényfajok szélesebb körében (klónozás lehetősége miatt);

  • a heterózis fixálása minden növényfajnál (a klónozás lehetősége miatt);

  • a teljes termés hasznosítása (nincs vetőgumó, vetőmag előállítás);

  • a genetikai manipulációval előállított GM növények és GM fajták gyors felszaporítása;

  • az előállítás helyének és idejének függetlenítése az évszakoktól, a kontinenstől (égövtől) és az adott faj termesztési területétől (zárt fermentor rendszerek miatt).

További gazdasági jelentőségét bizonyítja, hogy egy 10 l-es fermentorban 1 hónap alatt elméletileg 1 milliárd embrió állítható elő (1 ml = 100 000 sejt), és ez az embriómennyiség megfelel:

  • 10 000–15 000 ha kukorica vetőmagnak,

  • 150–200 ha búzavetőmagnak,

  • 20 000–25 000 ha burgonya vetőgumónak.

Természetesen a realitások talaján maradva ma – néhány faj kivételével – csak a milliárdos szám 1–10%-ával számolhatunk, de az sem lebecsülendő nagyságrend.

Az előbbieken kívül a hagyományos vegetatív szaporításhoz és az in vitro mikroszaporításhoz képest a mesterséges maggal, illetve szomatikus embrióval való szaporítás előnyei, illetve hátrányai a következők:

2. Előnyök a többi vegetatív szaporításhoz képest

  • korlátlan és gyors szaporítási lehetőség (időben és térben);

  • az in vitro növényeknek egyidejűleg gyökerük és hajtásuk is van (csíranövények);

  • közvetlenül is kijuttathatók a talajba (vethetők);

  • alkalmas a fermentációra (léptéknövelés);

  • alkalmas az automatizálásra (költségek csökkentése);

  • alkalmas a krioprezervációra (kriobank).

3. Hátrányok a többi vegetatív szaporításhoz képest

  • szomaklonális variabilitás (genetikai instabilitás léphet fel);

  • nagy ráfordítást, befektetést igényel (élő munkaerő, eszközök).

Az előállítás gazdasági elemzését napjainkig a legjobb eredményt elérő fajnál, a lucernánál végezték el. A lucerna mesterséges magjának ára egy magra vonatkoztatva hússzorosa a hagyományos vetőmagénak. A költségek várhatóan jelentősen csökkenthetők lesznek a laboratóriumi ráfordítások mérséklésével és a folyamat egyes lépéseinek automatizálásával. További lehetőséget jelent a módszer drágább vetőmagvú fajokra való kidolgozása is.

A fenyőféléknél a kiváló fák mesterséges maggal való szaporítása (pl. Picea abies L., P. engelmannii Parry, P. glauca (Moench, Voss) már olcsóbb, mint a gyökérsarjról való szaporítás. A fenyőféléknél a mikroszaporítás már napjainkban is a szomatikus embriógenezisre alapozott!

Gazdaságilag jelentős trópusi fajoknál (pl. kakaó, kókuszpálma, olajpálma és kávé), melyek zigotikus magvai gyorsan elvesztik csírázóképességüket, szintén gazdaságosnak tűnik a szomatikus maggal való szaporítás. Ugyanez vonatkozik az értékes dísznövényekre is, ahol egy-egy értékes változat egy-egy palántájának vagy magjának, illetve gumójának ára már napjainkban is jelentősen meghaladja a mesterséges mag költségeit.

Végeredményben a mesterséges mag a növényi biotechnológia várhatóan egyik legnagyobb gazdasági jelentőségű eredménye lesz talán nem is a távoli jövőben.

5.10. In vitro génbank

Az in vitro génbank a különböző genetikai tartalékok tartós tárolását jelenti, biotechnológiai (szövettenyésztés, mélyfagyasztás) módszerekkel.

A második világháborút követően a kutatók – VAVILOV fél évszázaddal korábbi munkáira alapozva – felismerték, hogy a civilizáció terjedésével, az intenzív gazdálkodásra való áttéréssel a világ természetes és kultúrflórája rohamosan szegényedik. Különösen az 1960-as években a zöld forradalom során – Afrikában, Ázsiában, Dél-Amerikában stb. – előretörő modern fajták szinte egyik évről a másikra szorították ki a – sokszor évtizedek vagy évszázadok óta termesztett – helyi táj- és primitív fajtákat. A folyamatot – talán a politikusok meggyőzése végett – géneróziónak nevezték el, mely ezeknek a primitív, természet alkotta anyagoknak, mint génforrásoknak elvesztését jelenti.

A felismerést követően megindult nemzetközi akció során létesültek a génbankok (csíraplazmabankok), mint olyan kutatóintézmények, ahol a még fellelhető természetes változatosságot hordozó formákat összegyűjtik és az utókor számára megőrzik. A megőrzés és tárolás napjainkban vagy növény formában (pl. fafajok nemzeti parkokban), vagy leszárított és hűtött (+5 – –20 °C) magminták alakjában (magbank) történik. A vegetatív úton szaporított növények esetében a problémát az jelentette, hogy azokat – az előbb bemutatott két lehetőség közül – egyikben sem lehet tartósan tárolni. Az évenkénti fenntartás szántóföldön a vírusfertőzés miatt kockázatos, a mag pedig nem reprezentálja az eredeti genotípust, és az utódgeneráció hasad. Szükség volt tehát olyan módszerre, amellyel a vegetatív részek hosszú ideig életképesen megőrizhetők.

A növényi biotechnológia fejlődése a hetvenes években két metodikai lehetőséget is kínált. Az egyik az in vitro embrió- és szervtenyészet volt, a másik egy teljesen új terület, a növényi kriobiológia. Ennek megfelelően napjainkban két in vitro tárolási forma kerül bevezetésre, az egyik a lassan növekedő tenyészet, a másik pedig a fagyasztva tárolást, a krioprezervációt jelenti.

5.10.1. Az in vitro tárolás feltételei

Olyan növényfaj esetén érdemes in vitro tartós tárolásra berendezkedni, amely számára már:

  • kidolgozott a kórokozómentesítés (mert csak egészséges genetikai tartalékokat szabad megőrizni);

  • kidolgozott a lassú növekedésű tenyészet (mert a költségek ezzel csökkenthetők);

  • kidolgozott a mikroszaporítás (mert az in vitro génbankból kikerülve az egyes tételeket fel kell szaporítani).

Az in vitro génbankban a tenyészet típusa fajfüggő. Az izolátum, amivel a tenyészeteket indítani érdemes, eltérhet egymástól. Az in vitro génbankokban tárolt fajok izolátumai a következők: fejlődő embrió (kókuszpálma), oldalhajtás (kakaó, gyapot), hajtás (fűfélék), egyrügyes hajtás (burgonya).

Tárolás a lassan növekvő tenyészetekben – mint in vitro génbankban – azt jelenti, hogy különböző növényi anyagokat in vitro évi 1–2-szeri, vagy ritkább átoltással, magukban a tenyészedényekben steril, kontrollált feltételek között tartjuk fenn (5/13. ábra) és tároljuk.

Kép

5/13. ábra: Burgonya in vitro génbankja A) a hajtástenyészetben differenciálódott mikrogumó; B) minimális tenyésztési feltételek között tárolt 1 éves (5 db egyrügyes nóduszból indított) hajtástenyészet, mely 2500–3000 db egyrügyes nóduszt tartalmaz; C) a génbankban tárolt (balról jobbra) 1–3–6–12 hónapos hajtástenyészet (Heszky L. és mtsai kísérlete, Agrobotanikai Intézet, Tápiószele

A mikroszaporításnál bemutatott hajtástenyészetek önmagukban is szolgálhatnak rövidebb-hosszabb tárolási célt. Ezekben a tenyészetekben azonban gyorsan nőnek a hajtások, ami gyakori – 4–6 hetenkénti – átoltást tesz szükségessé. Tehát nagyon munka- és eszközigényes. Az átoltások száma és a költségek csak úgy csökkenthetők, ha a hajtások anyagcseréjét és ezzel fejlődését lassítjuk.

5.10.2. Az in vitro tárolás technikái

Klasszikus technikák

A tenyészetek növekedési sebességének csökkentésére dolgozták ki a lassú növekedést biztosító (slow growth) tárolási technikákat, melyek a következők:

  • Tárolás alacsony hőmérsékleten (0–8 °C);

  • Tárolás gyenge megvilágításban vagy sötétben (800– 1000 lux, 8–12 óra);

  • Tárolás minimális táptalajon (szervetlen sók+cukor);

  • Tárolás ozmotikus növekedésgátlókkal (4–8% mannitol);

  • Tárolás hormonális növekedésgátlókkal (5–10 mgl-1 ABA).

Az egyes fajok esetében általában a fenti technikák kombinációit használják. A szamócatenyészet például sötétben, 4 °C-on, kevés folyékony táptalajban, hűtőszekrényben 6 évig tárolható. Az almaé 2 °C-on 13 hónapig, a baracké 15 °C-on 15 hónapig tárolható átoltás nélkül. Jelenleg ezek a technikák jelentik az in vitro génbank klasszikus módszereit a világon.

Alternatív technikák

Ezek olyan megközelítések, melyek kipróbálás alatt vannak.

  • Kallusz tárolás paraffinolaj alatt: a vizsgált fajok sárgarépa, Catharanthus és a szőlő voltak. A 313 tételből álló kalluszgyűjtemény 25–30%-a paraffin olaj alatt 6–12 hónapig tárolható volt. Hasonló eredményt értek el francia kutatók sejtszuszpenzióval, melyet folyékony táptalajjal fedtek le és rázatás nélkül 6 hónapig tárolták.

  • Hajtásdarab tárolás paraffinolaj alatt: a gyömbér bizonyos genotípusainak hajtásdarabjai kiváló életképességet mutattak 2 éves tárolás után is. A kávé, körte izolátumok már néhány hónapos tárolás után is nekrotizálódtak, illetve hiperhidratáltakká váltak.

  • Tárolás csökkentett légnyomáson: az alacsony nyomású rendszer (low pressure system) a légnyomás csökkentését jelenti (1013 hPa-ról 500 hPa-ra) a gázok parciális nyomásának csökkentésével. A dohány és krizantém növénykék 6 hétig voltak tárolhatók alacsony légnyomáson és 1,3%-ra csökkentett oxigéntartalom mellett. Az olajpálma embrióit 4 hónapig lehetett szobahőmérsékleten, alacsony légnyomáson, 1%-ra csökkentett O2 tartalom mellett tárolni.

  • Szárított szomatikus embriók tárolása: sóoldattal víztelenített lucerna szomatikus embriók szobahőmérsékleten, 10-15% páratartalom mellett 1 évig megtartották életképességüket. Csírázóképességük csak 5%-kal csökkent.

  • Kapszulázott szomatikus embriók és rügyek tárolása: kapszulázott eperfa hónaljrügyek és szantálfa szomatikus embriók 45 napig életképesek maradtak 4 °C-on. Abban az esetben, ha a kapszulázott embriókat folyékony táptalajba helyezték, a tárolás 80–120 napra volt növelhető. Valeriana kapszulázott hajtáscsúcsait 6 hónapig lehetett tárolni.

5.10.3. Gyakorlati alkalmazás

A gyakorlatban jelenleg az ún. minimális fejlődési feltételeket (minimal growth conditions) biztosító eljárások váltak be és terjedtek el. Ezek egyszerűek, olcsók, nem járnak genetikai változással, és a tárolást követően az intenzív növekedés viszonylag gyorsan helyreállítható. A fenntartást az in vitro fejlődött hajtást vagy rügyet tartalmazó hajtásdarab friss táptalajra való átoltásával végzik. Elsőként MOREL professzor alkalmazta szőlő fajtagyűjtemény tárolására a hetvenes évek elején. A merisztémából regenerált hajtásokat 9 °C-on évi egyszeri átoltással tárolta.

A ‘Golden Delicious’ alma tenyészetei nem vesztették el növekedőképességüket 1 éves 1–4 oC-on történő tárolás során. Egy 0,28 m3-es hűtőszekrényben csaknem 2000 kémcsőtenyészetet lehetett elhelyezni. Ha ezeket az anyagokat egy almaültetvényben kívánnánk fa formában fenntartani, legalább 5–6 ha területre lenne szükség.

Hasonlóan alacsony hőmérsékleten tárolják a vírusmentesített szamócát (4 °C-on), burgonyát (8 °C-on) stb. A burgonya nemzetközi génbankjában, Limában még ozmotikus stresszt is alkalmaznak (4% mannitol) a tárolás során. Az átoltások gyakorisága fajtától függően 2 hónap és 2 év között változik. A hazai burgonya fajtagyűjtemény in vitro génbankjának kialakítását Heszky L. kezdte el már az 1970-es évek végén Tápiószelén, az Agrobotanikai Intézetben (5/14. ábra).

Kép

5/14. ábra: Merisztéma és hajtástenyészetek felhasználásánakvázlata a burgonya vírusmentesítésben, a genetikai tartalékok tárolásában és a szaporítóanyag- előállításban Vírusmentesítés: a merisztéma izolálás (2) célja, kórokozómentes tenyészetek előállítása (3–4). In vitro génbank: a kórokozómentes anyagok hajtástenyészetekben évente 1–2- szeri átoltással egyrügyes hajtásdarabbal, vagy mikrogumóval (6-8) a visszafertőződés veszélye nélkül korlátlan ideig tárolhatók (7–9). Vegetatív mikroszaporítás: steril szaporítás (10–12) a hajtástenyészetek nodális szegmentjeivel (8,11). Szaporítóanyag-előállítás: a mikroszaporítás utolsó lépése, amely magában foglalja az in vitro növények, mikrogumók edzését (13, 14), kiültetését üvegházba és fóliasátorba (15), valamint forgalmazását és szállítását (Heszky L.E.–Nagy M. 1987 nyomán)

A genetikai stabilitás biztosítása

A hajtástenyészetekben a fajták nehezen különböztethetők meg egymástól, ezért könnyen keveredhetnek. Az átoltások alkalmával rügymutánst vagy egy szomaklonális variánst is felszaporíthatnak, mivel a tenyészetben a legtöbb esetben megjelenésük nem jelent morfológiai változást. Ezért nagyon fontos, hogy a jövőben minden szaporításra vagy tartós tárolásra kerülő anyagról, fajtáról stb. molekuláris etalon fehérje (izoenzim), vagy nukleinsav (RFLP, AFLP) mintázatok készüljenek, amelyek a későbbi időszakban végzett ellenőrzés során a genotípus pontos azonosítását, illetve szerencsés esetben az esetlegesen bekövetkező változások észlelését tennék lehetővé.

5.11. Kriobank (krioprezerváció)

A növénytudományok egyik gyorsan fejlődő területe a kriobiológia, pontosabban a növényi sejtek, szövetek, szervek ultramélyhűtése, tárolása és növényregenerálás a fagyasztva tárolt tenyészetekből. Az ezzel kapcsolatos módszertani kutatási eredmények KARTHA (1986) összefoglaló munkájában részletesen megtalálhatók.

A krioprezerváción alapuló növényi génbank jelenleg a genetikai tartalékok merisztémáinak fagyasztását és ultramélyhűtött, korlátlan időtartamú és változatlan formában való megőrzését jelenti folyékony nitrogénben. A folyékony nitrogén hőmérsékletén (–196 °C) a sejtek anyacseréje, életfolyamatai gyakorlatilag szünetelnek.

A növényi krioprezervációs kutatások QUatrano 1968-as sejtszuszpenziós kísérleteivel kezdődtek. Az első sikeres fagyasztva tárolásról 1976-ban számoltak be. Mélyfagyasztott szegfű merisztémákból sikerült növényeket regenerálni. Ezt követően 1978-ban a szamóca, majd 1980-ban a burgonya, a borsó és különböző gyümölcsfajok merisztémáival végeztek sikeres kísérleteket.

A kezdeti eredmények ellenére a krioprezerváció – ellentétben az in vitro hajtástenyészetekkel – nem tudott elterjedni a génbank gyakorlatban. Ennek oka feltehetőleg az, hogy a túlélés a legtöbb fajnál még nem közelíti meg azt az értéket (80–100%), mely a gyakorlati bevezetés alapfeltétele.

Kép

5/15. ábra: A növényi krioprezerváció folyamata valamint a genetikai tartalékok kriobankban való megőrzésének főbb lépései (további részleteket lásd a szövegben)

A fagyasztva tárolás főbb lépései (5/15. ábra), megegyeznek más élőszervezeteknél, sejteknél alkalmazottakkal. Tehát magukba foglalják: 1. a kémiai fagyásvédelmet, 2. a lassú víztelenítést biztosító fagyasztást, 3. folyékony nitrogén hőmérsékleten való tárolást, 4. a gyors olvasztást, 5. a mosást, majd 6. a túlélés meghatározását, végül pedig 7. a növényregenerálást.

Az izolátummal szemben támasztott feltételek: kórokozó-mentesíthető legyen, reprezentálja az adott genotípust, és belőle a tárolást követően növények legyenek felnevelhetők.

A növények esetében ezért a krioprezervációra legalkalmasabb izolátumoknak a sejttenyészetek, a merisztámák (hajtáscsúcsok) és a szomatikus/zigotikus embriók bizonyultak.

5.11.1. Fagyásvédő előkezelések

A krioprezerváció sikerének kulcskérdése az, bármilyen izolátummal is dolgozunk, hogy képesek legyünk a sejten kívüli és a sejten belüli vizet eltávolítani, illetve a sejtben maradó vízből a jégkristályok képződését a fagyasztás és a felolvasztás során úgy módosítani, hogy az ne károsítsa a sejtet. A tényleges veszélyt a jégkristályok képződése jelenti először a fagyasztás során, másodszor pedig az újrakristályosodás, a felolvasztás folyamán. A következőkben bemutatott klasszikus technika lépései tulajdonképpen e veszély elkerülését szolgálják.

1. Izolátum

A fagyasztásnak legjobban a merisztematikus sejtek, tehát a kicsi, sűrű citoplazmával, kis vakuólummal rendelkező sejtek felelnek meg. Ezért célszerű a fagyasztáshoz intenzíven osztódó sejtszuszpenziókat, az embriógenezis korai (pl. gömb) stádiumában lévő zigotikus és szomatikus proembriókat, illetve a merisztéma legfiatalabb részeit használni. Érett embriók esetében a szikleveleket célszerű eltávolítani.

2. Donor növények előkezelése

Az izolálást megelőző hidegkezeléssel (4 °C) növelhető a túlélés.

3. A szövetek, sejtek előkezelése

Az egyik legkritikusabb fázis. Ebben a lépésben kell a sejtekből a szabad vizet eltávolítani úgy, hogy a sejtek, sejtközötti járatok ne tartalmazzanak olyan vizet, mely a fagyasztás során jégkristályokat képez. Az igazi veszélyt a jégkristályok jelentik, melyek károsítva a sejt membránszerkezetét, annak pusztulását okozzák. A viszonylag homogén sejtekből álló pl. állati sejttenyészetek helyett a növényi kriobankban embriókat és merisztémákat célszerű tárolni, melyek viszont sokféle típusú és korú sejtből állhatnak, ezért az előkezelésnek különböző stratégiái alakultak ki a növények esetében:

  • Fagyásvédő (krioprotektív) anyagok: sejttenyészetek, szomatikus embriók, merisztémák számára.

  • Szárítás (víztelenítés, dehidratálás, deszikkálás): zigotikus embriók esetében.

  • Kapszulázás: zigotikus és szomatikus embriók, merisztémák esetében.

  • Vitrifikálás: sejttenyészetek, merisztémák esetében.

a) Fagyásvédő anyagok

Alkalmazásuk sikerét koncentrációjuk és a kezelés időtartamának pontos meghatározása biztosítja. A leggyakrabban használt anyagok a dimetilszulfoxid (DMSO), a szacharóz, a szorbitol, a mannitol, és a polietilén-glikol (PEG). Ezek használhatók önmagukban és kombinációban, általában 5–6%-os koncentrációban.

b) Szárítás

A víztelenítésnek ez a módja történhet lamináris boxban, szobahőmérsékleten és átlagos páratartalom mellett, vagy szilikagéllel exszikátorban. Fontos, hogy az embriók víztelenítése lassú legyen (kíméletes szárítás). Víztartalmukat az eredeti 50–60%-ról kapszulázott embriók és merisztémák esetében 4–6 óra alatt 19–20%-ra, csupasz izolátumok esetében 10–16%-ra célszerű csökkenteni.

c) Kapszulázás

A szomatikus embriók kapszulázását a Mesterséges mag (5.9.) c. fejezet tartalmazza. A krioprezerválás céljából az embrió és merisztématenyészetek folyékony táptalajához Na-alginátot adunk (3%), majd azt követően pipettával egyenként kiemelünk egy-egy izolátumot, és olyan táptalajba cseppentjük, mely 100 mM CaCl2-ot tartalmaz. Az embriók és merisztémák körül ekkor átlagosan 4 mm átmérőjű burok alakul ki. A kapszulázott tenyészeteket néhány napig folyékony táptalajban kell tenyészteni, mely 0,3–0,5 M szacharózt tartalmaz. Az ezt követő szárítás szobahőmérsékleten történik (0–6 óra).

d) Vitrifikálás

A vitrifikáció azt a folyamatot jelenti, mely során a víz a fagyáspont alatt egy üvegszerű – nem kristályos – szilárd fázisba megy át. A vitrifikálás célja tehát a jégkristályok képződésének megakadályozása.

A jégkristályok kialakulásának két feltétele van. Egyrészt, hogy a vízben a vízmolekulák ún. jégmagokat alkossanak, másrészt a szabad víz jelenléte, mely a jégmagok körül kikristályosodik, illetve annak folyamatos növekedését biztosítja.

A jégmagok kialakulásának az alacsony, a kristályosodásnak pedig a magasabb hőmérséklet kedvez. A vitrifikáció, tehát az üvegszerűen megfagyó oldat a cukorkoncentráció növelésével érhető el (0,56 g víz/1 g szacharóz). Ez azonban nem jelent biztosítékot arra, hogy a felmelegítés során a devitrifikációt követően ne képződhessenek újra jégkristályok. Ezt a 0,43 g víz/1 g szacharóz oldat biztosítja.

A vitrifikáció tulajdonképpen a tenyészeteknek a permeálódó vagy nem permeálódó fagyásvédők tömény oldatába való helyezését jelenti. A vitrifikáló oldatok rendkívül koncentrált oldatok.

A menta merisztémák esetében 57%-os túlélést sikerült elérni, amikor a vitrifikáló oldat összetétele 1 M DMSO és 10% PEG (8000) volt. Vitrifikálhatók kapszulázott embriók és merisztémák is.

5.11.2. Fagyasztás, tárolás, olvasztás

Háromféle fagyasztási eljárás ismert: az egylépéses vagy gyors, a lassú vagy programozott, és a kétlépéses.

A gyors fagyasztás tulajdonképpen az előkezelt merisztémák közvetlen behelyezését jelenti a folyékony nitrogénbe. A hűtés sebessége több száz, illetve ezer fokra tehető percenként. Az ultragyors hűtés 4800 °C/perc sebességet jelent. A gyors fagyasztás előnye, hogy a kritikus hőmérséklet-tartományban megakadályozza az intracelluláris jégkristályok kialakulását. Gyors és egyszerű módszer, amely azonban jelenleg csak néhány faj (pl. szegfű, földimogyoró, manióka) esetében alkalmazható eredményesen. A gyors hűtés sikerrel alkalmazható az érett zigotikus – de már szárított (dehidratált) – embriók fagyasztására is.

Lassú fagyasztás. A programozott, kíméletes hűtés (0,5–1 °C/perc) megakadályozza a sejt víztartalmának kiáramlását a sejtközötti járatokba, és ezzel elősegíti az extracelluláris tér – a sejtek lehető legkisebb károsodását okozó – megfagyását. A sejt általában –30 és –40 °C között dehidratálódik, mértékét a fagyasztási sebesség, ebben a hőmérséklet tartományban való tartás időtartama (holding time), a használt fagyásvédő és a membránok permeabilitása befolyásolja.

Lassú fagyasztással sikeresen tárolták az alma, a manióka, a borsó, a burgonya és a szamóca merisztémáit, valamint különböző fajok szomatikus sejttenyészeteit.

Kétlépéses fagyasztás. A lassú fagyasztást általában a gyors fagyasztással kombinálják, és ezért hívják kétlépéses fagyasztásnak. A fagyasztás első lépését a lassú hűtés jelenti, mely általában –42 °C-ig tart. A lassú hűtési sebesség (0,5–1 °C/perc) célja az izolátumok kíméletes víztelenítése. Általában embriók, merisztémák és sejtkultúrák esetében használják.

A lassú fagyasztás során először a sejteken kívüli tápközeg fagy meg. Ennek következtében a sejtekben lévő víz elkezd a sejtekből kifelé áramlani, ami az izolátumok dehidratálódását eredményezi. A lassú hűtés végén –40 °C körül hosszabb rövidebb ideig tartani kell a tenyészeteket (holding time), az optimális dehidratáció elérése céljából.

A második lépést a gyors fagyasztás jelenti, a tenyészetek közvetlenül folyékony nitrogénbe helyezésével. E folyamat során ugyan megindul a sejtekben maradt szabad víz kristályosodása, de a mikrokristályok mérete olyan, hogy még nem károsítja a sejteket.

Tárolás. A tárolás folyékony nitrogénben történik (–196 °C-on), vagy annak gőzében (–150 °C-on), az e célból készült hűtőszekrényekben, -tartályokban vagy Dewar edényekben. A tárolás módja megegyezik az állattenyésztési vállalatok spermabankjaiban alkalmazott technológiával. A tárolás során a hőmérséklet nem emelkedhet –100 °C fölé, mert akkor bekövetkezhet a jégkristályok átrendeződése, ami a sejtek pusztulását eredményezheti.

Olvasztás. A fagyasztáshoz hasonlóan, kritikus pontja a sikeres krioprezervációnak. A lassú fagyasztással szemben, az olvasztásnak minél gyorsabbnak kell lennie. Ezt 40 °C-os vízfürdőbe helyezéssel érhetjük el. Az ultragyors felmelegítés sebessége 9000°C/perc. Ez utóbbi azért szükséges, hogy a viszonylag nagy víztartalmú szomatikus embriók és merisztémák sejtjeiben az újrakristályosodást megakadályozzuk.

Kép

5/16. ábra: Túlélés és növényregeneráció –196 °C-on tárolt sejttenyészetből. Fagyasztott kalluszok (hűtési sebesség 1 °C/perc, DMSO 15 %, transzfer hőmérséklet –20 °C) TTC tesztje. A túlélő sejtaggregátumok a formazántól vörösek. Holding time 0 perc (A), 30 perc (B). Növényreg neráció (C) 6 héttel a fagyasztás után (hűtési sebesség 1 °C/perc, prolin 12,5 %, transzfer hőmérséklet –30 °C) (Jekkel Zs., Heszky L. és mtsai kísérlete, SZIE, Genetika és Növénynemesités Tanszék, Gödöllő)

Növényregeneráció (5/16. ábra). A felolvadást követően az izolátumok fokozatos mosásával el kell távolítani a fagyásvédőt, majd azokat megfelelő táptalajra kell helyezni. A túlélést növekedés, illetve a növényfejlődés jelzi. Több mint 2 évig –196 oC-on tárolt szamóca merisztémák 75%-a, borsó merisztémák 60%-a volt képes növényregenerációra.

5.11.3. Az in vitro génbankok nemzetközi hálózata

A biotechnológia végeredményben két módszert is adott a kutatók kezébe, melyekkel a vegetatív úton szaporított növények megőrzése génbankban, pontosabban in vitro génbankban megoldható. Ezeknek a módszereknek a felhasználása a nyolcvanas évek elején felgyorsult.

Már létező in vitro génbankok a következők: a burgonya, 1500 fajta CIP (Centro Internacional de la Papa, Lima, Peru), a manióka, 600 fajta, CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Columbia) és a banán, IPGR (International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy).

Jelenleg a következő növények génbankjainak kialakítása van folyamatban:

  • gyökér és gumós növények: batáta, hagymafélék, tárógyökér és jamgyökér;

  • ipari növények: kakaó, kávé, cukornád, olajpálma, kókuszpálma, szőlő és gumifa;

  • gyümölcsfajok: banán, citromfélék, különböző trópusi és mérsékelt égövi gyümölcsfajok;

  • egyéb fajok : olajfa, szágópálma, datolyapálma, egyéb pálmafajok;

  • egyéb fafajok.

Az in vitro génbankokban kórokozómentes formában tárolt tenyészetekből felszaporított lombik növénykék postázásával megvalósulhat a kórokozómentes nemzetközi szaporítóanyagcsere. A jövőben nem kell attól félni, hogy a külföldről érkezett növénymintával annak kórokozóit is importáljuk.

Hazánkban, sok nemzetet megelőzve, a hetvenes évek végén és a nyolcvanas évek elején a tápiószelei Agrobotanikai Központban létesült a burgonya in vitro génbankja (149 fajta), melyet a csicsóka- , majd a hagymagyűjtemény kialakítása követett (HESZKY et al., 1983, 1987).

Végül visszautalva e fejezet címére, ,,in vitro génbank”, mely kifejezés alatt most, a XX. század végén azt kell értenünk, amit leírtunk. A XXI. században várhatóan megteremtődnek a molekuláris technikai feltételei annak, hogy a ,,génbankokban” valóban a géneket, tehát klónozott DNS szakaszokat vagy teljes genomokat (DNS) őrizzünk és tároljunk a maguk natúr formájában. Végül is a bennük tárolt genetikai információ az, amit meg kell őriznünk az utókor számára.

Felhasznált és ajánlott irodalom

Altman, A., B. Loberant (1998): Micropropagation: Clonal plant propagation in vitro. In: Altman A. (ed.): Agricultural Biotechnology 19–42. Marcel Dekker, Inc. New York–Basel– Hong-Kong.

Altman, A., M. Ziv., S. Izhar, (eds). (1999): Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. Kluwer Academic Publishers pp. 770. Dordrecht–Boston–London.

Ammirato, P. V. (1983): Embryogenesis. In: Evans, D. A.–Sharp, W R.–Ammirato, P. V. Yamada, Y. (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 1, 82–123. McMillan Publ. Comp., New York– London

Bajaj, Y. P. S. (1985): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 1. Trees. Springer V., Berlin–Heidelberg–New York.

Bajaj, Y. P. S. (1986): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 2. Crops. Springer V., Berlin–Heidelberg–New York.

Bajaj, Y. P. S. (1987): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 3. Potato. Springer V. Berlin–Heidelberg–New York.

Bajaj, Y. P. S. (1991): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation I. Springer V. Boston– Heidelberg–New York.

Bajaj, Y. P. S. (1992a): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation II. Springer V. Boston– Heidelberg–New York.

Bajaj, Y. P. S. (1992b): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation III. Springer V. Boston– Heidelberg–New York.

Bajaj, Y. P. S. (1992c): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation IV. Springer V. Boston– Heidelberg–New York.

Bajaj, Y. P. S. (1997a): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation V. Springer V. Boston– Heidelberg–New York.

Bajaj, Y.P.S. (1997b): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation VI. Springer V. Boston– Heidelberg–New York.

Barnabás B.: 1994. Preservation of maize pollen. In: Y. P. S. Bajaj, (ed.): Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. 25, 608–618.

Binh, D., Heszky, L. E., Gyulai, G., Kiss, E., Csillag, A. (1989): Plant regeneration from callus of Puccinellia distans (L.) Parl. Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 18: 195–200.

Bornmann, CH, H.: 1993. Synthetic seed. In: Hayward, M. D., N. O. Bosemark. I. Romagosa (eds). Plant Breeding. Principles and Prospects. Chapman and Hall, London.

Conger, B. V (ed.) (1986): Cloning Agricultural Plants Via in vitro Techniques. CRC Press. Inc. Boca Raton, Florida.

Croes, A. F. Derksen, R., Kemp, A., van Wezel, H. Barendse, G. W. M. (1986): Influence of the developing fruit on aging of the floral stalk tissue with respect to flower bud regeneration in vitro. J. Plant Physiol., 125, 61–68.
Deseuddre J.: Cryopreservation of in vitro cultures of plant cells and organs by vitrification and dehydratation. In: Dattée, Y., C.Dumas, A.Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 291–300. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg, New York.

Doré, C. (1987): Application of tissue culture to vegetable crop improvement. In: Green, C. E.–Somers, D. A–Hacket, W. P. –Biesboer, D. D. (eds.): Plant Tissue and Cell Culture. Alan R. Liss, Inc., New York, 419–432.

Dupnis, J. M., C. Roffat (1994): Pharmaceutical capsules as a coating system for artificial seeds. Biotechnology 12, 385–389.

EngelmanN N, F. (1992): Cryopreservation of embryos In: Dattée, Y. C., Dumas, A. Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 282–290. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg, New York.

Etiene, E., C. Teisson, D. Alvard, M. LartaUd, M. Berhouly, F. Georget, M. Escalona, J. C. lorenzo (1999): Temporary immersion for plant tissue culture. In: Altman, A., M. Ziv, S. Izhar (eds.). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 629–632. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston–London.

Fári M. (1986): Pepper (Capsicum annium L.) In: BAJAJ, Y P. S. (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry, 2. Crops. 1, 345–362. Springer Verlag, Berlin.

FujjII, J. A. Slade. D. T., Redenbaugh, K., Walker, K. A. (1987): Artificial seeds for plant propagation. Tibtech., 5, 335–339.

Gorst, J.R., R. D. Teasdale (1999): Robotic micropropagation for commercial forestry. In: Altman, A., M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 632–642. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston–London.

Green, C. E., Somers, D.A., Hacket, W P, Biesboer, D. D. (eds.) (1987): Plant Tissue and Cell Culture. Alan R. Liss, Inc., New York, 407–418.

Halperin, W. (1969): Morphogenesis in cell cultures. Ann. Rev. Plant Physiol., 20, 395–418.

Hartman R. D. (1999): Commercial micropropagation in the United States 1965–1998. In: Altman, A. M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 699–708. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston–London.

Haydu, Zs., Vasil, I. K. (1981): Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf tissues and anthers of Pennisetum purpureum Schum. Theor. Appl. Genet., 59, 269–273.

Heszky L. E., Enyingi K., Szabó I. (1983): Tissue culture technology for longterm storage and propagation of potato (Solanum tuberosum L.) germplasms. In: Sen. S. K., Giles, K. L. (eds.): Plant Cell Culture in Crop Improvement. Plenum, New York, 9–17.

Heszky L. E., Nagy M. (1987): In vitro conservation of potato germplasm in Hungary. In: Bajaj, Y. P. S. (ed.): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 3. Potato. Springer V. Berlin– Heidelberg–New York. 441–451.

Heszky L. E., Jekkel Zs., Abdel Hamid Ali (1990): Effect of cooling rate, cryoprotectant and holding time at different transfer temperatures on the survival of cryopreserved cell suspension culture (Puccinellia distans (L.) Parl.), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 21: 217–226

Heszky L. E. (1975) : Possible ways of morphogenesis in higher plants tissue cultures. Acta Agronomica, 24, 123–141.

Heszky L. E. (1973): Investigation at the early stage of embryogenesis into the development of the adventive embryo organized from a cell of the callus tissue in Daucus carota L. Acta Botanica, 22, 303–305.

Heszky L. E., Do, Q. B., Kiss, E., Gyulai, G. (1989): Increase of green plant regeneration efficiency by callus selection in Puccinellia limosa (Schur.) Holmbg. Plant Cell Rep., 8: 174–177.

Heszky L. E., Li Su Nam, Horváth, Zs. (1986): Rice tissue culture and application to breeding. Factors affecting the plant regeneration during subculture of diploid and haploid callus. Cereal Res. Comm., 14, 289–296.

Holdgate D.P., E. A. Zandvoort (1999): Security cost effective product quality an essential for sustainable business. In: Altman, A. M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 709–712. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston–London.

Hu, C. Y., Wang, P. J. (1983): Meristem, shoot tip and bud culture. In: Evans, D. A., Sharp, W. R ., Ammirato, P. V., Yamada, Y. (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. 1. Techniques for Propagation and Breeding. McMillan Pub. Comp., New York, 177–227.

Ibpgr (1982, 1983, 1984): Annual Reports. International Board for Plant Genetic Resources, Consultative Group on International Agricultural Research (CGIAR), Rome.

Jámbor B. E. (szerk.) (1993): Dísznövények mikroszaporítása. Jegyzet. Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Budapest, pp. 170.

Jámbor B. E., Neményi A., Szendrák E., Kusztor G. (1995): In vitro regeneration and morphological study of Drosera species and Dionaea muscipula (Ellis) I. In vitro regeneration. Horticultural Science, 27, 16–19.

Jámbor B. E., Neményi A., Szendrák E., Szafián Zs. (1997). in vitro propagation of Ailanthus altissima (Swingle) ’Purple Dragon’. Horticultural Science, 29, 22–25.

Jekkel Zs., Gyulai G. and Heszky L.E. (1995): Cryopreservation of some halophyte grasses (Puccinellia sp.). In: Y. P. S. Bajaj (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 32. Cryopreservation of Plant Germplasm I. 245–255. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg–New York.

Jekkel, ZS., G. Gyulai, J. Kiss, E. Kiss & L. E. Heszky (1998): Cryopeservation of horse-chestnut (Aesculus hippocastanum L.) somatic embryos using three different freezing methods. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 52: 193–197.

Kartha, K. K. (1984): Elimination of viruses. In: Vasil, I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Acad. Press. Inc., Orlando, Florida, 577–585.

Kartha, K. K. (1986): Production and indexing of disease-free plants. In: Withers, L. A. (ed.): Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications. Butterworths, London, 219–238.

Kartha, K. K. (1985): Cryopreservation of Plant Cells and Organs. CRC. Press, Inc. Boca Raton Florida.

Kartha, K. K. (1992): Use of Cryopreservation in Breeding Programs. In: Dattée, Y., C. Dumas, A. Gallais (eds.): Reproductive Biology and Plant Breeding. 301–310. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.

Kiss E., Kiss J., Gyulai G., Garcia G. P., Heszky, L. E. (1995): A novel method for rapid micropropagation of pineapple. Hort. Science 30, 1, 127–29.

Kozai, T., Q. T. Nguyen, C. Chun (1999): Environmental control in photoautotrophic micropropagation. in.: Altman, A. M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 655–658. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht Boston– London.

Li Su Nam, Heszky, L. E. (1986): Rice tissue culture and application to breeding: 1. Induction of high totipotent haploid and diploid callus from the different genotypes of rice. Cereal Res.Comm., 14, 197–203.

LI Su Nam, Heszky, L. E. (1988): Screening for plant regeneration in callus and protoplast cultures of alfalfa (Medicago stativa L.) germplasms. Acta Botanica, 33: 387–393.

Long, R. D., Cassels, A. C. (1986): Elimination of viruses from tissue cultures in the presence of antiviral chemicals. In: Whithers, L. A (ed.): Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications. Butterworths, London, 239–248.

Nagakubo, T., M. Takaichi, K. Oeda (1997): Micropropagation of Allium sativum L. (Garlic). In: Bajaj, Y. P. S. (ed): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 39, High Tech and Micropropagation V. 3–19. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg– New York.

O’Hair, S. K, Baker, C. M., Bryen, H. H. ( 1987): Fluid drilling of embryos in potato improvement – a future possibility. In: Bajaj,Y. P. S. (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. 3. Potato. Springer, Berlin–Heidelberg, 487–498.

Onishi, N.Y., Sahamoto, T., Hirosawa (1994): Synthetic seeds as an application of mass production of somatics embryos. PCTOC. 39, 137–145.

Osuga, K. A. Komamine (1994): Synchronization of somatic embryogenesis from carrot at high frequency as a basis for the mass production of embryos. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 39, 125–135.

Pierik, R. L. M. (1990): Rejuvenation and micropropagation. In: Nijkamp, H. J. J., L.H.W. van der Plas, J.van Aartrijk (eds.) Progress in Plant Cellular and Molecular Biology. 91–101. Kluwer Academic Press., Dordrecht–Boston–London.

Quak, F. (1977): Meristem culture and virus-free plants. In: Reinert, J.–Bajaj, Y. P. S. (eds.): Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell Tissue and Organ Culture. Springer, Berlin–Heidelberg–New York, 598–615.

Redenbaugh, K.–Viss, P. Slade, D.–Fujii, J.A. (1987): Scale–up: Artificial seeds. In: Green, C. E.–Somers, D. A.–Hacket, W. P.–Biesboer, D. D. (eds.): Plant Tissue and Cell Culture. Alan R. Liss, Inc., New York, 473–493.

Reinert, J. (1959): Über die Kontrolle für Morphogenese und Induktion von Adventivembryonen in Gewebekulturen aus Karotten. Planta, 53, 318–333.

REUTHER, G. (1984): Vegetables. (Asparagus.) In: Sharp, W R. et al. (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 2. Crop Species. McMillan Publ. Company, New York, 211–242.

Schuler, M. A.–Zielinski, R. E. (1988): Methods in Plant Molecular Biology. Acad. Press, New York–London.

Skoog, F.–Miller, C. O. (1957): Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental Biology, 11, 118–131.

Terzi, M., R. Cella, A. Falavigna (eds.) (1995). Current Tissues in Plant Molecular and Cellular Biology. Kluwer Academic Publishers, pp. 659–688

Thomas, E., Davey, M. R. (1975): From single cells to plants Wykeham Publ., London

TRAN THANH Van, K. (1973): in vitro control of de novo flower, bud, root and callus differentiation from excised epidermal tissues. Nature, London, 246, 44–48.

Törmälä, T. (1990): Genotype–phenotype interplay in micropropagation. In: Nijkamp, L. H. W. van der Plas, J. van Aartrijk (eds.) Progress in Plant Cellular and Molecular Biology. 102–107. Kluwer Academic Press. Dordrecht–Boston–London.

Vasil, I. K. (ed.) (1984): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Acad. Press Inc., Orlando, Florida, 82–95.

Vassányi R.–Balázs E. (1982): Az ELISA-technika alkalmazása a növényi vírusok kimutatására. 2. füzet, Növényvédelmi Kutató Intézet, Budapest, 1–10.

Vitropic–Cirad (1999): RITA Temporary Immersion System for Plant Tissue Culture.

Whithers, L. A., Alderson, P. G. (eds.) (1986): Plant Tissue Culture and its Agricultural Application. Butterworths, London, 69–84.

Whithers, L. A., F. Engelmann (1998): In vitro conservation of plant genetic resources, in: Altman, A (ed.) Agricultural Biotechnology. 57–88. Marcel Dekker, New York, Basel, Honkong.

Ziv., M. (1990): Morphogenesis of gladiolus buts in bioreactors. implication for scaled–up propagation of Geophytes. In: Nijkamp, L. H. W. van der Plas, J. van Aartrijk (eds.) Progress in Plant Cellular and Molecular Biology. 119–124. Kluwer Academic Press, Dordrecht–Boston–London.

Ziv, M. (1999): Organogenic plant regeneration in bioreactors. In: Altman, A. M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 673–676. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston–London.