Ugrás a tartalomhoz

Növényi biotechnológia és géntechnológia

Dudits Dénes, Heszky László

Agroinform Kiadó

2. fejezet - II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA

2. fejezet - II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA

4. Az ivaros szaporodás biotechnológiája (Heszky L.)

A növények szexuális reprodukciójának biotechnológiája, mint összefoglaló fogalom tulajdonképpen azokat a technikákat jelenti, melyekkel a növények reproduktív folyamatait in vitro steril körülmények között befolyásolni, módosítani tudjuk. Ezért ebben a fejezetben a növények ivaros folyamataiban résztvevő haploid és diploid (gametofitikus és sporofitikus) sejtek, szövetek és szervek, valamint a kettős megtermékenyítés eredményeképpen létrejövő zigotikus embriók laboratóriumi tenyésztésének módszereit és eredményeit foglaljuk össze.

Ezek a technikák voltak azok, melyekkel a növényi biotechnológia a XX. század elején elindult és melyek az első sikereket jelentették az 1910–50-es években. A 60-as, 70-es években a pollenhaploid növények felnevelésével – átmenetileg – a figyelem újra e módszerekre terelődött. Napjainkban az izolált gaméták (OP) tenyésztése és mesterséges fúziója az, ami új lendületet adott a növényi biotechnológia e klasszikus területe fejlődésének.

4.1. Embriókultúra

Az embriótenyésztés az embriógenezis különböző stádiumában lévő zigotikus embrió kipreparálását, ontogenezisének fenntartását és befolyásolását jelenti táptalajon, steril, klimatizált feltételek között.

Célja, hogy az embriók növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges feltételek mesterséges biztosításával kifejlett ,,csírázóképes” embriókat kapjunk, mely feltétel megvalósulása esetén számos gyakorlati cél elérése is lehetővé válhat.

4.1.1. Az embriógenezis jellegzetességei in vivo

Mielőtt részletesen rátérnénk a növényembriók tenyésztésére, röviden tekintsük át a zárvatermők embriógenezisének és magfejlődésének főbb jellegzetességeit. Folytassuk ott, hogy a kettős megtermékenyítést követően mi is történik az ováriumban az érett mag kialakulásáig.

Az embriógenezis a zárvatermőkben különböző típusú lehet. A megtermékenyült petesejt a falregenerációt követően inekválisan osztódik. A nagyobbik, bazális sejtből az egysejtsoros csírafüggesztő (szuszpenzor) alakul ki, a kisebb apikális sejtből pedig az embrió differenciálódik. Míg az embriógenezis első lépései közel azonosak a különböző taxonokhoz tartozó növényeknél, addig a későbbi lépésekben jelentős különbségek mutatkoznak. Ezzel azonban részletesen nem foglalkozunk.

Kép

4/1. ábra: Kétszikű növények in vivo embriógenezisének és magfejlődésének vázlata. A virágban (1) egy magház (ovárium) (o) fejlődik, amelynek belsejében gyakran több magkezdemény (mk) helyezkedik el; a megtermékenyítést követően a magkezdemények embriózsákjaiban a zigóta első osztódásából az embrióiniciális (ei) és a szuszpenzoriniciális (szi) sejt keletkezik; az utóbbiból alakul ki a szuszpenzor (sz), illetve a bazális sejt (szb); az embrióiniciális sejt további osztódása során az embriófejlődés kezdeti szakaszai (ek); a gömbstádium (6–7–8), a szívstádium (9) és a torpedóstádium (10) figyelhetők meg; ez utóbbi két stádiumban az embrió polárissá válik a gyökér (gy) és a hajtás (h)merisztématájak szétválásával; az érett magban (3) az embriót tápláló szövetek, az endo-, illetve a perispermium (ps) veszik körül

A kétszikű embriók fejlődése – a néhány sejtes proembrió állapotot követően – jellegzetes morfológiai stádiumokkal (gömb, szív, torpedó stb.) jellemezhető (4/1. ábra). Ezt a szövetdifferenciálódás (protoderma, prokambium, alapmerisztéma stb.) kíséri, illetve követi, mely folyamat végén az embrió eléri csírázóképességét. Az embrió polaritását az egyik póluson a gyökércsúcs (gyökérmerisztéma), a másikon a hajtáscsúcs (hajtásmerisztéma) és a két sziklevél adja.

Az egyszikű embrióé több tekintetben eltér az előbbi fejlődéstől. Egy sziklevél (scutellum) alakul ki, amelyen fekszik az embrió (4/2. ábra). A mezokotiltól oldalirányban helyezkedik el a koleoptil által fedett rügyecske (plumula), másik irányban pedig a koleorrhiza által fedett gyököcske (radicula).

Kép

4/2. ábra: Az egyszikű növények in vivoembriógenezisének és magfejlődésének vázlata A virágban (1) egy magház (2) és azon belül egy magkezdemény (mk) helyezkedik el; a megtermékenyülést követően a zigóta osztódásával keletkező egyik sejtből (szi) a csírafüggesztő (sz) a másikból (ei) az embrió (e) alakul ki; ennek további szerveződésével alakul ki a csíra teste (9); csak egy sziklevél (s) alakul ki, amelyen fekszik az embrió; az embrió a nem végálló rügyecskéből (plumula) (h) csíratengelyből (mesocotyl) (m) és a gyököcskéből (radicula) (gy) áll. Ezeket zárt hüvely, a koleoptil és a koleorrhiza takarja (10). A kifejlett embrió (11) a szemtermés (3–4) alapi pólusán helyezkedik el és az endospermiummal (e) való kapcsolatát a sziklevél (scutellum) (s) biztosítja

A különböző fajok embriógenezisének időtartama eltérő (15–150 nap). Az érett magban az embriók helyzete, mérete, fejlettségi állapota is jelentősen eltérhet, melyeknek ismerete a sikeres izolálás szempontjából különösen fontos (4/3. ábra). Az embriók egy része a teljes anatómiai és élettani fejlettség elérését követően csíraképes, egy másik részének további érésre, nyugalmi periódusra, száradásra stb. van szüksége a csírázóképesség megszerzéséhez.

Kép

4/3. ábra: A kifejlett embrió (fekete szín) mérete, fejlettsége és elhelyezkedése különböző fajok érett magvaiban

E vonatkozásban meg kell különböztetnünk a fiziológiás nyugalmi állapotot a valódi (dormancia, dormancy) nyugalomtól. Az embrió fiziológiás nyugalmi fázisa (quiescence) tulajdonképpen a vízvesztés eredménye (a mag beérik), mely állapot azonnal megszűnik, amikor a mag (embrió) újra vizet vesz fel. A valódi nyugalmi állapot során az embrió csírázásának gátlása a magban felhalmozódó növekedésgátló anyagok következménye. Ez a nyugalom – fajtól függően – évekig is tarthat.

4.1.2. Története

Többek szerint valószínűleg BLOCINEVSKl 1876-ban volt az első, aki – SACHS 1862-es sikertelen próbálkozása után – sikerrel nevelt fel – még nem aszeptikus körülmények között – zab- és rozsembriókat. Az első, mai értelemben vett modern embriókultúrát HANNIG alkalmazta 1904-ben. A végső méretük (8 mm) 1/4-ére nőtt Raphanus és Cochlearia embriókat sikerrel tenyésztett cukorral kiegészített ásványi tápközegben, steril körülmények között. Húsz évvel később DIETRICH 1924-ben különböző fűfajok fejlődő embrióit sikerrel nevelte agaros és cukros Knop-oldaton. Ő észlelte először a ,,künstliche Frühgeburt” jelenségét, vagyis azt, hogy az in vitro nevelt embrió – még nem teljesen kifejlett (nem érett) állapotban lévő – csíranyugalom nélkül csírázik. Néhány évvel később LAIBACH 1925-ben és 1929-ben már hibrid embriók sikeres tenyésztéséről számolt be. A Linum perenne x L. austriacum keresztezésekből alig 2 hetes hibrid embriókat sikerrel nevelt 10–15%-os cukortartalmú tápoldattal átitatott vattán.

Az ezt követő 30 évben (1930–1960) az embriótenyésztés a növényi szövettenyésztés eredményes kutatási területévé vált. Ez idő alatt számos táptalajt, komplex növényi kivonatot, metodikát próbáltak ki, aminek során tisztázódtak az embriótenyésztés fizikai, kémiai, élettani feltételei. Ennek az időszaknak legismertebb kutatói, a teljesség igénye nélkül, WHITE, TUKEY, RANDOLPH, RAppApORT, BLAKESLEE, VAN OvERBEEK, LA RUE, NORSTOG, MAHESHWARI, JOHRI, RAGHAVAN voltak.

4.1.3. Módszere

a) Izolálás

Az embriótenyésztés technikája fő vonalaiban megegyezik a virágszervek kultúráival. Az izoláláskori sterilitás bizonyos értelemben könnyebben megoldható, hiszen az embriók in vivo az ováriumon és a magkezdeményen belül is tulajdonképpen steril körülmények között fejlődnek. Az izolálandó proembrió mérete a fajtól és a megtermékenyítéstől eltelt napok számától függ (3–30 nap). Az embriógenezis korai fázisában (gömb, korai szív) levő proembriókat általában az ovulumnedvből, illetve a fejlődő folyékony endospermiumból kell kiemelnünk. E műveletet csak mikroszkóp alatt végezhetjük, hiszen méretük ekkor még 50–500 µm. Túlélésük általában 0–40%.

E fejlődési állapotban lehetőség szerint a szuszpenzorral (egysejtsoros csírafüggesztő) együtt kell táptalajra helyezni a proembriókat, mert bebizonyosodott, hogy a tápanyagfelvételben a szuszpenzornak in vitro is szerepe van. A fejlődés későbbi fázisában (torpedó, szikleveles, sétabot stb.) a fejlődő sziklevél veszi át ezt a szerepet. Méretük akkor már elérheti, sőt fajtól függően meg is haladhatja az 1 mm-t. Kipreparálásuk a magkezdeményből már könnyebb. Az embriók kompaktabbak, nem áttetszők, könnyen megkülönböztethetők és elválaszthatók a fejlődő endospermiumtól, illetve a magkezdemény többi szövetétől (4/4. ábra). Túlélésük már eléri a 80–100%-ot.

Kép

4/4. ábra: A vöröshere (Hungaropoly 2n=4x) embriójának in vivo fejlődése a gömb stádiumtól a sétabot fokozatig a megporzást követő első 20 napon. A fejlődő embriók a következő főbb stádiumba sorolhatók; gömb (1–2), előszív (3–4), szív (5–6), korai torpedó (7–9), torpedó (10–12), késői torpedó (13–16), sétabot (17–20); az embrió 20 nap alatt 0,1 mm-ről 2,8-mm-re növekedett (H. Enyingi K., Heszky L.E. 1973).

b) Táptalaj

Az embriók mesterséges felnevelésének, pontosabban az embriógenezis feltételeinek in vitro biztosítása az embriófejlődés élettani és biokémiai hátterének alaposabb ismeretét igényli.

Az embriókultúra szempontjából az embriógenezis két fő szakaszra osztható, az első heterotróf és a második autotróf szakaszra. E kétféle fejlettségű embrióban az anyagcsere egyes folyamatai más utakat követnek.

Szervetlen sók. A heterotróf stádiumú proembriók korai abortálását in vitro legegyszerűbben a KCl és a CaCl2 koncentrációjának növelésével lehet elkerülni. A fiatal embriók túlélését javítja továbbá az ammóniumsók és a Fe-EDTA mennyiségének csökkentése, a mikroelemek koncentrációjának növelése.

Szénhidrátok. A legáltalánosabban használt szénhidrát az embriókultúrában is a szacharóz. A szénhidrátoknak jelen esetben azonban egy speciális szerepük is van, a táptalaj megfelelő ozmolaritásának biztosítása a tenyésztett embrió számára. Az éretlen magkezdemény nedve és a fejlődő endospermium ozmotikus értéke az embriógenezis során általában csökken. A kezdeti érték gyapotnál 980 kPa, a Capsella-nál 823 kPa, a babnál 69 kPa, in vivo. A kísérletek bebizonyították, hogy in vitro ezeknél az értékeknél nagyobb ozmotikus nyomást kell a táptalajban biztosítani. Ez általában 8–15%-os kezdeti szacharóz koncentrációt jelent a korai szív stádiumú embriónál, amelyet fokozatosan csökkenteni kell 4%-ra (korai torpedó stádium), majd 1%-ra (torpedó stádium), 0,1%-ra az érés során, és végül 0% ra az érett embrió állapotban. E módszer tökéletesített változatában a szacharóz koncentráció végig 2% marad, és a megfelelő ozmózisos nyomást a sejt anyagcseréje szempontjából inaktív szénhidráttal, a mannit koncentrációjának változtatásával érhetjük el.

Nitrogén. A napraforgó tenyészetekben a nagy ozmolaritás mellett biztosítani kell a megfelelően alacsony nitrogén koncentrációt (C/N=10,0 körüli érték) más fajok esetében, pl. szója, árpa viszont növelni kell a nitrogén koncentrációt úgy, hogy ammóniumvegyülettel részben helyettesítjük a cukrokat a megfelelő ozmotikus érték elérésében. Az embriótenyészetekben leggyakrabban az NH4NO3 és a KNO3 szolgál szervetlen nitrogénforrásként.

A különböző aminosavak és azok amidjai közül a glutamin stimulálja legjobban az embriók fejlődését. Néhány Cruciferae fajnál az aszparagin is hasonlóan serkentő hatású volt. Az aminosavak komplex keverékét tartalmazó kazeinhidrolizátum (CH) szintén általánosan használt. Önmagában egy aminosavval sem tudták elérni a CH kedvező hatását, de 20 aminosav keverékével már igen, ami az aminosavak szinergista hatására is utal. A CH mint ozmotikum képes helyettesíteni a szénhidrátok hasonló hatását (nagy ozmózisos érték), azonban a fejlődésüket befejezett embriók csírázását gátolja.

Természetes növényi kivonatok. Az embriótenyésztés módszerében fordulópontot jelentett VAN OVERBEEK munkássága, aki a 40-es évek elején elsőként használta fel a kókuszdiótejet (CM), torpedóstádiumú Datura embriótenyészetekben. Ezt követően általánosan használt kiegészítés lett. Hatását valószínűleg a benne található cukrok, aminosavak, növekedésserkentő és más anyagok okozzák, amelyek sok esetben a táptalajból egyébként hiányozó vegyületeket jelentenek az embriónak. Ezeket az anyagokat ,,embriófaktor”-nak nevezték el, és hőstabilnak bizonyultak.

Természetesen számos más növekedésserkentőt is kipróbáltak, mint pl. fejlődő kukoricaszem, banán- és datolyakivonatok, paradicsomlé, rozsendospermium, valamint endospermium tenyészet stb.

Az endospermium tenyészetek, mint táplálóközegek az elmúlt évtizedben különböző hibrid embriók (Trifolium, Triticum, Lotus stb.) túlélését tették lehetővé.

Növekedésszabályozó anyagok. A növekedésszabályozó anyagok alkalmazása nem feltétele a sikeres embriótenyésztésnek. Talán ezzel is magyarázhatók az embriókultúra sikerei századunk elején. Ezeknek az anyagoknak a szerepe különösen az embriók csírázásában ismert. Az abszcizinsavról (ABA) bebizonyosodott, hogy használatával meggátolható az in vitro nevelt embriók korai csírázása. Ha a táptalajban ABA is van, nincs szükség a fiatal embriók tenyésztése közben nagy ozmózisértékre. Ezzel szemben a gibberellinek serkentik az embriók korai in vitro csírázását. Az auxinok, a citokininek nem nélkülözhetetlenek, bár kis koncentrációban az embriógenezist serkentették. A kifejlett embriók tenyésztése során általában már nincs szükség hormonokra.

c) Tenyésztési feltételek

A táptalajok szilárdítására általában 0,5–1,5% agart használnak. A kisebb koncentráció, amely gélszerűen képes az embriót körülvenni, kedvezőbbnek bizonyult.

A folyékony táptalajok kis oxigénkoncentrációja serkentette a sziklevelek fejlődését és meggátolta a korai csírázást, csökkentette a hipokotil megnyúlását, végül is elősegítette a normális embriófejlődést. Ez a hatás feltehetőleg az in vivo körülményekhez leginkább hasonló feltételeknek az eredménye.

Az optimális pH 4,5–5,5, a tenyésztési hőmérséklet 15–30 °C között van. A proembriókat első időszakban sötétben, majd folyamatos vagy periodikus megvilágításban inkubálják. Az embriógenezis későbbi fázisaiban lévő embriók tenyésztésekor azonnal folyamatos, vagy periodikus lehet a megvilágítás. Természetesen fajtól és kísérleti céltól függően eltérések lehetnek.

4.1.4. Az embriókultúrák csoportosítása és felhasználása

Az embriókultúrák felhasználási lehetősége az embriók fejlettségétől és az alkalmazott módszertől függ. Az embriókultúrák szempontjából az embriógenezis in vitro két fő szakaszra és 3 stádiumra osztható:

 I. heterotróf szakasz: a proembriónak a táptalajban kell biztosítani minden szervetlen és szerves tápanyagot;

II. autotróf szakasz: az embriógenezis annyira előrehaladott, hogy az embrió pusztán szervetlen sókat és szénforrást tartalmazó tápközegben is továbbfejlődik;

 1. autonóm stádium: fejlődésben lévő embrió, mely azonban már képes a csírázásra;

 2. élettani érettség stádiuma: az embrió elérte teljes embrionális differenciáltságát, de nem képes a csírázásra (csíranyugalom);

 3. ökológiai érettség stádiuma: teljesen kifejlett, érett és csíraképes embrió.

Az embriógenezisnek az embriókultúra szempontjai szerinti leírt stádiumai azért lényegesek, mert RIJVEN javaslatára – az izolált embriók fejlettsége alapján – az embriótenyésztést két típusra osztják fel. Az egyik a proembrió (pregerminal) kultúra, a másik a tulajdonképpeni fejlett-embrió (postgerminal) kultúrák. E kettős csoportosítást a táptalaj összetételének és ozmózisos nyomásának eltérései is indokolják.

A proembrió tenyésztés esetében az embriókat az embriógenezis heterotróf fázisában, vagy az autotróf fázis autonóm, illetve élettani érettségű stádiumában excizálják. Ez általában a gömb- és szívstádiumú proembriók tenyésztését jelenti.

A fejlett-embrió tenyésztés létesítésekor viszont már vagy ökológiai érettségű, vagy teljesen kifejlett embriókat izolálnak. A torpedó- és szikleveles stádiumú embriók tartoznak ebbe a csoportba.

4.1.5. A proembrió kultúrák céljai, módszerei és eredményei

A proembrió tenyésztés célja az izolált proembriók embriógenezisének fenntartása in vitro és a kifejlett embriók, valamint növények felnevelése. A nemesítési és a genetikai célok is életképes növények előállítását igénylik.

A heterotróf fázisban izolált proembriókat – amelyek embriógenezise csak csírázást gátló táptalajon tartható fenn – az embriógenezis végén csírázást indukáló táptalajra kell helyezni. E célra kiválóan megfelel a Difco-Orchid tápközeg. Az autotróf fázis autonóm, illetve élettani érettségű stádiumában izolált proembriók fejlődése olyan táptalajon is fenntartható, amelyen az embriógenezis után az embrió azonnal csírázik.

Mindezekből következik, hogy a proembrió kultúrákat olyan esetekben kell használni, amikor a petesejt megtermékenyül, azonban – in situ – az életképes csírák (embriók) kialakulásának valamilyen akadálya van. Ebben az esetben az embriókultúra felhasználásának célja – a normális embriógenezist akadályozó posztzigotikus endogén és exogén faktorok hatásának kiküszöbölésén keresztül – életképes növények felnevelése (4/5. ábra).

Kép

4/5. ábra: Az embriókultúra felhasználásának vázlata haploidok és távoli fajhibridek előállítása céljából. Az in situ keresztezést (1) követően az ováriumban (2) a „bulbosum”-technika esetében a zigóta első osztódásai során az egyik keresztezési partner kromoszómái eliminálódnak (3). Ezért az in vitro felnevelt embriók (5–6) és növények (7–8) haploidok lesznek. A távoli hibridizáció során kapott hibrid embriók (9) az ovulum- (anya) szövettel való inkompatibilitásuk miatt elpusztulnának. Az embriógenezis korai stádiumában kipreparált (10–11) hibrid embriókból in vitro hibrid növények (12–13) regenerálhatók

Felhasználási területei:

– fajkeresztezés,

– nemzetségkeresztezés,

– valenciakeresztezés,

– bulbosum technika,

– minden olyan esetben, amikor in situ a normális embriógenezisnek valamilyen akadálya van.

 A valencia-, faj- és nemzetségkeresztezések túlnyomó részében, valamint az idegentermékenyülő növények öntermékenyítésekor, a megporzás után a petesejt megtermékenyül, azonban az embriógenezis során zavarok lépnek fel az embrió és az endospermium fejlődésében, amelyek gyakran az embrió abortálásához vezetnek (posztzigotikus inkompatibilitás). Ha az embriót a degenerálódás előtt sikerül kipreparálni és olyan mesterséges környezetbe helyezni, amelyben a további növekedés és fejlődés feltételei biztosítottak, normális sporofitonok nevelhetők fel. E megállapítást számos kutatási eredmény igazolta.

a) Faj- és nemzetséghibridek előállítása

Az azonos vagy különböző nemzetségekbe tartozó fajok keresztezésének leggyakoribb célja valamilyen értékes tulajdonság génjének átvitele (introgressziója) vad fajokból valamilyen kultúrfajba.

Fajhibridek. A fontosabb nemzetségek, melyeken belüli fajok keresztezéséhez sikerrel alkalmazták az embriókultúrát HESZKY (1972), COLLINS és GROSSER (1984), DUNWELL (l986), HU és WANG (1986), Pickersgill (1993) összefoglaló munkái alapján a következők:

Abelmoschus Corchorus Iris Oryza

Agropyron Cucumis Lathyrus Phaseolus

Allium Cucurbita Lilium Pinus

Arachis Datura Linum Rubus

Brassica Diospyros Lotus Solanum

Bromus Glycine Lycopersicon Trifolium

Carica Gossypium Medicago Triticum

Carthamus Helianthus Melilotus Vigna

Cerasus Hordeum Nicotiana

Chrysan-themum Impatiens Ornithopus

A fajkeresztezésekben az embrió abortálásának különböző okai lehetnek. A hibrid embriók korai abortálásának legfontosabb oka, hogy a proembriót tápláló endospermium hiányzik, vagy fejlődésében zavarok lépnek fel. Az embrió abortálásának időpontja szoros összefüggésben van azzal, hogy az endospermium fejlődésében a zavarok mikor kezdődnek.

A Vicia keresztezésekben ennek időpontja a megtermékenyítést követő 3. nap volt, ezért a hibrid embriók még nem érhették el azt a stádiumot, amikor már preparálhatók és tenyészthetők. A Phaseolus fajkeresztezésekben az endospermium degenerálódódása 3 héttel a megporzás után kezdődik, amikor az embriók már a szívstádiumot is elérték, ezért a hibridek (P.vulgaris x P.acutifolius) proembrió tenyésztéssel előállíthatók voltak. A harmadik típust a Triticale jelenti, melyben az endospermium fejlődése zavart ugyan, de nem annyira, hogy a hibrid embriók abortáljanak.

Az endospermium fejlődésében bekövetkező zavarok okai lehetnek genetikaiak (zavarok a sejtosztódásban, pl. Triticale), vagy élettaniak (eltérések a növekedésszabályozó anyagok koncentrációjában, pl. Phaseolus hibridek).

A hibrid embriók abortálását az anyai szövetben bekövetkező fejlődési zavarok is okozhatják. Ilyen pl. a Lycopersicon és Capsicum esetében az integumentum szövet legbelső sejtsorának – az endotél sejteknek – proliferációja. Ennek következtében ez a szövet az embriózsákba türemkedik. Mivel e sejtrétegnek jelentős szerepe van a táplálásban, degenerációja az embrió elhalását eredményezi.

Végül is a proembriótenyésztés azokban a hibrid kombinációkban vezethet sikerre, ahol az embrió abortálása a gömbstádiumot követően, pl. korai szívstádiumban következik be. Ezek az embriók már az autotróffá válás határán vannak. A gömbstádiumú embriók még teljesen differenciálatlanok, polarizációjuk még nem teljes, ezért könnyen kalluszosodnak, illetve belőlük gyakran anatómiailag torz embriók fejlődnek. Ennek elkerülése érdekében dolgozták ki a két lépéses ,,in vitro in ovulo” embriótenyésztést.

In vitro in ovulo embriótenyésztés. Az első lépésben a gömbstádiumú hibrid embriót tartalmazó ovulumokat kipreparálják és ovulumtenyésztéssel tartják fenn a normális embriógenezist, steril körülmények között, táptalajon. Az ovulum izolálás ideje fajtól függően a megporzást követő 2.–12. napon történhet. Az ovulumban a proembriók fejlődése és táplálása egyrészt még ,,természetes” úton történik, továbbá a nagy ozmolaritást is az ovulumnedv biztosítja. Természetesen ezt a táptalajjal is biztosítani kell, ezért azok fajtól függően 10–120 g/l szacharózt tartalmaznak. Az ovulumtenyészetekből akkor kell kipreparálni a hibrid embriókat, amikor azok elérték a táptalajon való tenyészthetőség stádiumát.

Az in vitro in ovulo embriókultúra felhasználásával sikerrel neveltek fel fajhibrideket a Helianthus, Glycine, Gossypium és Allium nemzetségeken belül.

Kép

4/6. ábra: A Lolium perenne L. (2x) és a Festuca arundinacea Screb. (6x) nemzetséghibridjének előállítása a hibrid embriók mesterséges felnevelésével. A megporzás után kipreparált 6–7 napos proembriók (A–B) folytatják fejlődésüket a kazeinhidrolizátummal kiegészített Nitsch-táptalajon (C), és a tenyésztés 10. napján csírázásnak indulnak (D). A fejlődő hibrid növények (E–F) jelentős vegetatív heterózist mutatnak a két szülőfajhoz képest (G); balról jobbra: Lolium perenne, hibrid, Festuca arundinacea (Heszky L.E., 1972: Agrobotanika, 14. 71–76).

Fontosabb nemzetséghibridek, amelyeknek előállításában az embriókultúrát sikerrel használták fel, HESZKY (1972), COLLINS és GROSSER (1984), Hu és Wang (1986), Molnár–Láng (1999) összefoglaló munkái alapján a következők:

Aegilops squarrosa x Triticum boeoticum

Aegilops squarrosa x Triticum aestivum

Agropyron ciliare x Triticum aestivum

Agropyron trachycaulum x Triticum aestivum

Agropyron tsukushiense x Triticum aestivum

Hordeum californicum x Secale cereale

Hordeum jubatum x Secale cereale

Hordeum geniculatum x Triticum aestivum

Hordeum vulgare x Secale cereale

Hordeum vulgare x Triticum timopheevi

Hordeum vulgare x Triticum aestivum

Lolium perenne x Festuca arundinacea (4/6. ábra)

Lolium temulentum x Festuca pratensis

Triticale x Triticum monococcum

Triticum aestivum x Agropyron distichum

Triticum aestivum x Agropyron scirpeum

Triticum aestivum x Agropyron junceum

Triticum aestivum x Agropyron intermedium

Triticum aestivum x Hordeum bulbosum

Triticum aestivum x Hordeum vulgare (4.7. ábra)

Triticum aestivum x Secale cereale

Triticum aestivum x Triticale

Triticum durum x Secale cereale

Triticum turgidum x Agropyron distichon

Triticum durum x Elymus arenarius

Tripsacum dactyloides x Zea mays

Kép

4/7. ábra: Búza-árpa transzlokációk kimutatása genomikus in situ hibridizációval, a búza x árpa nemzetséghibridek búzával kétszer visszakeresztezett utódaiban A teljes árpa DNS jelölése fluorogreennel történt. A hibridizáció eredményeként az árpa kromoszómák és kromoszóma szegmentumok jelölődtek és zöldessárgára színeződtek. A kontraszt festést propidium- jodiddal (A és B) és DAPI-val (4´–6´-diamidinofenilindol) (C és D) végezték, így a búzakromoszómák vörösek (A és B) vagy kékek (C és D) (Lángné Molnár M. és mtsai kísérlete, MTA Mg. KI, Martonvásár)

b) Valenciakeresztezések

Egy faj különböző ploidszintű változatainak keresztezésekor a fajkeresztezéshez hasonló embrióabortálás figyelhető meg. A Lolium, a Trifolium és a Primula különböző autopoliploid alakjainak keresztezésekor sikerrel alkalmazták az embriótenyésztést.

c) Haploidok előállítása bulbosum technikávalA genom elimináción alapuló haploidok előállításának – 1971-ben KASHA és KAO által felfedezett – speciális módszere. Lényege, hogy a H. vulgare (O) x Hordeum bulbosum (P) keresztezését követően, a hibrid zigóta osztódásai során a H. bulbosum kromoszómái eliminálódnak. Ezért a fejlődő embrió csak a H. vulgare haploid (n) – jelen esetben monoploid (n = x) – genomjával rendelkezik.

A haploid (n=x) embrió csak egy ideig tud fejlődni a diploid ovulumban (2n=2x) és általában 7–14 nap után abortál. Ezeknek az embrióknak mesterséges felnevelésével haploid H. vulgare növények állíthatók elő.

A módszer tehát a H. bulbosum kromoszómáinak eliminációján alapul, ezért kromoszóma eliminációs technikának is nevezik. Maga az elimináció az inkubációs hőmérséklettől is függ. A kritikus hőmérséklet 23 °C. Ez alatt a regenerált növények között csökken a haploidok száma a hibridekhez képest.

Módszere. A H. vulgare növényeket a megporzás előtt célszerű 16 órán keresztül 18 °C-on, majd 8 órán keresztül 12 °C-on tartani. A H. bulbosum-ot előzőleg vernalizálni (10 °C, 8–10 hét, 8–10 órai megvilágítás) kell azért, hogy virágozzon. A kasztrálást követően diploid H. bulbosum pollennel végezzük a megporzást. A megporzott kalászokat gibberellinsavval (217 µM) kezelhetjük. A megporzás után 14 nappal az embriókat kipreparáljuk és szilárd táptalajra (1/2 MS) helyezzük. A kéthetes sötétben végzett inkubációt követően fényre helyezzük a tenyészeteket (12–15 óra). A regenerálódó csíranövénykéket kolchicinnel kezeljük [2,5 µM kolchicin + 2% dimetil-szulfoxid (DMSO), 5 óra, 20 °C-on]. A kezelést követően a növények kiültethetők, fajtól függően vernalizálandók.

A módszer felhasználásával 1980 és 1990 között több új árpafajtát állítottak elő Kanadában, Angliában és Új-Zélandon.

A tetraploid H.bulbosum-mal a Triticum aestivum haploid alakjai is előállíthatók. A haploidok gyakorisága azonban a búza esetében kisebb a portokkultúrához képest.

A távoli keresztezésen és genom elimináción alapuló ún. bulbosum technika napjainkban más keresztezési kombinációkban is használhatónak bizonyult. Ilyen például a búza x kukorica keresztezés, mellyel haploid búza ma már rutinszerűen állítható elő (4/8. ábra). Ezenkívül sikerült haploid búzát a kölessel keresztezve is előállítani.

Kép

4/8. ábra: Bulbosum technika. Távoli keresztezések során bekövetkező kromoszóma eliminációra alapuló haploid növényelőállítás főbb lépései

A különböző haploid indukciós módszerek hatékonyságát összefoglalóan a Portokkultúra c. fejezetben, a 4.2.5 pontban mutatjuk be.

d) Egyéb esetek, amikor a normális embriógenezisnek valamilyen akadálya van

A nemesítési és genetikai kutatások eredményességének egyik sarkalatos feltétele, hogy sok esetben csak 1–2 növényből álló különleges értékű anyagból utódnemzedékeket lehessen felnevelni. A szántóföldi termesztés során ezeket az értékes növényeket azonban számos olyan hatás érheti (pl. viharkár, fagykár, vakond kár, kártevők stb.), amelyektől vagy az egész növény, vagy a generatív szervek elpusztulnak a magvak érése előtt. Ezekben az esetekben a pusztuló növényekből izolált embriók in vitro felnevelése megmentheti az értékes genotípust.

A faj- és nemzetség-, valamint a valenciakeresztezések során felhasználható az embriókultúra olyan esetekben is, amikor nagyszámú keresztezés esetén in situ is kaphatunk életképes csírát tartalmazó magvakat (pl. Triticale). Ilyen esetekben az embriókultúra célja a meghatározott keresztezési variációból minél több növény felnevelése, ami sok esetben elengedhetetlen tartozéka a további sikeres munkának (pl. amfidiploidok előállítása).

4.1.6. A fejlett-embrió tenyészetek céljai, módszerei és eredményei

Az embriókultúrák e típusának célja az izolált, részben vagy teljesen kifejlett embriók csírázásának indukálása és növények felnevelése. Táptalajai a proembrió kultúrák összetételéhez képest egyszerűbbek. Általában makro- és mikroelemeken kívül csak glükózt és szacharózt tartalmaznak.

A kultúrák létesítésekor élettani vagy ökológiai érettségű embriókat, vagy érett magvakból teljesen kifejlett embriókat (csíra) izolálnak.

 DIETRICH már 1924-ben megfigyelte, hogy a kis ozmózisos nyomású táptalajra helyezett embriók az embriógenezis befejezése után – nyugalmi periódus nélkül – azonnal csíráznak.

Mindezekből következik, hogy a fejlett-embrió kultúrákat olyan növényfajoknál érdemes használni, amelyeknél a magvak érési ideje, illetve a csíra nyugalmi szakasza hosszú. Ezért a fejlett embrió tenyésztésének célja a csírázást gátló endogén és exogén faktorok hatásának kiküszöbölésén és a csírázás indukálásán keresztül életképes növények felnevelése.

Felhasználási területei:

a mag hosszú érési idejének lerövidítése és ezzel a generációváltás gyorsítása;

csíranyugalom megszüntetése és ezzel a generációváltás meggyorsítása;

steril magfejlődés megakadályozása;

minden olyan eset, amikor a normális csírázásnak in situ valamilyen akadálya van.

A csíranyugalom megszüntetése és a generációváltás gyorsítása.

A csíranyugalmat – pontosabban azt a tényt, hogy a mag rövidebb-hosszabb ideig vagy egyáltalán nem tud csírázni – több tényező okozhatja: a/ a mag kiszáradása (vízvesztése), aa/ csírázásgátló anyagok felhalmozódása a magban, aaa/ a mag keményhéjúsága. A fejlődő magból az embriókat a teljes érés előtt, a beszáradást és a gátló anyagok felhalmozódását megelőzve kell kipreparálni és azok embriótenyészetekben hamarosan kis csíranövénnyé fejlődnek.

Az érés időtartama elérheti egy növény tenyészidejének 50–60 %-át (pl. szója, napraforgó, tavaszi gabonák, kukorica stb.), tehát jelentős időmegtakarítást érhetünk el, ha a következő generáció egyedeit az embriók mesterséges felnevelésével állítjuk elő. Ez az időmegtakarítás az egynyári növények esetében 1–3 hónap, évelő növények esetében 1–3 év, sőt több is lehet (4/9. ábra).

Kép

4/9. ábra: A generációváltás gyorsítása a mag érési és a fiziológiás csíranyugalmi, valamint a dormancia fázisok kiiktatásával

E módszer felhasználásával kukoricából évente 2 generációt, gabonafélékből 2–3 generációt is felnevelhetünk. Ennek nagy jelentősége van a növénynemesítésben azoknál a módszereknél, melyek sok generáció felnevelését igénylik, ilyenek pl: single seed descent (SSD) módszer, introgressziós nemesítés (rezisztenciagén, hímsterilitás átvitele), backcross módszer, transzgén átvitele egyik fajtából a másikba stb.

4.2. Portoktenyésztés (in vitro androgenezis)

A portokkultúra a fejlődés meghatározott stádiumában lévő pollent tartalmazó portokok (antérák) kipreparálását, a mikrospórában pedig az androgenezis indukcióját és fenntartását jelenti táptalajon, steril, klimatizált feltételek között.

Célja a gamétákból redukált ploidszintű növények (pollenhaploidok) felnevelése in vitro. Az androgenezis a növények esetében a mikrospórából, vagy a fiatal pollen valamelyik haploid sejtjéből történő növényfejlődés folyamatát jelenti.

A mikrogametogenezis jellegzetességei in vivo

A növények sporofita fejlődési szakasza a mikrospóra-anyasejtekben végbemenő meiózissal lezárul. Eredménye a tetrád, amelyben 4 haploid, egymagvú mikrospóra található (4/10. ábra). A mikrospórák további fejlődése a mikrogametogenezis, amely során az érett (2 vagy 3 sejtes), tömlőhajtásra és termékenyítésre alkalmas pollenszemek alakulnak ki.

Kép

4/10. ábra: A mikrogametogenezis folyamata in vivo (magyarázat a szövegben)

A posztmeiotikus mikrospóra további fejlődése a pollenszem falának (exine és intine) kialakulásával kezdődik. Mivel ekkor citoplazmaszintézis még nincs, a mikrospórában egy nagy központi vakuólum keletkezik. Az ún. egymagvas vakuólumos fejlődési állapot alakul ki, melyet a mikrospórasejtmag első mitotikus osztódása (pollenmitózis-I) követ. Ez in planta aszimmetrikus osztódást jelent, amelynek során ún. vegetatív és generatív sejtek keletkeznek. Ez a kétsejtes fiatal állapot.

Ezt követően a vegetatív mag (vsm) G1 fázisban marad, és az intenzív plazmaszintézis eredményeként a vakuólum lassan eltűnik. A generatív mag (gsm) fajtól függően vagy a pollenkiszóródás (antézis) előtt vagy a tömlőhajtáskor osztódik (3 sejtes állapot), létrehozva a kettős megtermékenyítésben résztvevő hím ivarsejteket. Az ,,érett” pollenszem tehát citoplazmával telt, és két vagy három sejtmagot tartalmaz.

A mikrogametogenezis pontos ismerete azért fontos, mert korai szakaszában a fejlődés sporofitikus irányba (androgenezis) is kiváltható.

Története

A portoktenyésztéssel kapcsolatos kutatások az 1930-as években kezdődtek. A kutatások célja ekkor még nem a növényregenerálás, hanem a mikrosporogenezis és a mikrogametogenezis folyamatainak fenntartása és vizsgálata volt. Ezekben a kísérletekben azonban a mikrospóra fejlődése az ,,érett” pollenszem kialakulásával lezárult. Ezért nem meglepő, hogy amikor LA Rue 1952-ben egy nemzetközi botanikai kongresszuson néhány nyitvatermő faj pollenjének szövetszerveződéséről számolt be, a kutatók azt ,,a képzelet vad szárnyalásának” tartották.

Csaknem egy évtizedet kellett várni, amikor is 1965–66-ban két indiai kutató GUHA és MAHESHWARI elsőként számolt be azokról a vizsgálatokról, amelyeknek során nagyszámú haploid embrioidot (embrió), illetve növényt tudtak felnevelni a Datura innoxia pollenjéből portokkultúrában. Részletes citológiai vizsgálatokkal bizonyították a soksejtes pollenszem és az ,,embriószerű struktúrák” polleneredetét. Eredményeikre alapozva széleskörű kutatás kezdődött az egész világon, amelynek során először 1967-ben a francia Nitsch-nek különböző Nicotiana fajok, majd 1968–1969-ben Niizeki és Oono japán kutatóknak az Oryza sativa haploid alakjait is sikerült előállítani. Napjainkig már mintegy 80 nemzetség csaknem 300 növényfajának pollenjéből sikerült az in vitro androgenezis indukciójával haploid kalluszt, embriót, illetve növényt előállítani.

4.2.1. Pollenembriógenezis indukcója

A portokkultúra – az embrió, ovárium, ovulum stb. kultúrákkal szemben, ahol a tenyésztés célja az in vivo fejlődési folyamatok fenntartása – minőségileg új utat jelent, nevezetesen, hogy a tenyésztett sejtek (pollen) fejlődését egy teljesen új pályára, a gametofitonról a sporofitonra kell átállítani in vitro.

Ez természetesen csak a génműködés regulációjába való beavatkozással lehetséges. Molekulárisan egy sejtet csak abban az esetben lehetséges egy másik differenciálódási útra állítani, ha a korábbi determinációt töröljük (a génaktivitást leállítjuk), illetve az új determinációt, tehát az új irányú fejlődést meghatározó gének működését ki tudjuk váltani.

Tehát az in vitro sikeres androgenezisnek két feltétele van, az egyik (A), hogy a tenyészetben legyenek olyan mikrospórák melyekben a gametogenezis determinációja még nem következett be, a másik pedig (B), hogy ezekben a mikrospórákban az ontogenezis programját indukálni lehessen.

(A) Androgén mikrospórák. A mikrospóra fejlődésének ismert az a rövid periódusa (egysejtes vakuólumostól a korai kétsejtes pollen állapotig), melyben a gametogenezis determinációja még nem következett be. Tehát ezekben a sejtekben nem kell törölni más programot, ezek a sejtek elvileg totipotensnek tekinthetők, továbbfejlődésük bármilyen irányba indukálható.

Ha ez így igaz lenne, akkor minden izolált mikrospórából haploid növényt lehetne felnevelni. Azonban nem így van. Ennek magyarázatára felállított hipotézis szerint nem minden mikrospóra alkalmas az androgenezisre, hanem csak azok, melyek fejlődése a portokban ,,hibás” volt. Ezek a pollenszemek kicsik, kevés és nehezen festődő citoplazmát tartalmaznak, keményítő nem vagy alig halmozódik fel bennük. Ez az alapja a pollendimorfizmus elméletnek, mely alapján androgenezisre képes és nem képes mikrospórákat különböztetnek meg és melyek egyaránt előfordulnak a portokban. Tehát csak a pollenszemek egy része (S vagy P-pollen) az, amely genetikailag alkalmas (nem determinált a gametogenezisre) arra, hogy belőle egy embrió, majd növény alakuljon ki.

(B) Ontogenezis indukálása. Abból a célból, hogy a pollen sporofita fejlődése – az arra alkalmas pollenszemekben – ténylegesen be is következzen, a folyamatot kiváltó indukcióra van szükség. Napjainkra egyre inkább bizonyítottnak vehető, hogy a totipotens sejtnek valamilyen stresszre van szüksége ahhoz, hogy az ontogenezis programja aktivizálódjon. A pollen esetében ezt jelentheti a többhetes hideg (5 °C) előkezelés, a több napos ,,éheztetés”, a nagy 2,4-D koncentráció, a hőstressz (32 °C), az ozmotikus stressz (pl. só, cukor), stb.

A stressz esetében is csak akkor tud a mikrospóra ontogenezis választ adni, ha a sejtciklus megfelelő fázisában van. Ez a G2-fázis, mely néhány napos N éheztetéssel érhető el a mikrospóra tenyészetekben.

A stressz indukciót követően az androgén típusú mikrospórák fejlődése egy új irányban, az ontogenezis irányában folytatódik, mely végül is pollen eredetű, zömében haploid embriók vagy kallusz és azokból növények differenciálódását eredményezi.

4.2.2. A pollenhaploidok ontogenezise

Az előbbiek alapján a zárvatermők mikrospórája morfogenetikai szempontból még labilis sejtnek tekinthető. A mikrosporogenezis bizonyos szakaszában tehát még nincs determinálva a továbbfejlődés iránya, ami lehetővé teszi a sporofita fejlődés, az ontogenezis indukcióját.

A haploid sporofita fejlődés szempontjából az egy sejtmagvas vakuólumos mikrospóra állapot körüli (4/11. ábra) izolálás a legkedvezőbb.

Kép

4/11. ábra: A búza mikrospóra androgenetikus fejlődése in vitro. Az egymagvas vakuólumos pollenszem stádiumban (A) történő izolálás esetén a pollenmitózis I. (B) kétféle leánysejtet eredményezhet, egy vegetatív és egy generatív sejtet (C) vagy két vegetatív típusú sejtet (D); a soksejtes pollen kialakításában mindkét esetben csak a vegetatív sejtek vesznek részt (E,F), az első esetben keletkező generatív sejt nem osztódik, fokozatosan elszeparálódik (E) (Heszky L. E.–Mesch J., 1976 nyomán)

Az izolálást követően az átmenet a gametofita fejlődésből a sporofita irányába általában néhány órától néhány napig tarthat a fajtól, a hőmérséklettől, a sporofita fejlődés típusától stb. függően.

A sporofita osztódások során minden esetben soksejtes pollenszemek alakulnak ki portokokban (4/12. ábra). Vannak ettől eltérő fejlődési formák, amelyek azonban nem vezetnek embrió vagy növény kialakulásához.

A soksejtes pollenszemek három (A, B, C), egymástól jól elkülöníthető úton alakulhatnak ki.

Kép

4/12. ábra: Haploid és dihaploid (DH) növények felnevelésének alternatív útjai portokkultúrában. A táptalajra izolált egymagvas vakuólumos mikrospóra sporofita fejlődés alternatív útjai (1–7, 1–9, 1–11) során soksejtes pollenszem (12) alakul ki. Az abortív utakat a tömlőt hajtó (4), az összezsugorodott (3), a soksejtmagvas (2) és a hipertrófiás (5) pollen kialakulása jelentik. A soksejtes pollenből közvetlenül pollen embriógenezissel (13–14) vagy közvetve, kalluszfázison keresztül embriógenezissel (15–17), vagy organogenezissel (18–21) regenerálhatók a növények

Az A típusú fejlődés (4/12/6–7. ábra) a mikrospóra sejtmagjának aszimmetrikus mitózisával kezdődik és a soksejtes pollenszem a pollenmitózis-I után a vegetatív sejt további osztódására vezethető vissza (4/11/A–C–E ábra). A generatív sejt maximum egyszer osztódik, de általában nem funkcionál, degenerálódik.

A B típusú fejlődés (4/12/8–9. ábra) magosztódással kezdődik, amelynek során két hasonló diffúz sejtmag alakul ki, a generatív és a vegetatív mag helyett. Ha az osztódást a sejtfal kialakulása is kíséri, a két haploid sejt egyaránt részt vehet a sporofita fejlődésében (4/11/B–D–F ábra).

A C típusú fejlődés (4/12/10–11. ábra) az A–B pályához hasonlóan mitózissal kezdődik, és a pollenmitózis-I után kialakuló két sejtmag fuzionál. A fúziót követően doubled haploid (DH) sejt (2n) keletkezik. Ezekből közvetlenül DH embriók és növények fejlődhetnek.

Az A, B és C pályákon kialakult soksejtes pollenszemek (4/12/12. ábra) további differenciálódása pollenembriókat (4/12/13. ábra) vagy proliferációja pollenkalluszt (4/12/15. ábra) eredményezhet. A pollen embriógenezist követően – általában még a primer tenyészetekből – haploid, illetve doubled haploid növényeket nevelhetünk fel (4/12/14. ábra). A haploid kallusz tenyészetekben általában külön táptalajon kell indukálni a növényregenerálódást, amelynek a szomatikus tenyészetekhez hasonlóan két útja lehetséges: embriógenezis (4/12/16. ábra) vagy organogenezis (4/12/18–21. ábra).

Összefoglalva megállapítható, hogy a haploid sporofita fejlődés általában a mikrospóra sejtmagra vagy a vegetatív sejtre vezethető vissza, amelyeknek további osztódásai során soksejtes pollenszemek alakulnak ki (4/13/A–D ábra). A soksejtes pollenszemekből pollen embriógenezis (4/13/E–F ábra) vagy pollenkallusz- és organogenezis-indukcióval nevelhetők fel haploid növények.

Kép

4/13. ábra: Pollenembriógenezis a dohány portokkultúrájában. A mikrospóra sporofita fejlődése a pollenembriógenezis néhány napos lag-periódusa után indul meg. Az izolálást követő 6. naptól két- (A), három- (B), hét- (C) sejtes pollenszemek figyelhetők meg a portokban. Ezt követően az exine felreped (D) és a soksejtes proembrió az izolálást követő 3–5. héten eléri a gömb (E), a szív és a torpedó stádiumokat (F) (Heszky L. kísérlete Agrobotanikai Intézet, Tápiószele)

Az androgenezis típusainak és fejlődési fázisainak ismeretére alapozva BARNABÁS és mtsai (1991–1999) in vitrokolchicinkezelési módszert dolgoztak ki az egymagvas mikrospóra haploid kromoszómaszerelvényének megduplázására. A módszer lényege, hogy a portokkultúra táptalaját 0,01–0,04% kolchicinnel kell kiegészíteni. A kolchicin hatására az első pollen mitózis doubled haploid sejteket eredményez. A kolchicin a búza esetében növelte a szimmetrikus osztódás gyakoriságát, a kukorica esetében azonban ez nem volt megfigyelhető. Az androgenezis későbbi fázisában a kolchicinnek semmiféle káros hatása már nem mutatható ki. Javítja viszont a pollenembrió gyakoriságot. A módszerrel a DH növények gyakoriságát a búza esetében 20%-ról 60%-ra, a kukorica esetében 0%-ról 100%-ra lehetett növelni. A módszert sikerrel alkalmazták a doubled haploidok közvetlen felnevelésére különböző fajok portok és pollen tenyészeteiben.

4.2.3. Androgenetikus poliploidia

Az in vitro androgenezis B és C pályáinak (4/12. ábra) citológiai vizsgálata megerősítette a portok kultúrából regenerálható különböző ploidszintű növények polleneredetét.

A fontosabb fajok, amelyek tenyészeteiből n, 2n, 3n, 4n és 8n alakokat is regeneráltak, a következők: Atropa belladonna, Datura innoxia, Datura metel, Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum, Oryza sativa, Petunia hybrida, Solanum nigrum és Solanum verrucosum.

 A poliploidia a pollenszemben az androgenezis indukcióját követő osztódások során előforduló endoreduplikációra, illetve a sejtmagok fúziójára vezethető vissza.

Mivel az így kapott poliploid növények végeredményben haploid sejtekből keletkeznek, homozigótáknak (autodiploid) tekinthetők.

Néhány faj (Solanum tuberosum, Secale cereale) portokjaiban viszonylag nagy gyakorisággal fordulnak elő redukálatlan mikrospórák. Az ezekből felnevelt diploidok viszont heterozigóták, az eredeti genotípus klónjainak tekinthetők, ezért nemesítési értékük nincs.

4.2.4. Módszere

A portokkultúra módszere technikailag viszonylag egyszerűnek tűnik. A megfelelő fejlődési stádiumban lévő pollent tartalmazó portokok steril izolálásából, táptalajon való tenyésztéséből és a haploid növények regenerálásából áll. A módszer alkalmazásának eredményességét azonban több tényező is befolyásolja, melyek a következők:

a) A donor növények genotípusa

A genotípusos függőség azt jelenti, hogy azonos módszerek alkalmazása mellett is egy fajon belül – a fajták, törzsek és vonalak között – nagy eltérések lehetnek az androgenezis gyakoriságában. Ezt számos fajnál (búza, rizs, árpa stb.) bizonyították. Az ún. reszponzív (válaszadó) genotípusokra történő szelekcióval, a táptalajok optimalizálásával, a regenerálóképesség keresztezéssel való átvitelével a genotípusos determináltság csökkenthető. A jó és rossz válaszadó genotípusok keresztezése általában intermedier utódokat eredményezett a búzában, az árpában, a kukoricában, a burgonyában és a repcében. Búza diallél kísérletben bizonyították, hogy a haploid gyakoriság legalább 3 függetlenül öröklődő gén által meghatározott.

b) A donor növények környezeti feltételei és kora

Különböző növényfajok (dohány, olajrepce, búza stb.) részletes vizsgálataiból nyilvánvaló, hogy annak a környezetnek a jellemzői, amelyben a donor növények fejlődnek, jelentősen befolyásolhatják a kultúrák eredményességét. Ezek közül a fotoperiódus, a fényintenzitás és az alacsony hőmérséklet hatását már bizonyították. A virágzás elején izolált virágok androgénebbek, mint a végén izoláltak. A nitrogénhiány viszont egyértelműen kedvezőnek bizonyult az optimális műtrágyázással szemben.

c) A donor virágok, virágzatok előkezelése

Az előkezelés általában hidegkezelést jelent, pl. burgonyánál 2 °C és 2 nap, árpánál 4 °C és 3–28 nap, repcénél 4–5 °C és 3 óra.

d) A portokok, mikrospórák előkezelése

Az előkezelés során a kipreparált és táptalajra helyezett portokokat vagy mikrospórákat az inkubáció előtt rövidebb-hosszabb időre stressz körülmények közé helyezzük. Ezt jelentheti a magas (32 °C) hőmérséklet, nagy 2,4–D koncentráció, nagy NaCl koncentráció vagy más ozmotikus stressz a táptalajban, pl. glutamin mínuszos, vagy szerves és szervetlen nitrogén hiányos táptalajon való éheztetés (5–6 nap) stb. Természetesen az egyes értékek és időtartamok fajtól függően változnak.

 e) Táptalaj

Annak ellenére, hogy dohány pollenből vizet és agart tartalmazó táptalajon is – bár rendkívül kis hatékonysággal – növényt lehet regenerálni, a regenerált haploid növények számára a táptalaj többi komponensének is jelentős hatása van.

A makro- és mikroelemek sóinak koncentrációját a legáltalánosabban használt táptalajok esetében, mint pl. MS (dohány) és az N6 (gabonafélék), célszerű a felére csökkenteni. Különösen a vas koncentrációja fontos azoknál a fajoknál, amelyeknél a pollenembriógenezis indukciója vasfüggőséget mutat. Ezeknél a fajoknál (kivétel a dohány), a Fe-EDTA koncentrációját célszerű 40–150 µmol-ra növelni.

A szacharóz koncentráció attól függ, hogy az érett pollen hány sejtmagvú. A hárommagvas fajoknál (Gramineae, Cruciferae) a nagyobb (6–15% ), míg a kétmagvasoknál (Solanaceae), a kisebb (2–5% ) az optimális. A maltóz javította az embriógenezis indukciót petúniánál és a búzánál.

Hasonló a helyzet a 2,4–D-vel is. A Gramineae és a Cruciferae fajok általában igénylik az auxin kiegészítést, a Solanaceae fajok nem.

Fajtól függően az aktív szén, az inozit, a glutamin stb. alkalmazásával növelni lehetett az androgenezis gyakoriságát. A táptalaj szilárdítására agar helyett célszerű a szervetlen Gelrite-t, esetleg keményítőt használni.

f) Inkubáció

A portoktenyészeteket a pollenkallusz vagy a pollenembriók megjelenéséig célszerű sötétben tartani. A hőmérséklet általában 25–30 °C. A Brassica fajoknál 1–2 napos 35 °C-os tenyésztés serkentőleg hatott. A búzánál a 26 °C, a kukoricánál a 29 °C az optimális. A kevés adat ellenére úgy tűnik, hogy a tenyészedényben lévő portokok számának (denzitás), az etilén, a nitrogén és a széndioxid koncentrációjának növelésével fokozható a pollenembriók száma.

A növényregeneráláskor legalább 3000–10000 lux erősségű megvilágítás szükséges. A megvilágítás erősségének mindig korrelációban kell lennie a hőmérséklettel.

g) Doubled haploid (DH) növények előállítása

A portokkultúra gyakorlati jelentőségét az esetek többségében nem a haploid növények jelentik, hanem a belőlük előállítható doubled haploid alakok (4/14. ábra). A nemesítő szempontjából tehát amellett, hogy rendelkezünk egy módszerrel, amellyel a korábbiakhoz képest nagyobb gyakorisággal tudunk haploidokat indukálni, legalább olyan fontos, hogy rendelkezzünk olyan módszerekkel is, amelyekkel a haploidokból egyszerűen, viszonylag gyorsan és főleg megbízhatóan lehet homozigóta növényeket (DH-vonalakat) előállítani.

Kép

4/14. ábra: Virágzó haploid (n = 24) (A) és diploid (2n = 48) (B) dohánynövények és kromoszóma-számuk (C, D) (Heszky L.E. – Paál H., 1972: Bot. Közlemények, 59. 125–127. nyomán)

DH növényeket kaphatunk a tenyészetekben spontán rediploidizációval vagy kolchicin kezeléssel.

A portok tenyészetekben bekövetkező spontán rediploidizáció esetén bizonyítanunk kell a közvetlenül felnevelt DH növények haploid eredetét. Spontán rediploidizáció előfordulhat még a haploid növények virágzataiban is (árpa, rizs). Az így kapott DH magvak valószínűleg a haploid (n) növényeken kialakuló redukálatlan gaméták (n) keletkezésének és fúziójának (2n) eredményei. A haploid sejteket, tenyészeteket kezelhetjük kolchicinnel in vitro (lásd 4.2.2. pontnál). A rediploidizálás klasszikus módja a haploid növények, illetve azok hajtás- vagy virágrügyeinek, virágzatának kolchicin kezelése.

4.2.5. Androgenezis, ginogenezis, parthenogenezis, távoli keresztezés módszerek hatékonysága

Az ivaros szaporodás biotechnikáinak bemutatásakor már utaltunk arra, hogy az használható-e és hogyan a haploid növények előállítására. E pontban összefoglaljuk és összehasonlítjuk a korábban bemutatott módszereket a növénynemesítés szempontjából. A 4/1. táblázat 4 különböző megközelítést és 8 különböző technikát tartalmaz.

Kép

In vitro androgenezis

A mikrospóra eredetű haploidok felnevelhetők portok és mikrospóra tenyészetekben. Az in vitro androgenezisen alapuló technikával állították elő a legtöbb (több száz) növény haploid alakját. Felhasználási köre tulajdonképpen elvileg nem korlátozott. A portokban a pollenszemek száma 1000-től (árpa) 40000-ig (dohány) változhat (4/15. ábra). A regenerálható haploid növények gyakorisága 0,065 (árpa) – 5,0 (dohány) a mikrospórák százalékában. Hátránya, hogy a nem haploid növények pollen eredete nehezen bizonyítható, továbbá, hogy bizonyos növénycsoportokban (pl. Triticum fajok) az albinók aránya nagyon magas. A Triticum durum faj tenyészeteiben a pollenhaploidok 100%-a albinó. Az árpán végzett molekuláris vizsgálatok bizonyították, hogy az albinizmusért a plasztisz genomban bekövetkező változások (replikációs hibák, deléciót és egyéb átrendeződéseket eredményező rekombinációk) a felelősek. Mások nukleáris gének hatását is feltételezik. Jelenleg csak a tenyésztési feltételek optimalizálásával lehet javítani a zöld növény kihozatalt. Az utóbbi jelentősége egyre fokozódik, mert a magasabbrendű növények sejttenyészetei közül egyedül az izolált mikrospóra szuszpenzió jelent a szó igazi értelemében különálló sejteket (single cell) tartalmazó tenyészetet. Sajnos még kevés azon fajok száma, melyekre a mikrospóra tenyésztés módszere rutinszerűen kidolgozott lenne. A portok kultúra viszont univerzális technikának tekinthető a legfontosabb kultúrfajok vonatkozásában.

Kép

4/15. ábra: Repce portoktenyészetek SEM elemzése. A tenyészetbe vont portok (A) és hosszmetszeti képe (B). A porzó keresztmetszeti képe a négy pollenzsákkal (C). Egy pollenzsák közeli képe (D). A több sejtsoros (epidermisz, rostos réteg, köztes réteg, tapétum) portok fala a fejlődő pollenekkel (E). Repce pollen 14 napos inkubáció után (F). (Gyulai G, Kiss E. és Heszky L. 1993, Magyarország kultúrflórája VI. 4: 56–62).

In vitro ginogenezis

A petesejt (embriózsák) eredetű haploidok felnevelhetők termékenyítetlen ováriumok és ovulumok tenyészeteiben. Az androgenezistől eltérően az embriózsák állapotának a szerepe még nem bizonyított az indukció sikerében. Egy ovulumból (ováriumból) több növény is fejlődhet (pl. árpa). Hatékonysága 1–10% (pl. búza, hagyma), az izolált ovulumokra vonatkoztatva. A cukorrépa ováriumában viszont 100 ovulum is fejlődhet. A módszer hátránya hasonló a portok kultúráéhoz, azaz a diploid és poliploid regeneránsok haploid eredetét nehéz bizonyítani.

In vitro parthenogenezis

A parthenogenezis a női gametofiton (embriózsák) valamelyik haploid sejtjéből kiinduló embriófejlődést jelenti. A folyamat lényege, hogy a haploid sejt valamilyen külső hatásra osztódni kezd és haploid embriót hoz létre.

Az in vitro parthenogenezis jelenlegi technikái az embriózsák eredetű haploidok felnevelését jelentik a csökkent életképességű pollennel megporzott ováriumokból és ovulumokból. A pollen életképessége csökkenthető besugárzással (1000 Gy) vagy kémiai úton toluidinkékkel (nyár, cukorrépa).

Távoli keresztezés

E módszer alkalmazása esetén haploidokat kétféle úton kaphatunk, s parthenogenezissel (phureja-technika) és posztzigotikus kromoszóma eliminációval (bulbosum-technika).

a) Phureja-technika. A burgonya (Solanum tuberosum) tetraploid faj 2n=4x= 48 (haploidjai dihaploidok 2n= 2x=24) előállítására dolgozták ki a diploid S. phureja speciális mutánssal való (2n= 2x=24) keresztezés módszerét. A S. phureja genotípus érdekessége, hogy a pollenjének fejlődése során elmarad a II. pollenmitózis, ezért csak 1 generatív sejtje van. Ez a sejt a fejlődő pollentömlőn keresztül bejutva a S. tuberosum embriózsákjába, annak vagy a petesejtjével vagy a központi sejtjével fúzionál. Az esély 50–50%. Abban az esetben, ha a központi sejtet termékenyíti meg, a fejlődésnek indult endospermium kiváltja a haploid petesejt osztódását, parthenogenezisét. Ennek eredménye az lesz, hogy a fejlődő magvak egy része (10–40%) ginogenetikus eredetű haploid lesz.

b) A bulbosum technika (részletesen lásd a 4.1.5. pontban) alkalmazásával azokban a keresztezési kombinációkban lehet haploid embriókat előállítani, melyekben a megporzást követően van termékenyülés, de a zigóta első osztódásai során az apa faj genomja 100%-ban eliminálódik, viszont a hibrid embriók fejlődése folytatódni tud olyan fejlettségi stádiumig, amikor embrió, illetve „in vitro in ovulo” embriótenyészetben életben tarthatók. Az embriókultúrákban felnevelt növények haploidok lesznek. E technika különösen alkalmas haploid tavaszi árpa (H. vulgare x H. bulbosum), illetve haploid búza (T. aestivum x Zea mays) előállítására. Az utóbbi esetében a hibrid embriók túlélése kalászka kultúrával javítható. Kalászonként átlag 30 virág porozható meg és ebből 3–5 haploid növény (10–17%) nevelhető fel.

4.2.6. Genetikai és nemesítési jelentőség

Az előzőekben bemutatott in vitro módszerek – az élővilágban szinte egyedülállóan – a magasabbrendű növényekben lehetővé teszik a ploidszint redukcióját. A növénynemesítőnek tehát nemcsak a növények ploidszintjének növelésére (poliploidizáció), hanem annak a csökkentésére is lehetősége van.

A gaméták a meiózis során lejátszódó rekombináció (crossing-over, homológ kromoszómák véletlenszerű szétválása) miatt genetikailag különbözőek. A haploidia lehetővé teszi, hogy a gaméták szintjén jelentkező genetikai változatosságot, tehát a gametoklonális variabilitást – a másik gaméta hatása (megtermékenyítés) nélkül – az intakt növények szintjére hozzuk. A kifejlett egyed szintjére hozott gametoklonális variabilitás ma még egyedülálló az élővilágban.

Haploid és DH növényekben lehetőség van a különben rejtve maradó recesszív tulajdonságok fenotípusos manifesztálódására és az ezekre irányuló szelekcióra, továbbá jelentősen növelhető a sejtszintű mutánsizolálás hatékonysága is.

Kép

4/16. ábra: A GK Góbé, GK Délibáb búza fajták és dihaploid vonalaik összehasonlítása RAPD analízissel. A monomorf mintázat a fajták és DH vonalaik homogenitását bizonyítja. A RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) elemzés során véletlenszerűen megválasztott 10 bázisból álló random oligonukleotid primerrel PCR amplifikációt hajtottunk végre a növényi DNS mintával. Az ábrán összesen 72 egyedi DNS templáttal futtatott RAPD mintázat látható a következő sorrendben: M: 1000–100 bp molekulatömeg marker, 1–3: GK Góbé, 4–6: GK Góbé DH vonalak, 7–9: GK Délibáb, 10–12: GK Délibáb DH vonalak. A nyílheggyel jelölt DNS fragmentum a vizsgált 18 GK Góbé és a 18 GK Góbé dihaploid vonalban egyöntetűen jelen van, de hiányzik a GK Délibáb eredeti fajta egyedeiből és a GK Délibáb DH vonalakból. (Kiss E., Törjék O., Heszky L. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növénynemesités Tanszék, Gödöllő)

A haploidokból reduplikációval kapott dihaploidok (doubled haploid) röviden DH-növények elvileg homozigótáknak tekinthetők (4/16 és 4/17. ábrák). Ezzel az idegentermékenyülő növények beltenyésztésének ideje – amely fajtól függően 6–10 generáción keresztül folyó öntermékenyítést jelent – végül is 1 generációra redukálható. A beltenyésztett vonalak előállításának ideje tehát jelentősen 3–6 évvel (pl. kukorica) csökkenthető.

Kép

4/17. ábra: GK Góbé és GK Délibáb búza fajták és dihaploid vonalaik összehasonlítása egyedi AFLP mintázat alapján. A várakozásnak megfelelően a vizsgált markerekre mind a fajták, mind a dihaploid származékaik homogénnek bizonyultak. Az AFLP (Amplicon Fragment Length Polymorphism) analízis során az egyes növényekből izolált DNS-t egy ritkán és egy gyakran hasító restrikciós enzimpárral, EcoRI és MseI enzimekkel emésztettük, majd adaptereket kapcsoltunk a kapott DNS fragmentumokra. Ezt követően a hasítóhelyre és az adapterre specifikus primerekkel nem-szelektív amplifikációt hajtottunk végre. A PCR termékekkel EcoRI és MseI specifikus, szelektív bázist tartalmazó primerekkel szelektív amplifikációt végeztünk. A DNS fragmentumokat szekvenáló gélen (6% poliakrilamid) választottuk szét. Az autoradiográfiás detektálás az EcoRI-szelektív primer 33P izotópos (33P-ATP) jelölésével történt. 1–6: GK Góbé, 7–16: GK Góbé DH vonalai, 17–26: a GK Délibáb, 27–36: GK Délibáb DH vonalai. Nyilak jelölik azokat a DNS sávokat, amelyekben a GK Góbé és DH vonalai különböznek a GK Délibáb fajtától és DH származékaitól (Törjék O., Kiss E., Heszky L. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növénynemesités Tanszék, Gödöllő. A vizsgálat feltételeit Bánfalvi Zs. MBK, Gödöllő biztosította

Az öntermékenyülő fajok F1 és F2 növényei, vagy F6 –F7-ben még hasadó vonalai, törzsei egy generáció alatt rögzíthetők (4/18. ábra).

Az androgenezis lehetőséget ad a gametoklonális variabilitás nemesítési felhasználásához. A dohány szelektált gametoklónjai felülmúlták a kiinduló vonalat terméshozamban, koraiságban, rezisztenciában és a dohány minőségében.

Kép

4/18. ábra: Homozigóta vonalak előállítása androgenezissel búzában (Pauk J. és mtsai 1999 nyomán)

A különböző faj- és nemzetségkeresztezésekben a haploidia lehetővé teszi addíciós és szubsztitúciós hibridek előállítását (pl. Triticale).

Autotetraploid (4x) növényekből dihaploidok (2x), majd azokból monoploidok (x) állíthatók elő (4/19. ábra). A monoploidok fúziójával a legkülönbözőbb variációkban állítható újra össze az autotetraploid genom és növény. Előállíthatók komplett homozigóták és heterozigóták. Az egyes monoploid vonalakba gének beépítésével, majd a különböző monoploidok fúziójával 2–4 fontos tulajdonság egyesíthető a diploidokban (pl. árpa), illetve tetraploidokban (pl. burgonya).

Kép

4/19. ábra: Különböző biotechnológiai (parthenogenezis, androgenezis, protoplasztfúzió) módszerek kombinált felhasználásának lehetőségei a burgonya „analitikai-szintetikus” nemesítésében (Wenczel és mtsai 1979, TAG 55, 49–55 nyomán).

Transzgénikus növényekből a transzgénre nézve homozigóta növények állíthatók elő.

Ivari kromoszómákkal (XY) rendelkező fajokból szuperhím (YY) alakok állíthatók elő (pl. spárga).

Genetikailag tiszta vonalakat biztosítanak a molekuláris markerek keresésére, kapcsoltságuk kimutatására és térképezésére.

Az első fajták (rizs, búza), amelyeknek előállításában az in vitro haploidia (androgenezis) módszerét használták, a hetvenes évek végén Kínában születtek. Ezeket az eredményeket néhány évvel később követték az európai és kanadai fajta bejelentések. Franciaországban egy búzafajtát, Kanadában egy repcefajtát minősítettek 1986-ban, amelyeknek előállításában szintén a haploid androgenezis módszerét használták fel. Bulbosum technikával előállított DH árpafajtákat Új-Zélandon, Angliában és Kanadában minősítettek 1980 és 1984 között.

Hazánkban az első androgenetikus haploid szomaklón eredetű fajtát a DAMA nevű rizsfajta állami minősítése jelentette 1992-ben, melyet Heszky L. és Simonné Kiss I. állított elő. Pauk J., Kertész Z. és nemesítő csoportjuk állította elő az első DH eredetű búzafajtát (GK Délibáb), mely 1993-ban kapott állami elismerést (4/20. ábra). Ezt több szegedi és martonvásári DH búzafajta követte 1996-ban.

Kép

4/20 ábra: In vitro haploid módszer alkalmazása a búzanemesítésben. A: egysejtmagvas vakuólumos mikrospóra, B: embrioidok és kalluszok a portokok felületén az indukció 5. hetében. C: járulékos embriógenezissel regenerált növénykék üvegházi kiültetés és citologiai ellenőrzés előtt. D: haploid kromoszómaszámú sejt (n=3x=21). E: kolchicin kezelt és spontán rediploidizálódott növények üvegházi nevelése és felszaporítása. F: a haploid módszer felhasználásával előállított első magyar DH búzafajta, a ’GK Délibáb’ kalászállománya virágzáskor. G: a kiváló sütési minőségű ’GK Délibáb’ szemtermése és a lisztjéből sütött kenyér (Pauk J. és mtsai kísérlete, GK Kht, Szeged)

4.3. Generatív szervtenyészetek

4.3.1. Virágtenyésztés

A virágtenyésztés virágkezdemények vagy virágok izolálását, fejlődésük fenntartását, illetve befolyásolását jelenti táptalajon, steril, klimatizált feltételek között. Nem tekinthetjük virágtenyészetnek azokat a kultúrákat, amelyekben a virágokat, virágrészeket egyéb kísérleti célokból – pl. jól regenerálódó kallusz (pl. búza, rizs), vegetatív szaporítás (pl. hagyma) stb. – helyeznek táptalajra. E tenyészetekben a virágok csak kiinduló izolátumnak számítanak, fejlődésük a táptalajra helyezést követően más ontogenetikai utakra terelődik.

Az in vitro virágtenyésztés legfontosabb célja a virágdifferenciálódás és -fejlődés morfogenetikai, fiziológiai, biokémiai vizsgálata és módosítása szabályozható körülmények között. Természetesen amikor már egy faj virágkezdeményeinek további fejlődéséhez az in vitro módszer kidolgozott, e technika sikeresen használható fel különböző alkalmazási célból is (pl. ivardetermináció).

Módszere

A virágtenyésztés egészen fejletlen virágrügyek (virág primordiumok) kipreparálásával és táptalajra való izolálásával kezdődik, lehetőleg még az ivardetermináció előtti fejlődési szakaszban. A táptalajt (Nitsch 1951; White 1954) a szokásos makro- és mikroelemek mellett gyakran komplex anyagokkal (pl. kókuszdiótej stb.) kell kiegészíteni. A tenyésztés folyamán a virágzáskori, továbbá az azt megelőző hő- és fényviszonyokat célszerű biztosítani. A virágok kialakulása, majd az in vitro megporzás után zigotikus embriók és magvak fejlődése is biztosítható.

Eredményei, alkalmazása, jelentősége

A virágfejlődés indukciója, a ,,nagy távolságra” kiterjedő szignálátviteli rendszer jó példája a magasabbren-dű növényekben. A növényekben a vegetatív merisztéma fejlődésében a változást a környezeti tényezők váltják ki, melyet a növények különböző részei érzékelnek. Az endogén változások következménye végül is az lesz, hogy a növények egyes vegetatív hajtásmerisztémáinak további növekedése, fejlődése generatív típusú lesz, ami végül a virág/virágzat kifejlődését eredményezi.

A külső (exogén) hatások közül – legtöbb faj esetében – a nappal hosszúsága, a hőmérséklet és a háttérsugárzás a meghatározó. Ezek a fizikai hatások a növények különböző részein – a nappal hosszúsága a levélen, a hőmérséklet a hajtáscsúcson, az egyes stressztényezők (pl. víz, ásványi anyagok) a gyökéren – keresztül hatnak. A gyökérből és a levélből a jelátvitel csak úgy lehetséges, ha létezik egy nagyobb távolságra is kiterjedő biokémiai rendszer a növényekben. A hajtáscsúcsban a virágdifferenciálódás indukcióját kiváltó molekuláknak meg kell jelenniük a növényi tápanyagszállító rendszerben, tehát a gyökérnedvekben és a levélnedvekben is.

Az in vitro rendszerek kiválóan alkalmasak arra, hogy a virágindukciót követően a növénynedveket a táptalajba adagolva, azok tényleges morfogenetikai hatását kontrollált és reprodukálható körülmények között, kísérletesen vizsgálni lehessen. A Pharbitis-ből virágindukció előtt izoláltak (nem ,,virág indukált”) hajtáscsúcsokat táptalajra. Ezekben a vegetatív hajtáscsúcsokban a ,,virág indukált” növények phloéma nedvével a virágdifferenciálódás kiváltható volt. Ezeket az eredményeket sikerrel ismételték meg dohány és Sinapis fajokon. Feltételezték, hogy a levél exszudátum megnövekedett szénhidrát (szacharóz), illetve citokinin (izopentenil-adenin) tartalma felelős a virágindukcióért. A gyökérnedvben a transz-zeatin ribozid volt a meghatározó komponens. Természetesen ezek hatása is tesztelhető in vitro virágkultúrában.

Nyilvánvaló, hogy a végső megoldást a virágfejlődésben résztvevő gének azonosítása, jellemzése és izolálása fogja jelenteni. Arabidopsis-nál és Antirrhinum-nál transzpozon mutagenezissel több olyan gént (DEF-gén, AG-gén) azonosítottak, melyekkel a virágok száma és formája módosítható volt.

Az in vitro tenyésztett Chenopodium rubrum csíranövényeket akkor hoztak teljesen kifejlett virágokat, amikor 6 napig rövidnappalos és 9 napig hosszúnappalos megvilágítást kaptak. A táptalajhoz adagolt indolecetsav és benziladenin 40%-kal csökkentette az in vitro fejlődött virágok számát.

A virágos növények 4%-a ivari dimorfizmussal rendelkezik és egyes egyedei egyivarú virágokat tartalmaznak. A virágkultúrák alkalmasak a kétlaki (dioecious) növények egyivarú virágainak kialakulását, és fejlődését meghatározó bioaktív anyagok hatásának tényleges vizsgálatára (pl. datolyapálma, Silene alba).

A Silene alba ivarát heteromorf ivari kromoszómák határozzák meg. A hím növények a 22 autoszóma mellett 2 ivari (X és Y) kromoszómával is rendelkeznek (2n = 24 XY). A nőivarú egyedek 22 autoszómát és 2 db X kromoszómát tartalmaznak (2n = 24 XX). A kísérletek bebizonyították, hogy a virágok ivardeterminációjára az abiotikus környezet semmiféle hatással nincs.

Más a helyzet azoknál a fajoknál, ahol a virágok ivari jellegzetességei nem genetikailag, hanem élettanilag determináltak (pl. dinnyefélék, tökfélék, stb.).

E területen a GALUN, HESLOP-HARRISON és EVANS által vezetett kutatócsoportok munkássága érdemel figyelmet.

 Az uborkára (Cucumis sativus) például háromféle szexexpresszió a jellemző:

– monoikus (egylaki) növény, ha a növényen megtalálhatók mind a hím, mind a nővirágok, és a virágok egyivarúak;

– ginoikus növény, amelyen csak a nővirágok fejlődnek;

– hermafrodita növény, amelyen csak hímnős virágok fejlődnek.

E három vonal virágainak in vitro tenyésztése során a következőket állapították meg:

– hímvirág kezdeményekben auxin, pl. indolecetsav (IES) hatására magház (ovárium) fejlődik, tehát nővirággá alakítható. Ez azonban gibberellinsavval (GA3) megszüntethető;

– a nő- és hermafrodita virág kezdemények ivari determinációját sem az IES, sem a GA3 nem befolyásolta.

E munkák kiindulópontjai voltak a szexdetermináció hormonális szabályozottsága, fiziológiás háttere tisztázásának, ami elvezetett annak üzemi alkalmazásához. Napjainkban már néhány zöldségnövénynél speciális szerek állományra permetezésével a hím- és nővirágok aránya mesterségesen befolyásolható.

4.3.2. Ováriumtenyésztés

Az ováriumtenyésztés a termékenyítetlen vagy in situ már megtermékenyült virágokból a fejlődő magházak kipreparálását, táptalajra helyezését és fejlődésének fenntartását, valamint befolyásolását jelenti steril, klimatizált körülmények között. Általános célja a gyümölcs- és termésfejlődés fiziológiai, morfogenetikai és biokémiai folyamatainak vizsgálata reprodukálható és szabályozható környezetben (4/21. ábra), melynek ismeretében számos gyakorlati felhasználási cél fogalmazható meg.

Az ovárium és szerepe in vivo

Az ovárium vagy magház a zárvatermők virágtengelyének végén helyezkedik el és az embriózsákot tartalmazó magkezdemények védelmére szolgál. Lehet egy- vagy többüregű, belsejében egy vagy több (több száz is) magkezdemény található. Az egyszikű fajok ováriumai általában egy magkezdeményt tartalmaznak. Falában szállítónyalábok haladnak (magléc vagy placenta), amelyek behatolnak a magkezdeménybe és annak táplálását biztosítják. Egyik felét a vacok zárja le, a másik fele általában a bibeszálban folytatódik.

Története

Az első ováriumtenyészeteket, LA RUE létesítette a negyvenes évek elején. Kísérleteiben néhány faj izolált ováriumai kismértékben növekedtek. Erre alapozva Nitsch az ötvenes években továbbfejlesztette a technikát, és kiterjesztette a gyümölcsfejlődés élettanának tanulmányozására. A dohány, a paradicsom, a bab, az uborka és a szamóca fajok ováriumkultúrájában elért eredményeire alapozva arra a következtetésre jutott, hogy a megporzás és a megtermékenyülés stimulusát bizonyos növekedésserkentő anyagok [pl. 2-naftoxi-ecetsav (NOA), 2,4-diklórfenoxi-ecetsav (2,4–D), 2,4,5–triklórfenoxi-ecetsav (2,4,5–T)] képesek pótolni in vitro, és ez mag nélküli, ún. partenokarp termések kialakulásához vezet.

Módszere

Az ováriumok izolálása általában a megporzást követő 2–15. napon (fajtól függően) történik. Izolálhatunk ováriumokat azonban a megporzás előtt is. Ez utóbbi esetben 1–2 nappal a portokok felpattanása előtt célszerű a még meg nem termékenyült ováriumokat táptalajra helyezni. A táptalaj általában NITSCH (1951) vagy WhItE (1954) és módosított változataik, amelyeket hormonokkal, továbbá komplex növekedésserkentőkkel (élesztőkivonat, kazeinhidrolizátum, kókuszdiótej stb.) egészítenek ki. A tenyészeteket 25 °C körül és 50–60% páratartalomban, néhány hétig sötétben, majd folyamatosan vagy 16 órás megvilágítás mellett inkubálják.

Eredményei, alkalmazása, jelentősége

Abban az esetben, ha az ovárium fejlődését sikerül in vitro biztosítani, az ovárium megnyúlik, és növekedési üteme általában szigmoid típusú görbével jellemezhető. További tenyésztés során az érés is bekövetkezhet, ami a termések elszíneződését (pl. paradicsom) vagy íz- és zamatanyagok kialakulását (pl. szőlő) eredményezheti. Az ováriumok (gyümölcsök, termések) mérete azonban rendszerint jelentősen elmarad a természetestől, amit a tenyészedények korlátozott méretének is tulajdonítanak. Ezért egy olyan részlegesen steril módszert dolgoztak ki, amelyben a fejlődő gyümölcs a tenyészedényen kívülre került és csak a kocsány érintkezett a táptalajjal. Ezt követően indiai kutatók megfelelő kiegészítések (kazeinhidrolizátum, élesztőkivonat) felhasználásával a természetes méretet is meghaladó terméseket nyertek az Iberis amara, a Ranunculus sceleratus és az Althaea rosea tenyészeteiben.

Az auxin az egyik legfontosabb gyümölcsfejlődést stimuláló anyag in vivo és in vitro. Az auxinszintézist a megporzás során a bibére jutó pollen stimulálja. A megtermékenyítést követően a fejlődő magvak biztosítják a viszonylag magas endogén auxinszintet, amely a gyümölcs fejlődéséhez szükséges. Ezt legjobban az aszimmetrikus termések bizonyítják, amelyeknek egyik felében az ovulumok abortálása miatt magvak nem fejlődnek. Ez a termés egyik felében kis auxinkoncentrációt okoz, ami jelentősen lassítja azon az oldalon a gyümölcs fejlődését. Az auxinok túladagolása in vitro azonban gátolhatja a magvak fejlődését, ezért tenyészedényekben nagy gyakorisággal csak partenokarp termések alakulnak ki.

Az in vitro fejlődő ováriumokban a ,,magkötés” mértéke általában jelentősen elmarad az in vivo értékektől. Ennek legfontosabb oka az embrió, a magkezdemény, illetve az endospermium korai degenerálódása. Ennek ellenére számos fajnál (Lycopersicon esculentum, Iberis amara, Ranunculus sceleratus, Dendrobium nobile) teljesen érett magvakat kaptak, amelyek in vitro csíráztatva növénnyé fejlődtek.

a) Fajkeresztezések

Az ováriumkultúrát RÉDEI sikerrel alkalmazta Triticum fajkeresztezései során. A T. aestivum x T. spelta hibrid embriók az embriógenezis korai fázisában abortáltak akkor, amikor a proembriók még nem voltak kipreparálhatók az embriózsákból. Ezért 4–6 nappal a megporzás után az ováriumokat táptalajra izolálta. Abban az esetben, amikor az ováriumot borító pelyvaleveleket nem távolította el, a hibrid embriók tovább növekedtek és 8–12 napos tenyészetekben már olyan fejlettséget értek el, hogy azokat ki lehetett preparálni, majd embriókultúrában tovább lehetett nevelni.

Egyes virágrészek, pl. csészelevelek, magfejlődést serkentő hatásáról számoltak be az Althea rosea, Iberis amara és az árpafajok ováriumtenyészeteiben is, megerősítve RÉDEI eredményeit. Ezt később ún. ,,héjfaktornak” nevezték el, amely nélkülözhetetlen az embrió normális fejlődéséhez ováriumkultúrában. NITSCH a hatvanas évek közepén feltételezte, hogy a virágrészek (pl. a csészelevelek), mint szerves nitrogénvegyületek forrásai, nélkülözhetetlenek a tenyészetekben.

b) Az in vitro megporzás (4/21. ábra)

Az ováriumkultúra in vitro megporzásra és termékenyítésre is alkalmas. A hatvanas évek közepén sikerrel izoláltak dohány ováriumokat bibével együtt. Egy nappal az izolálást követően aszeptikus pollent helyezve a bibe felületére, 2%-os termékenyülést értek el. A tenyésztett ováriumban fejlődött magvak egy része kicsírázott és növénnyé fejlődött.

Kép

4/21. ábra: Az ovárium- és az ovulumkultúrák, valamint az in vitro termékenyítés felhasználásának vázlata, haploidok és fajhibridek előállítása céljából. A ginogenezis indukciója céljából a megporzatlan ováriumokat, illetve ovulumokat táptalajra helyezzük (1–6–7); haploid embriók, növények (8-9) csak apomixissel (pl. ginogenezis) keletkezhetnek; az in vitro megtermékenyítés esetén a táptalajra helyezett (1–2–3) ováriumokat, illetve ovulumokat sterilen gyűjtött pollennel kémcsőben porozzuk és termékenyítjük meg (2–3); a magvak csírázását követően hibrid növényeket kapunk (4–5)

c) Poliembriónia

Néhány fajnál, különösen az Umbelliferae családba tartozóknál, poliembrioniát figyeltek meg az ováriumkultúrában (pl. Anethum graveolens, Foeniculum vulgare, Trachyspermum, Ammi majus, Coriandrum sativum stb.). E fajok ováriumában fejlődő embriók egyes sejtjeiből újabb embriók differenciálódtak in vitro. Ezért az embriózsákban a járulékos embrioidok tömege alakult ki, amelyek továbbfejlődve felszakították a perikarpiumot és általában növénnyé fejlődtek.

d) Ginogenezis (haploid apomixis, 4/21. ábra)

A növények női gametofitonját – hasonlóan a portokokhoz – potencionális haploid forrásnak kell tekintenünk. A ginogenezis azt a folyamatot jelenti, mely során a termékenyítetlen ovárium, pontosabban embriózsák (ovulum) valamelyik haploid sejtjéből embrió, illetve növény fejlődik.

A fontosabb kultúrnövények közül napjainkig az árpa, a búza, a rizs, két dohányfaj (N. tabacum és N. rustica), a kukorica, az olaszperje, a csomós ebír ovárium tenyészeteiben sikerült ginogenezist indukálni és fenntartani. Hazánkban JUHÁSZ G. és mtsai nemzetközileg is elsők között állítottak elő hagyma és cukkini növényeket ginogenezissel.

Néhány fajnál (pl. hagymafélék) várhatóan a ginogenezis lesz az a haploid indukciós módszer, amit az androgenezis jelent napjainkban pl. a búzánál, a rizsnél, a dohánynál stb.

A hagymánál (Allium cepa L.) nem lehetett in vitro androgenezissel haploidokat előállítani. Keller közel 100 ezer portokot izolált és egy haploidot sem kapott. Az izolált 50 ezer ováriumból ginogenezissel (50 fajta) összesen 457 növényt (5 fajta) tudott felnevelni, melyek közül 62% haploid, 32% diploid és 6% mixoploid volt.

A ginogenezis az ovulumok in vitro tenyészeteiben is kiváltható, amelyről a következő, ,,Ovulumkultúra” c. pontban számolunk be. A ginogenezis hatékonyságát a többi haploid indukciós módszerrel együtt a ,,Portok- és pollenkultúra” c. (4.2.5) pontban hasonlítottuk össze.

Összefoglalva, az ováriumkultúra lehetővé teszi:

a termés (gyümölcs, mag) fejlődésnek kísérletes vizsgálatát kontrollált feltételek között;

ginogenetikus haploidok előállítását;

a partenokarpia élettanának vizsgálatát ;

hibridek előállítását inkompatibilis keresztezésekből;

poliembriónia indukcióját.

4.3.3. Ovulumtenyésztés

 Az ovulum (magkezdemény) tulajdonképpen az embriózsákot tartalmazó magkezdeményt jelenti, amely az ováriumban a placentán helyezkedik el. Az ovulumkultúra a fiatal termékenyítetlen vagy termékenyült magkezdemények izolálását, fejlődésének fenntartását és befolyásolását jelenti táptalajon, steril, klimatizált feltételek között.

Az ovulumkultúra általános célja a proembriók fejlődéséhez szükséges feltételek biztosítása in vitro, ami további számos gyakorlati cél elérését teszi lehetővé.

Az ovulumkultúra módszerének kidolgozására a kényszer vezette a kutatókat. A zárvatermők szívstádiumnál fiatalabb proembrióinak kipreparálása és életben tartása az ismert embriótenyésztési eljárásokkal kivitelezhetetlen volt. Célszerűnek látszott a proembriót tartalmazó ovulum kipreparálása és tenyésztése. Feltételezhető volt továbbá, hogy hibrid embriók esetén, ha az ovulumot táptalajra helyezik, az inkompatibilitást okozó embrióabortálás időpontja kitolható addig az időpontig, melytől az embriók már embriókultúrában is folytatni tudják fejlődésüket (lásd az in vitro in ovulo embriótenyésztést a 4.1.5 pontban).

Az ovulum és szerepe in vivo

A zárvatermők ováriumában egyesével vagy többesével fejlődő, tojásdad alakú szerv az ovulum (magkezdemény), amely a megtermékenyülést követően maggá alakul (4/22. ábra).

Kép

4/22. ábra: A zárvatermők magkezdeményének vázlatos ábrázolása 8 magvas Polygonum típusú embriózsákkal. A: mikropyle (csírakapu), B: külső magkezdeményburok (integumentum), C: belső integumentum, D: embriózsák, E: nucellusz, F: köldökzsinór (funiculus); 1 – petesejt, 2–3 – segítő (szinergida) sejtek, 4 – központi sejt két poláris maggal, 5 – ellenlábas (antipodális) sejtek, 1–2–3 – petekészülék

A gabonafélék virágjában a magház általában egy ovulumot tartalmaz, így abban egy mag fejlődik. Kétszikű fajoknál számuk rendkívül változó lehet. A tápanyagokat az ovárium placentaszövete biztosítja, melyhez köldökzsinórral (funiculus) kapcsolódik. Kívülről egy- vagy kétrétegű burok (tunica) borítja, amelynek nyílása a csírakapu (mikropyle), ahol a pollentömlő bejuthat a magkezdeménybe. A magkezdemény belsejében található az embriózsák (csírazsák, női gametofiton), mely a haploid női ivarsejtet (petesejt) és további haploid sejteket tartalmaz. Kialakulása különböző típusú lehet. A zárvatermők 80%-ára a Polygonum-típusú monospórás szerveződés a jellemző, mely 7 haploid sejtes (8 sejtmagos).

Története

White 1932-ben elsőként végzett kísérleteket Antirrhinum magkezdeményekkel. A következő évtizedekben a kísérletek főleg arra irányultak, hogy megismerjék azokat a tényezőket, amelyek a zigóta első osztódásaitól kezdve szabályozzák az embrió fejlődését, különösen az embriógenezis korai fázisában.

Az első sikeres ovulumkultúráról 1958-ban MAHESHWARI számolt be. A Papaver somniferum 4 sejtes proembrióit tartalmazó ovulumokat izolálva 23 nap alatt érett magvakat kapott, amelyek csíraképesek voltak. Ezt követően az ovulumtenyésztés alkalmassá vált az in vitro termékenyítés kivitelezésére is. További története az in vitro termékenyítés részévé vált, ezért azt a ,,Megporzás és megtermékenyítés kémcsőben” (4.3.4) c. alatt mutatjuk be.

Módszere

Az azonos fejlődési fázisban lévő ovulumok biztosítása céljából a fejlődő virágokat célszerű izolátor alatt mesterségesen megporozni. A megporzást követő 1–12. napon, az ovárium felvágását követően a fejlődő magkezdemények kipreparálhatók és táptalajra helyezhetők. Abban az esetben, ha termékenyítetlen ovulumokat kívánunk tenyészteni, az ováriumokat 1–2 nappal a portokok felpattanása előtt célszerű a virágokból eltávolítani és belőlük a fejlődő magkezdeményeket kipreparálni. Az ovulumok kipreparálhatók placentaszövettel együtt vagy anélkül. A placentával együtt történő tenyésztéssel általában kedvezőbb eredményeket értek el.

Általában makro- és mikroelemeket, auxinokat, citokinineket és más komplex növekedésserkentő anyagokat (kókuszdiótej, kazeinhidrolizátum, élesztőkivonat, különböző gyümölcskivonatok) tartalmazó táptalajokat (NITSCH, 1951 és WHITE, 1954) használnak. A táptalaj kiegészítésein kívül annak ozmotikus értéke különös jelentőségű a tenyésztés sikere szempontjából. Ez a szacharóz, a mannit, a glicerin, a KCl stb. mennyiségének növelésével érhető el a legegyszerűbben. A megtermékenyülést követően az ovulum üregét kitöltő nedv ozmózisértéke nagy, amely az embrió fejlődésével párhuzamosan fokozatosan csökken. Ennek minél pontosabb szimulálása a tenyésztés során a siker fontos feltétele. A tenyésztés további körülményei megegyeznek az ováriumkultúráknál leírtakkal.

Eredményei, alkalmazása, jelentősége

Az orchideáknál (Epidendrum-, Cattleya-fajok) a megtermékenyülés és a magérés között eltelt időt ovulumkultúra felhasználásával sikerült jelentősen lerövidíteni már a negyvenes években.

MAHESHWARI sikeres kísérletét követően, amelyben a Papaver somniferum 4 sejtes proembriót tartalmazó ovulumai érett maggá fejlődtek, a hatvanas években széleskörű kutatások indultak. Ezek bebizonyították, hogy az alkalmazott tenyésztési feltételekkel – fajtól függően – különböző korú ovulumok tarthatók életben. A dohány esetében 9 napos ovulumok tenyésztése sikertelen volt, de a 12 naposak már normálisan fejlődtek. Ennek oka valószínűleg a táptalaj kis cukorkoncentrációja (ozmózisértéke) volt. A Petunia hybrida esetében ugyanis a hetvenes években bebizonyították, hogy a 4 napos ovulumok 6%, a 3 napos ovulumok pedig csak 8% cukortartalom esetében folytatták fejlődésüket.

a) Inkompatibilis keresztezések

A hetvenes években sikerrel alkalmazták az ovulum kultúrát inkompatibilis keresztezésekhez (pl. Lolium és Festuca fajok) olyan esetekben, amelyekben az embrió a termékenyülést követően korai (gömb, korai szív) fázisban abortált.

Napjainkban a Nicotiana repanda (2n = 2x) rezisztenciagénjeinek (pl. nematóda) N. tabacum-ba (2n = 4x) való átviteléhez használták a módszert. Először a N. repanda tetraploid (2n = 4x) alakját állították elő, majd azt keresztezték a N. tabacummal. A megporzást követően kipreparált fejletlen magkezdeményeket MURASHIGE és SKOOG (MS) táptalajon tenyésztették. A táptalaj ozmolaritását a szénhidrátok koncentrációjának változtatásával csökkentették. E technikával a hibrid embriókat tartalmazó ovulumok fejlődését sikerült fenntartani és hibrid növényeket előállítani.

b) Ginogenetikus haploidok (4/21. ábra)

A nyolcvanas években ginogenetikus eredetű haploidokat sikerült felnevelni termékenyítetlen ovulumkultúrákból, ami – hasonlóan az ovárium tenyészetekhez – új távlatokat nyit meg a gyakorlati (nemesítési) felhasználás előtt A fontosabb kultúrnövények, amelyeknek ginogenetikus haploidjait nem ovárium-, hanem ovulumkultúrából sikerült előállítani, a cukorrépa, a gerbera, a kukorica és a napraforgó. A répaféléknél (cukorrépa, céklarépa stb.) a haploidokat termékenyítetlen ovulumok tenyésztésével állították elő. Az ovulumokat a virágok portokjainak felpattanása előtt 2–4 nappal izolálták MS táptalajra, melyet 0,25 mg/l benziladeninnel és 0,93 mg/l naftilecetsavval egészítettek ki. A szaharóz tartalom 30–60 g/l között volt. A haploid gyakoriság a válaszadó genotípusok estében 1–10% között változott. Hazánkban POTYONDI L. és mtsai (1992) állítottak elő ginogenezissel haploid cukorrépát.

c) In vitro termékenyítés

Az ovulumtenyésztés az in vitro termékenyítés alaptechnikájává vált és hozzájárult ahhoz, hogy faj- és nemzetséghibrideket lehessen előállítani in vivo nem termékenyülő kombinációkban. További részleteket lásd a ,,Megporzás és megtermékenyítés kémcsőben” (4.3.4) c. alatt.

d) Gazda-parazita kapcsolat

Az ovulumkultúrák felhasználásának speciális területe az obligát gyökérparazita növényeknél az embrió morfogenezis gazdanövény függősége. Ezeknek a fajoknak (pl. Orobanche aegyptiaca, Cistanche tubulosa) az embriógenezise ugyanis a fejlődés korai fázisában leáll akkor, amikor a sziklevél, a gyökércsúcs, a hajtáscsúcs és a hipokotil még alig szerveződött. Az embrió további fejlődését a gazdanövény gyökérnedvei stimulálják és ennek vizsgálatához kiváló feltételeket teremt az in vitro ovulumkultúra.

Összefoglalva, az ovulumtenyésztés lehetővé teszi:

 ginogenetikus haploidok előállítását;

 a zigóta és a proembriók morfogenezisének kísérletes vizsgálatát kontrollált körülmények között ;

- az in vivo korai fejlődési fázisban abortáló hibrid embriók megmentését és hibridek előállítását a természetben inkompatibilisnek számító keresztezésekből;

- az in vitro megporzás és termékenyítés technikai kivitelezését;

- embrió- és endospermium-mutánsok felnevelését.

4.3.4. Megporzás és megtermékenyítés kémcsőben

Az előzőekből nyilvánvaló, hogy szövettenyésztési módszerekkel lehetőség van az ivarsejtet is tartalmazó ovulumok, illetve ováriumok tenyésztésére mesterséges feltételek között. Kézenfekvő volt tehát, hogy a megporzást és a megtermékenyítést is ,,kémcsőben” végezzék el. A kémcsőben végzett megporzás és megtermékenyítés annyiban különbözik az in vitro megtermékenyítéstől, hogy az előbbiben a hím ivarsejteket, illetve a női ivarsejtet tartalmazó szervet (ovulumot, ováriumot) tenyésztjük, míg az utóbbi esetben izolált gamétákkal, tehát magukkal a hím ivarsejttel és petesejttel dolgozunk. Az in vitro termékenyítést a ,,gaméták izolálása és fúziója” (4.5.2) pontban részletezzük.

A kémcsőben történő termékenyítés tehát az in vitro tenyésztett ovulumok és ováriumok pollennel való megporzását és megtermékenyítését jelenti ,,táptalajon”, steril, klimatizált feltételek között (4/21. ábra).

A megporzás és a megtermékenyülés folyamata in vivo

In vivo a megporzás a hímivarsejtet tartalmazó pollenszemek bibére kerülését jelenti. A megtermékenyítés folyamatának első szakaszában a bibére került pollen megtapad, majd tömlőt hajt és növekedik a bibeszálban, az ovárium szövetében, egészen az embriózsákot tartalmazó ovulum ún. csírakapujáig (mikropyle). A kettős megtermékenyítésben résztvevő két hím (generatív) ivarsejt a növekvő tömlőben jut el az embriózsákig, illetve az embriózsákba, a petesejttel szomszédos egyik segítő sejtbe (szinergida), ahol felreped és a hím ivarsejtek szabaddá válnak.

A második szakaszban kerül sor magára a megtermékenyítésre, amikor is az egyik hím ivarsejt (sejtmag) egyesül a petesejttel, létrehozva a zigótát. A másik hím ivarsejt az embriózsák két sejtmagvú központi (poláris) sejtjével fúzionál, létrehozva az embriót tápláló szövet, a triploid endospermium iniciális sejtjét.

Története

A növényi mesterséges megtermékenyítés az ováriumon belüli megporzással és megtermékenyítéssel kezdődött.

Ováriumon belüli megporzás (intraovarian fertilization). STRASBURGER 1886-ban – több mint 100 évvel ezelőtt – volt az első, aki az intraováriumi megporzás lehetőségét felvetette és kipróbálta orchideáknál.

A 20. század első felében a Codonopsis, Helleborus, Paeonia, Digitalis fajokon végzett vizsgálatok során kifinomult az alkalmazható technika és sikerült is néhány életképes magot kapni, pl. Paeoniánál. Az igazi áttörést azonban MAHESHWARI professzornak és munkatársainak a Papaver rhoeas, a P. somniferum, az Eschscholtzia californica, az Argemone mexicana és az A. ochroleuca fajokon elért eredményei jelentették.

A bórsav 0,01%-os oldatával készített pollenszuszpenziót sterilen injektálták a megfelelően előkezelt ováriumba. A megtermékenyítés és a magvak fejlődése normális volt.

A sikeren felbuzdulva a módszert fajkeresztezésre is felhasználták. Az Argemone ochroleuca (2n = 56) és az A. mexicana (2n = 28) keresztezése in vivo csak ritkán, a reciprok keresztezés pedig egyáltalán nem lehetséges. Az ováriumon belüli megporzást alkalmazva MAHESHWARI mind a két kombinációból magvakat kapott.

Az ováriumon belüli megporzás tehát alkalmas olyan hibridek előállítására, amelyekére in vivo – a bibe, illetve a bibeszál anatómiai és élettani eltérésére visszavezethető inkompatibilitás miatt – nincs lehetőség. A pollenszuszpenzió közvetlenül magházba juttatásával az inkompatibilitásnak ez a formája kiküszöbölhető.

A század hatvanas éveire tehát megoldódott az ovulumok és az ováriumok in vitro tenyésztése, valamint az ováriumon belüli megporzás bizonyította, hogy megfelelő termékenyítés érhető el a pollen közvetlenül a magkezdemény felületére juttatásával is. Tehát szinte minden készen állt a kémcsőben való megporzásra és megtermékenyítésre. Magától értetődő – 20 év távlatából – hogy a kutatócsoport nem lehetett más, mint MAHESHWARI és tanítványai a Delhi Egyetem Botanikai Intézetében. Valóban, a hatvanas évek elején sikeres megtermékenyítést és magfejlődést értek el a Papaver somniferum, az Argemone mexicana és a Nicotiana tabacum fajoknál.

Az azóta eltelt 25 év alatt 14 család 57 faja esetében sikerült in vitro megporzott ovulumokban embrió és magfejlődést elérni. Fontosabb családok és fajok a következők:

SolanaceaeBrassicaceae

Nicotiana tabacumBrassica napus

Nicotiana alataBrassica oleracea

Petunia hybridaBrassica campestris

Petunia violaceaSinapis arvensis

Petunia axillarisSinapis alber

PapaveraceaeGramineae

Papaver somniferumZea mays

Eschscholtzia californicaHordeum vulgare

Caryophyllaceae

Silene alba

Silene rubra

Agrostemma githago

Dianthus caryophyllus

Valószínűleg nem véletlen a siker ezeknél a kétszikű fajoknál, ugyanis közös jellemzőjük, hogy a placentán nagyszámú (több száz is lehet) ovulum található, melyekből kis termékenyülési százalék esetén is több magot kaphatunk. Ezeknek a kétszikű családoknak a pollenje viszonylag könnyen hajt tömlőt magán az ovulumon. A többi család fajaira (pl. Brassica fajok) viszont ez nem jellemző, ezeknél a placentán való pollencsíráztatás szükséges.

Módszere

A sikeres mesterséges termékenyítés legfontosabb metodikai feltételei a következők:

 nagyszámú életképes in vitro tenyésztett ovulum;

 pollen, amely az ovulum felületén vagy a placentán tömlőhajtásra képes;

- megfelelő tenyésztési feltételek, melyek a megtermékenyítést követően biztosítják az embriók, illetve a magkezdemények normális fejlődését.

A megtermékenyítetlen ováriumok és ovulumok izolálása, fontosabb táptalajai és tenyésztése megegyezik az Ovárium- (4.3.2), illetve az Ovulumtenyésztés (4.3.3) c. pontokban írtakkal, azzal a kiegészítéssel, hogy az ováriumokat a bibével, vagy anélkül, az ovulumokat mindig a placentával együtt preparáljuk ki. Néhány faj esetén (pl. Silene alba, Dianthus caryophyllus) a placentát a virágkocsánnyal, sőt a visszavágott csészelevelekkel együtt célszerű a táptalajra helyezni.

A sterilen izolált pollent a tenyésztett és szűrőpapírral szárazon tartott ovulumok felületére kell szórni. A megporzás technikájának különböző változatai ismertek:

 a pollent a bibe felületére szórjuk (pl. Trifolium fajok);

 a pollent az ovulum felületére szórjuk úgy, hogy az ováriumot felnyitjuk és a pollent a placentára szórjuk (pl. Brassicaceae és Fabaceae fajok);

az ováriumot teljesen eltávolítjuk és a pollent az ovulumok felületére szórjuk (pl. Caryophyllaceae és Solanaceae fajok);

 izolált ovulumokra szórjuk a pollent;

 a pollent előcsíráztatjuk in vitro vagy in vivo (egy másik faj bibéjén), majd a megporzás a már tömlőt hajtó pollennel történik.

A megtermékenyítés 24–28 óra múlva következik be. A mesterséges termékenyítés mértéke átlagosan 5–50% között van, melyet számos in vivo és in vitro feltétel befolyásol. A megtermékenyült ovulumok szobahőmérsékleten (22–26 °C), természetes megvilágításban tartva folytatják fejlődésüket. Az embriógenezis és a magfejlődés általában 3–5 hét alatt befejeződik. Az érett magvak a tenyészetekben gyakran kicsíráznak és növénnyé fejlődnek.

Önmegporzás (beltenyésztés) esetén a fejlődő ovulumok a tenyésztés teljes időtartalma alatt a placentán tarthatók. Fajkeresztezések esetén azonban a hibrid embrió abortálását úgy előzhetjük meg, hogy 6–8 nappal a megporzást követően (korai torpedóstádiumot elért embrióállapotban) az ovulumokat új, szilárd vagy folyékony táptalajra oltjuk át.

Eredményei, alkalmazása, jelentősége

a) Hibridek előállítása

A kémcsőben történő megporzás és megtermékenyítés elvben olyan hibridek előállítását teszi lehetővé, amelyek különböző anatómiai, élettani (elsősorban sporofitikus) inkompatibilitás miatt in vivo nem jöhetnek létre. Ilyen inkompatibilitási okok lehetnek: a pollen tömlőhajtása gátolt a bibe felületén, a bibeszál hoszszabb, mint a pollentömlő, mely utóbbi ezért nem tudja az embriózsákot elérni, továbbá a pollentömlő növekedése gátolt a bibeszálban vagy az ováriumban.

Az első olyan interspecifikus és intergenerikus hibrideket, amelyek a természetben nem fordulnak elő, a hetvenes évek közepén Zenkteler és mtsai állították elő.

A Silene alba x Silene rubra és a Silene alba x Silene schafta faj hibridjei voltak azok, melyek virágzó növénnyé fejlődtek. Azóta hibrid magvakat kaptak a Brassica pekinensis x Sinapis alba, Brassica napus x Sinapis alba in vitro keresztezésekben is.

b) Öninkompatibilitás feloldása

Néhány faj szexuális öninkompatibilitását is hasonló tényezők okozzák. Ezekben az esetekben (pl. Petunia axillaris, P. hybrida) a kémcsőben történő önmegporzást követően nagyszámú öntermékenyült magot kaptak. A módszer tehát lehetővé teszi az öninkompatibilis növények beltenyésztését is.

c) Haploidia előidézése

Ez jelenleg még feltételes alkalmazási lehetőség, olyan kombinációkból, amelyekben a megtermékenyülés csak in vitro következhet be – in vivo nem –, és az egyik faj genomja eliminálódik, hasonlóan a bulbosum technikához (lásd 4.1.5. pontban).

Ilyen esetről számoltak be a hetvenes évek közepén, amikor a Mimulus luteus és Torenia fournieri keresztezéséből haploid Mimulus növényeket kaptak in vitro.

Összefoglalva, az in vitro termékenyítés lehetővé teszi:

 új fajhibridek és nemzetséghibridek előállítását;

 öninkompatibilis fajok beltenyésztését;

haploidok előállítását.

4.4. Generatív szövettenyészetek

4.4.1. Endospermium-tenyésztés

Néhány család (Orchidaceae, Podostemonaceae, Trapaceae) kivételével minden zárvatermő faj magja tartalmaz endospermiumot. Biotechnológiai szempontból az endospermium azért érdekes, mert ploidszintje a virágos növények több mint 80%-ában triploid, emellett anatómiailag homogén szövetet jelent, mert csak parenchimasejtekből áll.

Az endospermiumkultúra a fejlődő endospermium izolálását, táptalajon való tenyésztését és fejlődésének fenntartását, valamint módosítását jelenti steril, klimatizált feltételek között. A szövet sikeres tenyésztése alapja lehet számos más gyakorlati cél elérésének is.

Az endospermium és szerepe in vivo

Az endospermium (belső táplálószövet, belső magfehérje szövet) az embriózsák két központi (poláris) sejtmagjának és az egyik hímivarsejt fúzióját követően (kettős megtermékenyítés), a magkezdeményben kialakuló triploid raktározószövet. Feladata az embrió táplálása az embriógenezis és a csírázás folyamán (4/22. ábra).

Története

A kettős megtermékenyítés folyamán a hármas sejtfúzióból származó endospermiumot a kutatók a századforduló körül még ,,másodlagos embriónak” tartották, amely a ,,zigotikus embrió” táplálására módosult. Később tisztázódott, hogy a megváltozott feladat kialakulásáért nem a harmadik sejtmag a felelős, hiszen pl. az Onagraceae család fajaiban az endospermium diploid.

Ezek után logikusnak tűnt az a következtetés, hogy in vitro esetleg lehetséges lesz embriók fejlődését indukálni az endospermiumból. Az első endospermium tenyészetet az 1930-as években létesítették kukoricából.

LA RUE a Michigani Egyetemen (USA) volt az első, aki 1949-ben folyamatosan növekvő endospermium tenyészetet létesített csemegekukoricából. Növényeket azonban csak a hatvanas évek közepétől sikerült regenerálni, megteremtve ezzel az esetleges gyakorlati célú felhasználás feltételeit. 1998-ban KRANZ és munkatársainak a poláris sejtek és a hímivarsejt in vitro fúziójával már sikerült ,,mesterséges” endospermiumot is létrehoznia.

Módszere

A tenyészetek létesítéséhez használt inokulum több tényezőtől függ:

 azoknál a magvaknál, amelyek érett állapotban nem tartalmaznak endospermiumot (pl. alma, citrom), az éretlen magvak a megfelelő explantátumok, amelyekben még sejtes endospermium található;

 a gabonafélék érett magvaiban az endospermium fiziológiailag ,,élettelennek” tekinthető, ezért azt a megporzást követő 8–11. napon célszerű izolálni a fejlődő szemekből;

 a kétszikű növények éretlen és érett magvaiból is lehet kultúrákat létesíteni: az érett endospermium dedifferenciálódásának elősegítése végett célszerű azt az embriókkal együtt a táptalajra helyezni, mely utóbbiak az endospermium fejlődésének megindulását követően eltávolíthatók; az embriók hatása (embriófaktor) megfelelő gibberellines előkezeléssel helyettesíthető.

Általában a White-féle, illetve annak RANGASWAMY által módosított változatát, továbbá az MS táptalajt használják. A leggyakrabban használt kiegészítések egyszikűek esetében az élesztőkivonat és az auxinok, kétszikűeknél a szerves nitrogén-források (kazeinhidrolizátum, élesztőkivonat), az auxinok és a citokininek.

Eredményei, alkalmazása, jelentősége

Napjainkig csaknem húsz fajnál sikerült a növényregeneráció. Ezek közül az Oryza sativa, a Prunus persica, a Pyrus malus, a Citrus grandis érdemel említést. A többi faj az Actinidiaceae, Euphorbiaceae, Loranthaceae és a Santalaceae családba tartozik. A Citrus, a Santalum és a Pyrus fajok regenerációjára az embriógenezis volt a jellemző és a kapott növények triploidok voltak.

A triploid növények, különösen a vegetatív úton szaporított gyümölcsfajok, erdei fafajok, zöldségfajok esetében (USA) gazdaságilag is jelentősek. A triploid növényeknek ugyanis számos előnyös tulajdonsága van, amelyek ha találkoznak a piac igényével, különleges gazdasági előnyöket jelentenek.

A triploidia napjainkban is fontos piaci értéket jelent, és általánosan használatos az alma, a banán, az eperfa, a cukorrépa, a görögdinnye (mag nélküli) nemesítésében. A triploid rezgőnyár (Populus tremuloides) fája az ipari feldolgozás szempontjából sokkal értékesebb, mint a diploidé. A triploidok előállításának konvencionális módszerei autotetraploidok előállítását, majd azok diploidokkal való keresztezését igénylik, sok apró buktatóval. Az endospermium sejtek in vitro totipotenciája egy lépésben lehetővé teszi a triploid növények előállítását.

Mindezeken kívül az endospermiumtenyészet – mivel azonos típusú sejtekből áll – különleges kísérleti lehetőségeket kínál a különböző anyagok bioszintézisének tanulmányozásához is. E célból eredményes kutatások folynak a kukoricakeményítő és a kávé koffein bioszintézisével kapcsolatban, endospermium tenyészetekben.

Összefoglalva, az endospermium tenyésztés lehetővé teszi:

triploidok előállítását;

különböző másodlagos anyagcseretermékek bioszintézisének tanulmányozását kontrollált körülmények között.

4.4.2. Nucellusztenyésztés

A nucellusz tulajdonképpen a magkezdemény teste, szomatikus szövet, amely lehet egy, vagy gyakran több sejtsoros, kitöltve az embriózsák és az integumentum (magkezdemény burok) közötti teret (4/22. ábra). A mag kialakításában általában nem vesz részt – ha igen, akkor a mag perispermiuma lesz. A nucellusztenyésztés ennek a szövetnek kipreparálását, fejlődésének fenntartását, befolyásolását jelenti, steril és kontrollált feltételek között.

Tenyésztésével az ötvenes évek végén indiai kutatók kezdtek foglalkozni abból a célból, hogy egy poliembrióniát hatásosan indukáló módszert dolgozzanak ki. Kísérleti növényeik a Citrus-félék voltak. A termékenyült C. japonica ovulumokból a nucellusz csírakapu (mikropyle) felőli részét kipreparálva járulékos embrioid differenciálódást sikerült elérni. Ezt követően három egymagvú Citrus fajnál sikerült poliembrióniát indukálni és növényeket regenerálni. A poliembriónia indukciója a hetvenes évek elején már termékenyületlen ovulumból preparált nucellusz szövetből is sikerült a C. sinensis és C. aurantifolia fajoknál.

Eredményei, alkalmazása, jelentősége

E módszerrel lehetővé válhat, hogy embriókat kapjunk olyan esetben is, amikor a zigóta eredetű embrió abortál. Ezenkívül sikerrel alkalmazták a nucellusz tenyésztést a különböző Citrus fajok vírusmentesítésére is.

A Citrus fajokban elért eredményekre alapozva egyéb gyümölcs- és zöldségfajokkal is sikeres kísérleteket végeztek, melyek közül a ‘Cabernet Sauvignon’ szőlőfajta termékenyítetlen ovulumából származó nucellusz sikeres növényregenerációja érdemel említést.

Összefoglalva, a nucellusztenyésztés lehetővé teszi:

  • poliembriónia indukcióját in vitro,

  • vírusmentes növény előállítását.

4.5. Generatív sejttenyészetek

4.5.1. Izolált mikrospóra tenyésztés

A hetvenes években az izolált mikrospóra tenyészetekhez nagy reményeket fűztek. Az első haploid dohányt előállító, és 1972-ben elhunyt francia J. P. Nitsch felesége, C. NITSCH által kidolgozott, majd továbbfejlesztett technika azonban nem tudott elterjedni, mert néhány faj kivételével a haploid gyakoriság azonos vagy kisebb volt az egyszerűbb portokkultúráénál.

A 90-es években azonban úgy tűnik, megtörtént az áttörés. A módszerek tökéletesítésével lehetővé vált egy rutinszerűen is alkalmazható módszer kidolgozása és bevezetése.

A portoktenyészetekből regenerált növények felhasználása során sok problémát okozhat – a regeneránsok eredetére vonatkozóan – az a tény, hogy egy tenyészetben egyszerre n és 2n sejtek, szövetek találhatók. Markerek hiányában nagyon nehéz a portokfal diploid szövetéből fejlődött diploid (2n) embrió vagy kallusz és a pollen eredetű (n vagy 2n) embrió vagy kallusz megkülönböztetése. Ez a probléma mikrospóra tenyésztéssel kiküszöbölhető. A portokkultúrának hátránya továbbá, hogy a mikrospórák nem érintkeznek közvetlenül a táptalajjal. A táptalaj és a pollen között mint egy biológiai szűrő helyezkedik el a portok fala. Ez komoly bizonytalansági tényező a portok tenyésztése során, viszont nem jelent problémát a mikrospóra tenyésztés esetén. Az izolált mikrospórákból regenerált növények garantáltan egy sejt eredetűek.

Története

Az első próbálkozásokról, amelyeket különböző Brassica, Lotus és Petunia fajokon végeztek, az 1970-es évek elején számoltak be.

Egyebek között a következő fajok izolált mikrospóra tenyészeteiből regeneráltak növényeket: Atropa belladonna, Brassica napus, Brassica carinata, Datura innoxia, Hordeum vulgare, Hyoscyamus sp., Nicotiana rustica, Oryza sativa, Petunia hybrida, Solanum melongena, Solanum tuberosum, Triticum aestivum, Triticale, Zea mays.

Módszere

A sikeres mikrospóra tenyésztéshez a virágokat a legtöbb faj esetében a középső egymagvas és a korai kétmagvas pollenfejlődési állapotban izolálják. Az androgenezis megfelelő indukciója általában szükségessé teszi hideg (pl. 5 °C 1–2 hét), vagy ozmotikus stressz (pl. maltóz) alkalmazását.

A virágokat a feldarabolást (1–2 cm) követően homogenizálni kell vagy közönséges háztartási robotgéppel, vagy külön erre a célra kifejlesztett ,,mixerrel” (Waring Micro Blendor). Fontos, hogy e folyamatban a szomatikus szövetekből felszabaduló anyagok minél kisebb stresszt okozzanak a mikrospóráknak. A macerálást ezért célszerű speciális oldatban (pl. 0,3 M mannitol) és/vagy hűtőszekrényben végezni. Az így kapott durva homogenizátumot a pollen méreténél nagyobb pórusátmérőjű szöveten vagy nylonszűrőn kell átszűrni (50 µm–160 µm). Néhány faj mikrospórájának átmérője: dohány 40 µm paradicsom 25 µm, kukorica 100 µm. Ezután a mikrospórákat tartalmazó szűrletet percenként 1000 fordulattal kell centrifugálni öt percig.

Az így kapott mikrospórák már tenyészthetők, azonban célszerű a nem életképes pollent is eltávolítani. Ezért gradiens centrifugálást (pl. táptalajra rétegezett 20%-os Percoll vagy 21% maltózra rétegezett 0,3M mannitol) kell végezni 10 percig, maximum 600/perc fordulatszámon. A centrifugálást követően az alkalmazott oldatok között elhelyezkedő réteg tartalmazza az életképes mikrospórákat.

A Percoll 20–30–40 és 50%-os oldatát használva a különböző fejlettségi stádiumban lévő mikrospórák is szétválaszthatók. A kukorica esetében a késői egymagvas mikrospórákat és a korai kétsejtes pollenszemeket a 20 és 30%-os Percoll oldat közötti réteg tartalmazza, ha az oldatot 3 percig 225/perc fordulaton centrifugáljuk.

A tenyésztéshez alkalmazott táptalajok nem különböznek a portok kultúráétól. Fontos viszont a megfelelő sűrűség beállítása, ami fajtól függően 7,5 x 103 és 2,5 x 105 mikrospóra/ml kö zött változhat.

Tenyészthetők a mikrospórák folyékony táptalajra helyezett 10 µm porózus nejlonhálón is. Az izolálást követő 3–5 héten megjelenő embriószerű struktúrákat szilárd növényregeneráló táptalajra célszerű átoltani.

Az androgenezis arányát növelni lehetett árpa és búza esetében az izolált ováriummal való együtt-tenyésztéssel. Pauk és mtsai szerint a mikrospóra izolálást követő első öt napon kell az ováriumokat a táptalajba helyezni és legalább 5 napig együtt kell tenyészteni a mikrospórákkal a kedvező hatás eléréséhez.

A pollenembriókat a szomatikus embriókhoz hasonlóan érlelni kell, hogy teljesen kifejlődjenek és csírázóképesek legyenek. Ezért célszerű a táptalaj ozmotikus értékét a tenyésztés elején növelni (pl. 230–240 m Osm/kg H2O), majd a végén felére csökkenteni.

Ezután a mikrospórákat tartalmazó szűrletet öt percig percenként 1000 fordulattal kell centrifugálni.

Alkalmazása, jelentősége

Az izolált mikrospóra tenyésztés előnyei a portokkultúrával szemben a következők:

  •  A tenyészetben csak meiotikus eredetű haploid sejtek vannak, emiatt a regenerált növények haploid eredete biztos, még akkor is, ha azok diploidok, vagy poliploidok.

  • A tenyésztett mikrospórák közvetlenül érintkeznek a táptalajjal, ami lehetővé teszi az empírián alapuló elemek fokozatos kizárását a technika egyes lépéseiben.

  • Lehetővé válhat a mikrospórák szelekciója, tehát a szelekció haploid szinten, ami korai fázisban is biztosítja a működő recesszív génekre történő szelekció lehetőségét.

  • Lehetővé válhat nagyszámú hímivarsejt izolálása az in vitro termékenyítéséhez, amennyiben nem androgenezist indukálunk, hanem a mikrogametogenezist tartjuk fenn in vitro.

  • Lehetőséget ad pollen transzformációra és egy lépésben homozigóta (DH) transzformánsok előállítására.

  • Lehetőséget ad krioprezervált, és hosszú ideig tárolt pollenből növények regenerálására.

4.5.2. Ivarsejtek izolálása és in vitro fúziója

Az állatokkal és az alacsonyabbrendű növényekkel ellentétben a magasabbrendű növények gamétáinak izolálása és az ivarsejtek in vitro fúziója majd ,,lombik” növények felnevelése csak a 90-es években vált lehetségessé. A magasabbrendű növények gamétái – az állatokétól eltérően – ugyanis nem szabadon mozgó önálló sejtek, hanem részei az embriózsáknak a petesejt esetében, vagy a pollennek a hímivarsejt esetében. Ilyen értelemben az in vitro termékenyítés ovulumon (embriózsákon) kívüli termékenyítésként is felfogható.

A magasabbrendű növények esetében a hím gamétát a pollenben levő két sperma sejt jelenti, a női gaméta alatt az embriózsák csírakapu felé eső oldalán a két szinergida sejt között lévő petesejtet értjük. Az ivarsejtek izolálása azt a folyamatot jelenti, mely során a gamétákat kiszabadítjuk a részben haploid, részben diploid sejtből, illetve szervből, hogy azok az állati ivarsejtekhez hasonlóan szabad sejtekké váljanak. Az in vitro termékenyítés az izolált hím-, illetve női ivarsejt mesterségesen kiváltott fúzióját jelenti folyékony közegben, steril körülmények között (4/23. ábra). E vonatkozásban tehát az in vitro termékenyítés alapvetően különbözik a már bemutatott ,,megporzás és megtermékenyítés kémcsőben” technikától (4.3.4).

Kép

4/23. ábra: In vitro termékenyítés Hibrid kukorica növény előállításának vázlata a gaméták izolálásával és fúziójával (Kranz és Dresselhaus 1996 nyomán)

Története

Először Wageningenben sikerült 1986-ban Spinacea pollenből hímivarsejteket izolálni. Az első sikeres in vitro termékenyítésről Lörz professzor (Köln–Hamburg) kutatócsoportja számolt be, az IAPTC (Növényi Sejt- és Szövettenyésztők Nemzetközi Társasága) VII. Konferenciáján Amsterdamban, 1990-ben. Magát a kariogámiát, tehát a kétféle ivarsejt magjainak fúzióját Faire bizonyította 1993-ban.

Módszere

Ivarsejtek izolálása (4/24. ábra)

A hím ivarsejteket leggyakrabban ozmotikus sokk alkalmazásával szabadítják ki a pollenből, melyeket az éppen felpattanó portokokból izolálnak. A fúziós oldatban már kiszabaduló hím ivarsejteket (sejtmagokat) mikrokapillárissal (20 µm átmérő) lehet mikroszkóp alatt elkülöníteni, szelektálni.

Kép

4/24. ábra: A búza (T. aestivum L.) petesejt mikromanipulációja. A: Az embriózsák mikropyle felőli részlete a petesejttel, B: Mikrosebészeti módszerrel izolált fiatal, vakuolizált petesejt protoplaszt, C: Izolált búza petesejt és hím ivarsejt in vitro elektrofúziója, D: A fúziót követő kariogámia, a sejtmagok egybeolvadása, E: Idegen DNS mikroinjektálása fiatal petesejt protoplasztba, F: GFP (Green-fluorescent protein) gén tranziens expressziója a mikroinjektált búza petesejtben (Barnabás B. és mtsai kísérlete, MTA Mg. KI, Martonvásár)

A petesejtek izolálásakor először az embriózsákot is tartalmazó ovulumot mannitol oldatban (70 m Osm/kg H2O) izolálják. Ezt követően az embriózsákot körülvevő szomatikus szövetet (nucellus, integumentum) enzimkeverékkel (pl. 0,75% pektináz, 0,26% pektioláz, 0,5% hemicelluláz és 0,5% celluláz) 24 °C-on, 30 percig emésztik. Az embriózsákok és a petesejtek kiszabadítása mikromanipulátor segítségével mechanikusan, üvegtűkkel történik. Természetesen mikrokapillárissal (200 µm) a szinergidák és a központi sejt is izolálhatók.

Ivarsejtek fúziója

Az izolált gaméták sejtfal nélküliek, tehát tulajdonképpen protoplasztoknak tekintendők. A kukorica hím ivarsejtjének átmérője 7 µm, a petesejté 77 µm. A fúzió ezért minden olyan módszerrel kivitelezhető, amit a szomatikus protoplasztokra kidolgoztak (lásd a 6.3. fejezetet).

A kémiai fúzió esetén tápoldatot használnak a mikrocseppben, nagy kalcium-koncentráció (0,01–0,05M CaCl2) és nagy pH érték (11,0) mellett. Az elektrofúziót mikrocsepptenyészetben célszerű végezni, mely 2 µl mannitol-oldatot jelent, olajréteggel fedve. A fúziós gyakoriság átlagosan 85%. Az elektrofúzió további előnye a kémiai fúzióval szemben, hogy nagyobb arányban kaphatunk – a fúziós termékek között – mesterséges zigótát, tehát kívánt petesejt-hímivarsejt fúziót (4/24. ábra).

In vitro zigóták tenyésztése, növényregenerálás

Az in vitro fúziót követően a mesterséges zigóták gyorsan soksejtes struktúrává fejlődnek, ha a megfelelő mikrotenyésztési rendszer rendelkezésre áll. A fúziót követően 40–60 óra múlva a zigóta osztódik. Az első aszimmetrikus osztódást az organellumok egyenlőtlen eloszlása kíséri. A további osztódások során a sejtek mérete csökken, majd kialakul a proembrió, illetve nyomon követhetők az embriógenezis főbb fázisai.

A fúziót követő 10–15. napon az embriókat szilárd táptalajra oltják át, a kukorica embriók ekkor már elérik 0,4–0,5 mm-t. A kis növények a 3–5. héten alakulnak ki. Az in vitro megtermékenyítésből felnevelt növények fertilisek és hibrid fenotípust mutatnak abban az esetben, amikor a szülői gaméták különböző vonalakból származnak.

Eredményei és jelentősége

Gamétákat sikerült izolálni az utóbbi években Zea, Nicotiana, Torenia, Triticum, Plumbago, Hordeum és Lolium fajokból. Fertilis növényt napjainkig kukoricánál (4/23. ábra), búzánál és árpánál neveltek fel. Külön említést érdemel hazánkban Barnabás Beáta és csoportja, mely a világon elsőként sikerrel izolált és fuzionáltatott búza hímivarsejtet és petesejtet, valamint kidolgozta a növényi izolált petesejt mikroinjektálásának technikáját is. Az utóbbi módszer lényege, hogy a nagyfrekvenciájú (1 MHz) váltakozó áram elektromágneses erőterének (45–50 V/cm) segítségével lehetővé teszi a kezelendő petesejtek immobilizációját és az idegen DNS-nek a sejtekbe, illetve a sejtmagba juttatását.

Az in vitro termékenyítési módszer jelentősége a következő:

  • Áthidalja azt a szakadékot, ami az ivaros keresztezés és a szomatikus protoplaszt fúzió között volt.

  • Lehetővé teszi az intra- és interspecifikus keresztezéseknél fellépő inkompatibilitási tényezők egy részének kiküszöbölését. Heterológ gaméták fúziójával már előállítottak kukorica x cirok, kukorica x Coix, kukorica x búza hibrid sejtkultúrákat.

  • A genomok és plasztonok különböző kombinációi (pl. cibridek) is előállíthatók, hasonlóan a szomatikus fúzió lehetőségeihez.

  • A hímivarsejt és a haploid központi sejtek fúziójával triploid endospermium is előállítható.

  • Lehetőséget ad a zigóta első osztódásának nyomonkövetésére, a gaméták módosítására, a zigótákban és az ivarsejtekben a fúzió előtt és után működő gének (pl. zigóta specifikus gének) vizsgálatára, azonosítására.

  • Lehetőséget ad az ivarsejtek, illetve a zigóta genetikai transzformációjára.

4.6. Az apomixis biotechnológiája

Általában úgy gondoljuk, hogy a mag a növények ivaros szaporodásának egyetlen lehetséges módja és terméke. Kevésbé ismert, hogy több száz növényfaj magja ivartalan úton keletkezik.

Az apomixist régen gyűjtőfogalomként határozták meg, azaz minden beletartozott, ami ivartalan szaporodást jelentett. Napjainkban azt a folyamatot értjük rajta, mely során a virágban csíraképes mag fejlődik megtermékenyítés nélkül (gametofitikus apomixis).

4.6.1. Típusai

A gametofitikus apomixis a növénynemesítés egyik legnagyobb és legérdekesebb lehetősége. A gametofitikus apomixis lényege, hogy a növényen – megtermékenyítés nélkül – olyan mag fejlődik, mely csak az anyanövény diploid genomját (2n) tartalmazza (4/25. ábra). Tehát az ilyen maggal való szaporítás klónozást jelent.

Kép

4/25. ábra: A zárvatermő növények szabályos ivaros (A) és apomiktikus (B és C) életciklusa (den Nijs és van Dijk 1993 nyomán).

Az apomixis bekövetkeztének két feltétele van. Az egyik feltétel, hogy a meiózis hibájából redukálatlan embriózsák alakuljon ki. Ez kétféle lehet:

1. Diplospória: az embriózsák a redukálatlan megaspóra anyasejtből származik, pl. Eragrostis curvula. A diplospória során a meiózis után nem tetrád (4 haploid sejt), hanem diád (2 diploid sejt) alakul ki.

2. Apospória: az embriózsák a szomatikus nucellusz szövet sejtjéből alakul ki, pl. Panicum maximum. Az apospória típusú embriózsák nem 8, hanem 4 diploid sejtmagot tartalmaz.

A másik feltétel a parthenogenezis (a redukálatlan petesejt termékenyülés nélkül fejlődik embrióvá), mely diploid embriót eredményez.

Természetesen az apomixis esetén is előfordulhatnak alternatív fejlődési utak, melyek közül a következőket kell megemlíteni:

a) Apogámia: a diplospória típusú fejlődésnek az a változata, amikor az embrió nem a petesejtből, hanem az embriózsák valamely másik redukálatlan sejtjéből alakul ki.

b) Adventív vagy nucelluszembriónia (poliembriónia): A Citrus-féléknél gyakori fejlődés, mely teljesen eltér az eddigiektől. Ebben az esetben ugyanis nem alakul ki az embriózsák, az embriók közvetlenül a sporofita eredetű (szomatikus) nucellusz szövet sejtjeiből fejlődnek.

Az apomiktikus fajok egy részénél egyáltalán nem szükséges a megporzás és megtermékenyítés az endospermium fejlődésének kiváltásához. Ebben az esetben az endospermium vagy az egyik központi sejtből (2n) vagy azok fúzióját követően (4n) indul fejlődésnek.

Az apomiktikus növények egy másik csoportja esetében azonban szükség van a megporzásra, hogy mind a petesejt, mind az endospermium fejlődésnek induljon. Ennek a folyamatnak a neve pszeudogámia.

c) A pszeudogámia esetében a petesejt nem termékenyül meg, de a redukálatlan poláris sejtek és a központi sejtek igen. Ennek következtében az endospermium ploidszintje 5n lesz, mert az apomiktikus fajok mikrosporogenezise normális, a fertilis pollen haploid (n).

d) A haploid parthenogenezis (ginogenezis) az apomixis egyik speciális formája. Ebben az esetben van redukció és megporzás is. Az embriózsák sejtjei haploidok, és a haploid petesejt vagy valamelyik másik sejt parthenogenetikusan fejlődik embrióvá. Ezt azonban a 4.3. fejezetben már részleteztük.

e) A fakultatív apomixis azt jelenti, hogy az adott faj egyedein a magvak zöme apomixissel, egy része viszont szexuális úton keletkezhet. Ennek előnye, hogy az így szaporodó populáció vagy fajta genetikai diverzitása nem csökken.

f) Az obligát apomixis esetén a növényen csak apomiktikus magvak fejlődnek.

A világon 34 növénycsaládban összesen 308 fajnál bizonyították az apomiktikus szaporodást. A jelentősebb családok az Asteraceae (69 faj), Gramineae (95 faj), Liliaceae (7 faj), Rosaceae (68 faj), Rutaceae (7 faj), Urticaceae (9 faj). Az apomiktikus szaporodás különösen gyakori a Panicoidae alcsaládba tartozó trópusi és szubtrópusi füveknél. A kukoricának, ciroknak, kölesnek sok olyan rokonfaja van, melyek apomixissel szaporodnak.

Az apomixis fajtája alapján leggyakoribb az apospória típusú (160 faj), de hasonló nagyságrendet képvisel a diplospória típusú (104 faj) fejlődés is. Az adventív embriónia 44 fajra jellemző.

Diplospóriával szaporodó fajok közé tartozik az Eragrostis curvula és a Taraxacum officinale. Ismertebb apospóriás fajok a Panicum maximum, a Ranunculus auricomus és az Elymus restisetus.

4.6.2. Biológiája

Apospória esetén – melyet Ranunculus auricomus-nál bizonyítottak – verseny figyelhető meg a kétféle, meiotikus és nucellusz eredetű embriózsák között. Az apospóriánál a redukálatlan embriózsák előbb fejlődik ki és válik alkalmassá a hím ivarsejt, pontosabban a pollentömlő fogadására, mint a meiotikus. Mivel a kétféle embriózsák nyílása, a csírakapu nagyon közel van egymáshoz, a megporzást követően a pollentömlő már az érett embriózsákba fog behatolni. Ebben az embriózsákban viszont nem képes a petesejtet megtermékenyíteni, mert addigra a petesejt sejtfala is kialakul, ami lehetetlenné teszi a megtermékenyítést.

Az apospória kialakulása feltételezések szerint azért következhet be, mert egyrészt az embriózsák anyasejtből valamilyen szignálmolekula átjut a szomszédos szomatikus sejtekbe, indukálva azok osztódását, másrészt a megaspóra anyasejtben bizonyos gének működése gátolt, és ennek következtében a meiózis normális lefolyásához szükséges fehérjék hiányoznak. Ez az oka annak, hogy a szexuális embriózsák abnormálisan alakul ki.

A fentiek ellenére túlzás lenne azt állítani, hogy az apomixis nem több, mint egy meiotikus mutáns. Ezt támasztja alá az is, hogy a mikrospóra anyasejt meiózisa is zavart.

Anatómiailag az apomiktikus és nem apomiktikus növények között az a különbség, hogy az embriózsák anyasejtet körülvevő nucellusz sejtek az utóbbiakban általában vastag sejtfalúak, szemben az apomiktikus növényekkel, ahol a sejtfal sokkal vékonyabb.

Az apomiktikus fajok zöme poliploid, melyek között auto- és alloploidok is előfordulnak, bár az utóbbiak gyakoribbak. A fajok zömében a kromoszómaszám variábilis, például a fakultatív apospória típusú apomiktikus Poa pratensis kromoszómaszáma 2n = 28–154 is lehet. A fajok zöme heterozigóta, ennek ellenére az öntermékenyítéssel kapott nemzedékekben általában nem mutatkozik beltenyésztéses leromlás.

Az apomixissel szaporodó fajok növényein vagy csak apomiktikus magvak fejlődnek (obligát apomixis) vagy mitotikus és meiotikus eredetű magvak egyaránt fejlődhetnek (fakultatív apomixis). Az utóbbi annak is lehet a következménye, hogy a fakultatív apospória típusú apomixis esetén a mitotikus és meiotikus eredetű embriózsákok ugyanabban az ovulumban foglalhatnak helyet. Bizonyos gyakorisággal előfordulhat, hogy a pollentömlő a meiotikus embriózsákba hatol be.

4.6.3. Biotechnológiai lehetőségei

A növénynemesítés célja az apomixisért felelős gének átvitele a kultúrfajokba. A biotechnológia és molekuláris biológia lehetősége és feladata lenne az apomixisért felelős gének azonosítása és izolálása, transzformációs vektorba építése, illetve átvitele az amfimixissel szaporodó fajokba. Sajnos ettől még távol vagyunk. Napjainkig még nem sikerült az apomixisért felelős gént/géneket izolálni. Többek között azért sem, mert még abban sem egyöntetű a tudomány álláspontja, hogy hány és milyen gén határozza meg az apomixist.

Az apomixis kialakulásában résztvevő gének száma fajonként változó (1–4). A génekről bizonyították, hogy lehetnek dominánsak, receszívek és episztatikusak. Azonosításuk a 90-es években kezdődött.

Az egy lókuszos modellt vallók szerint az apospóriát egy recesszív letális gén határozza meg. A Panicum maximum genetikai analízise alapján egybehangzó az a vélemény, hogy az apomixist egy domináns gén határozza meg és az monogénikusan öröklődik. Szexuális x apomiktikus kombinációk esetében mindig 1:1-es hasadást kaptak. A Hieracium apomixiséért is bizonyítottan egy gén a felelős.

A kétgénes modell ezzel szemben hivatkozik az apomixis két alapvető lépésére, a redukálatlan meiózisra és a diploid embriók autonóm fejlődésére, melyek 1 génnel nehezen magyarázhatók. A diplospóriánál is ezért részben recesszív, illetve domináns géneket feltételeznek.

Az a kérdés is részletesebb vizsgálatra szorulna, hogy az apomiktikus embriózsákban hogyan alakulhat ki a fehérjében gazdag raktározószövet, mely az embriót táplálja?

A fentiek ellenére az apomixisnek, mint maggal történő vegetatív szaporodásnak (klónozásnak), a lehetősége nagy jelentőségű a jövőre nézve, különösen a heterózis hibrid, illetve transzgénikus formák esetében.

Ameddig a molekuláris megközelítés, a géntechnológia alkalmazása nem lehetséges, a szaporodás biotechnikái és a szomatikus sejtgenetika segíthetik:

  • Az apomiktikus gének introgresszióját embriókultúrával és in vitro termékenyítéssel.

  • Backcross nemesítés során a generációváltás gyorsítását a fejlett embriók in vitro tenyésztésével.

  • Lehetőség van a további apomiktikus vonalak mikroszaporítással, esetleg szomatikus embriókkal való felszaporítására.

  • Lehetőség van az apomiktikus vonalak hasadásának megszüntetésére DH-technikával.

  • Lehetőség van aszimmetrikus protoplaszt fúzióval gének átvitelére, amennyiben szexuális úton a fajok nem keresztezhetők.

  • Lehetőség kínálkozik ovulum kultúrában in vitro megporzással az apomixis folyamatának kísérletes nyomonkövetésére.

Indukált parthenogenezis in vitro

A pollenstimuluson alapuló parthenogenezis napjainkra a leghatékonyabb haploid előállítási módszerré vált a petúnia esetében. A haploid növények az 500 Gy gamma sugárdózist kapott pollennel termékenyített növények ováriumainak in vitro kultúrájából nevelhetők fel. A besugárzott pollen a ginogenezis stimulálása mellett résztvehet a megtermékenyítésben is, amely apai eredetű kromoszómafragmentek megjelenésével járhat a regenerált haploidokban. Ezeket haploid plusz növényeknek nevezték el.

Hasonlóan, besugárzott pollennel állítottak elő haploidokat a Musa acuminata fajból, melynek beporzó faja a M. balbisiana. Amennyiben ez utóbbi faj pollenje 50–200 Gy gamma sugárdózist (Co60) kapott a megporzást követően, a pollen képes volt tömlőt hajtani, de megtermékenyítés nem történt. A parthenogenetikus embriókat az endospermium hiánya miatt a 80. napon embriókultúrában nevelték tovább. A növények nagy része diploid volt, de két haploidot (n=11) is kaptak.

Ováriumkultúra

Az első sikeres ováriumkultúrák után a kutatók azt gondolták, hogy az igazi sikert a felhasználásban az apomiktikus fajok fogják jelenteni. Az apomiktikus fajok egy része ugyanis az embriófejlődés indukciójához nem igénylik a kettős megtermékenyítés következményeként jelentkező stimulust. Ezért feltételezték, hogy az apomixist ezeknél a fajoknál in vitro igazán könnyű lesz indukálni és fenntartani. Nem így történt. Napjainkig kevés obligát apomiktikus faj ováriumkultúrájában sikerült embriót, illetve magot kapni. Ezek közé tartozik az Aerva tomentosa (Amaranthaceae) és egy Zephyranthes faj.

Nucelluszkultúra

A nucellusz szövet tenyésztésével az ötvenes évek végén indiai kutatók kezdtek foglalkozni abból a célból, hogy az apomixis egyik típusát, a poliembrióniát (adventív embrióniát) in vitro indukálják. A nucellusz tulajdonképpen a magkezdemény teste, szomatikus szövet, amely lehet egy, vagy gyakran több sejtsoros, kitöltve az embriózsák és az integumentum (magkezdemény burok) közötti teret (4/22. ábra). A mag kialakításában általában nem vesz részt, vagy ha igen, akkor a mag perispermiuma lesz.

A nucellusztenyésztés ennek a szövetnek kipreparálását, fejlődésének fenntartását, befolyásolását jelenti steril és kontrollált feltételek között. Először a Citrus japonica ovulumokból a nucellus, csírakapu (mikropyle) felőli részét kipreparálva sikerült járulékos embrioid differenciálódást elérni. Ezt követően három egymagvú Citrus fajnál sikerült poliembrióniát indukálni és növényeket regenerálni.

A poliembriónia indukciója a hetvenes évek elején már megporzás nélküli ovulumból preparált nucellusz szövetből is sikerült a C. sinensis és C. aurantifolia fajoknál.

A Citrus fajokban elért eredményekre alapozva egyéb gyümölcs- és zöldségfajokkal is sikeres kísérleteket végeztek, melyek közül a ‘Cabernet Sauvignon’ szőlőfajta termékenyítetlen ovulumának nucelluszából elért sikeres növényregeneráció érdemel említést. (lásd: 4.4.2., 87. o).

Felhasznált és ajánlott irodalom

Armstrong, T. A., T. S. Soong, M. A. W. Hinchee (1987): Culture of detached spikes and early development of fourth floret caryopsis in wheat. J. Plant Physiol. 131, 305–314.

Baarlen, P. (1998): What can we earn from natural apomicts? Trends in Plant Science 4, 43–44.

Bajaj, Y P. S., Saini, S. S., Bidani, M. (1980): Production of triploid plants from the immature and mature endosperm cultures of rice. Theor. Appl. Genet., 58, 17–18.

Barnabás, B., Fransz, P. F, SChel, J. H. N. (1987): Ultrastructural studies on pollen embryogenesis in maize (Zea mays L.). Plant Cell Rep., 6, 212–215.

Barnabás, B., Pfahler, P. L., Kovács, G. (1991): Direct effect of colchicine on the microspore embryogenesis to produce dihaploid plants in wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet. 81: 675–678.

Barnabás B., B. Obert, Kovács G. (1999): Colchicine an efficient genome-doubling agent for maize (Zea mays L.) microspores cultured in anthero. Plant Cell Rep. 18. 858–862.

Bernier G. (1992): The control of flower formation: Exogenous and endogenous. In: Dattée, Y. C.Dumas, A. Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 29–38. Springer Verlag, Berlin, New York.

Bhojwani, S. S. (1984): Culture of endosperm. In: VASIL, I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Acad. Press Inc., Orlando, Florida, 258–268.

Bommineni V. R. Greyson, R. I. 1990: Regulation of flower development in cultured ears of maize (Zea mays L.). Sex. Plant Reprod. 3, 109–115.

Chlyah H., S.Cherkaoui, N. Saidi, O. Lamsaouri, M: Mdarhi-Alaoui, H.Benkirane, O. Chlyah, O. Amail: (1999): Green haploid plant production in durum wheat by various haploid methods. In: Altman. A., Ziv M. Izhars S. (eds.): Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century 119–122. Kluwer Acad. Publs. Dordrecht–New York–London.

Collins, G. B., Grosser, J. W. (1984): Culture of embryos. In: VASIL, I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Acad. Press, Inc., Florida. 241–257.

Den Nijs, A. P. M., G. E. van Dijk. (1993): Apomixis. in: Hayward M. D., N. O. Bosemark, I. Romagosa (eds.) Plant Breeding. Principles and Prospects. 229–245. Chapman and Hall, London–New York.

Dunwell J. M. (1986): Pollen, ovule and embryo culture as tools in plant breeding. In: Withers L. A., Alderson, P. G. (eds.): Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications. Butterworths, London, 375–404.

Dunwell, J. M. (1992): Mechanisms of microspore embryogenesis, in: Dattée Y., C. Dumas, A.Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 121–130. Springer Verlag, Berlin, New York.

Faure, J. E., Digonnet, C., Dumas, C. (1994): An in vitro system for adhesion and fusion of maize gametes. Science 243, 1589–1600.

Foroughi–Wehr, B. Wenzel, G. (1993): Andro- and parthenogenesis. In. Hayward, M.D., N.O. Bosemark, I. Romagosa (eds): Plant Breeding, Principles and Prospects. 261–278. Chapman and Hall, London.

Gengenbach, B. G. (1984): In vitro pollination, fertilization and development of maize kernels. In: Vasil–. I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plant. Acad. Press, Orlando, Florida, 1, 276–282.

Greyson R. J. (1996): Maize inflorescence culture. In: Freeling, M.: V.Walbot (eds): The Maize Handbook. 712–714. Springer Verlag, New York, Berlin.

Guang Y., H., Korbuly, E., Barnabás B. (1993): High frequency callus formation and regeneration of fertile plants from haploid cell suspensions derived from anther culture in wheat (Triticum aestivum L.). Plant Science, 90, 81–87.

H. Enyingi K., Heszky L. E. (1973): A Trifolium pratense L. szívstádiumú embriójának felnevelése embriókultúrában: az in vivo és in vitro embriógenezis eltérései. Botanikai Közlemények, 60, 213–220.

Heszky L. (1972): Az embriókultúrának, mint módszernek az alkalmazása a növénynemesítési és genetikai kutatásokban. Növénytermelés 21, 185–190.

Heszky L. E., Pauk J. (1975): Induction of haploid rice plants of different origin in anther culture. Il Riso, 24, 197–204.

Heszky L. E., Mesch J. (1976) : Anther culture investigations in cereal gene bank collection. Z. Pflanzenzüchtung, 77, 187–197.

Heszky L. E., Li Su Nam, Kiss E., Simon-Kiss I., Lőkös K., Do Q.B. 1991: In vitro production of rice in Hungary in: Y.P.S. Bajaj (ed): Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 6. Rice. 619–641. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg – New York.

Heszky L. E., Simon-Kiss I. and Do Q. Binh (1996): Release of rice variety ’DAMA’ developed through haploid somaclone breeding in: Y. P .S: Bajaj (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 36. (Somaclonal variation in Crop Improvement II.). 46–54. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg–New York.

Hu. C., Wang, P. (1986): Embryo culture: Technique and application. In: Evans, D. A., Sharp W. R., Ammirato P. V (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 4. Techniques and Applications. MacMillan Publ. Comp., New York, 41–96.

Jafari, A. M., Kiss J., Tőkei K.M, Gergácz J. Heszky L. E. (1995): High efficiency callus induction and haploid plant regeneration in anther culture of two poplar species. Silvae Genetica, 44, 141–145.

Kanta, K., Rangaswamy, N. S., Maheshwari, P. (1962): Test-tube fertilization in a flowering plant. Nature, London, 194, 1214–1217.

Kanta, K. (1960): Intraovarian pollination in Papaver rhoeas L. Nature, London, 188, 683– 684.

Keller, W. A., Arnison, P. J., Brian, J. C. (1987): Haploids from gametophytic cells. Recent developments and future prospects. In: Green, C. E., Somers, D. A., Hackett, W P. Biesboer, D. D. (eds.): Plant Tissue and Cell Culture. Alan R. Liss. Inc., New York, 231–241.

Kovács M., Barnabás B, Kranz E. (1995): Electro-fused isolated wheat (Triticum aestivum L.) gametes develop into multicellular structures. Plant Cell Rep. 15, 178–180.

Kranz, E., Bautor, J. Lörz, H. (1990): In vitro fertilization of single, isolated gametes, transmission of cytoplasmic organelles and cell reconstitution of maize (Zea mays L.). In: Nijkamp, H.J.J., L.H.W. van der Plas., J. van Aartrijk (eds): Progress in Plant Cellular and Molecular Biology. 252–257. Kluwer Acad. Publishers. Dordrecht, Boston, London.

Kranz, E., Lörz, H. (1993): In vitro fertilization with isolated, single gametes results in zygotic embryogenesis and fertile maize plants. Plant Cell 5, 739–746.

Kranz, E., T. Dresselhaus (1996): In vitro fertilization with isolated higher plant gametes. Trends in Plant Science, 1, 82–88.

Kranz, E., Wiegen, P., Quader, H., Lörz H. (1998): Endosperm development after fusion isolated single maize sperm and central cells in vitro. Plant Cell 10: 511–524.

Maheshwari P., Rangaswamy, N. S. (1965): Embryology in relation to physiology and genetics. Adv. Bot. Res., 2, 219–321.

Maheshwari, W. (1958): In vitro culture of excised ovules of Papaver somniferum. Science, 127, 342.

Molnár-Láng, M., Sutka J. (1994): The effect of temperature on seed set and embryo development in reciprocal crosses of wheat and barley. Euphytica 78, 53–58.

Molnár-Láng, M., Linc G., Sutka J. (1999): Production and molecular cytogenetic identification of wheat-barley hybrid and translocations J. Plant Biotechnol. 1, 8–12.

Monostori, T., P. Matti, J. Pauk: 1998. Tritikale in vitro androgenezis izolált mikrospóra tenyészetben. Növénytermelés 47, 371–382.

Nitsch J. P. (1951): Growth and development in vitro excised ovaries. Am. J. Bot., 38, 566–577.

Nitsch, J. P. (1963):The in vitro culture of flowers and fruits. In: MaheshwariI P., Rangaswamy, N. S. (eds.): Plant Tissue and Organ Culture. Univ. Delhi, India, 198–214.

Nishii, T., Mitsuoka, S. (1969): Occurrence of various ploidy plants from anthers and ovary culture of rice plant. Jpn. J. Genet., 44, 341–346.

Pauk J., Kertész Z., Barabás Z. (1988): Búzatörzsek előállítása portoktenyészetből és szereplésük teljesítménykísérletekben. Növénytermelés 37, 197–203.

Pauk J., Puolimatka M., Tafti M. N., Mesterházy A. Kertész Z. (1999): Integration of in vitro induced doubled haploids in wheat breeding programs. Proc. Cost 824 Workshop on Gametic Embryogenesis, Jokioinen, Finland, 53–57.

Petolino, J. F., A. D. Genovesi (1996) Anther and microspore culture in: Freeling, M.,V.Walbot (eds.): The Maize Handbook 701–704. Springer. New York, Berlin

PicKersgill, B. (1993) Interspecific hybridisation by sexual means. In: Hayward, MD. N. O. Bosemark, I. Romagosa (eds): Plant Breeding, Principles and Prospect. 63–78. Chapman and Hall, London.

Poulimatka M., J. Pauk (1999): Impact of explant type, duration and initiation time on the coculture effect in isolated microspore culture of wheat. J. Plant Physiol. 154, 367–373.

Pólya Z., Timár I., Szabó L., Kristóf Z., Barnabás B. (1999): Morphological characterisation of wheat (T. aestivum L.) egg cell protoplasts isolated from immature and overaged caryopses. Sex Plant Reprod. 11, 357–359.

Potyondi L., Heszky, L. E. (1992) Gynogenic haploids produced in ovule cultures of male sterile, fertile, mono- and multigerm sugar beet (Beta vulgaris L.) lines. Acta Agronomica 41, 125–130.

Puolimatka M, Laine S., Pauk J. (1996): Effect of ovary cultivation and culture medium on embryogenesis of directly isolated microspores of wheat. Cereal Res. Comm. 24, 393–400.

Raghavan, V. (ed.) (1997): Molecular Embryology of Flowering Plants. University Press, Cambridge.

Rangan, T. S. (1984): Culture of ovaries. In: Vasil., I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vol. 1. Acad. Press, Inc., Orlando, Florida, 221–226.

Rangaswamy, N. S. (1977): Application of in vitro pollination and in vitro fertilization. In: Reiner, T, J., Bajaj, Y. P. S. (eds.): Plant Cell Tissue and Organ Culture. Springer Verlag, Berlin, 412–425.

Rédei, G. (1955): Rearing wheats from ovaries cultured in vitro. Acta Bot. Sci. Hung., 2. 183–185.

Ryczkwoski, M. (1962): Changes in the osmotic value of the central vacuolar sap in developing ovules. Bull. Acad. Pol. Sci., 10, 371–374.

Sachar, R. C.–Kapoor, M. (1959): Gibberellin in the induction of parthenocarpy in Zephyrantes. Plant Physiol., 34. 168-170.

Savidan, Y. H. (1992): Progress in research on apomixis and its iransfer to major grain crops. In Dattée, Y., Dumas, C., Gallais, A. (eds.): Reproductive Biology and Plant Breeding. 269–279. Springer-Verlag, Berlin–Heidelberg–New York.

Serieys, H. (1992): In vitro culture of zygotic embryos. Its use in soya and sunflower improvement, in: Dattée Y., C. Dumas, A. Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 235–246 Springer Verlag, Berlin, New York.

Thennis, C.H. Pierson, E.S., Cresti, M. (1991): Isolation of male and female gametes in higher plants. Sex Plant Reprod. 4, 145–154.

Touraev, A., O. Vicence, E. Heberle–Bors (1997): Initiation of microspore embryogenesis by stress. Trends in Plant Science 2, 297–301.

Truong, Andre, I., Demarly, Y. (1984): Obtaining plants by in vitro culture of unfertilized maize ovaries (Zea mays L.) and preliminary studies on the progeny of a gynogenetic plant. Z. Pflanzenzücht., 92. 309–320.

Venczel G., Mitykó J., Zatykó J., Fári M. (1996): Utilization of androgenic doubled haploid (DH) lines in the improvement of an open pollinated pepper (Capsicum annuum L.) variety. Horticul. Sci. 28, 14–18.

Wakizuka, T., Nakajima, T. (1974): Effect of cultural condition on the in vitro development of ovules of Petunia hybrida Vilm. J. Breed, 34. 182–187

White, P. R. (1954): The Cultivation of Animal and Plant Cells. Roland Press, New York

Zenkteler, M. (1992): Wide hibridization in higher plant by applying the method, of test tube pollination of ovules, in: Dattée Y., C. Dumas, A. Gallais (eds): Biology and Plant Breeding. 205–214. Springer Verlag. Berlin, New York.

Zenkteler, M. (1999): Self and cross pollination of ovules in test tubes. In: Terzi, M., Cella R., Falavigua A. (eds): Current Issues in Plant Molecular and Cellular Biology 191–199. Kluwer Acad. Publishers. Dordrecht, Boston, London.

Zivanovic, B., L. Culafic: 1992. Hormonal regulation of flowering in vitro of green and photobleached Chenopodium rubrum L. plant. Proc. XIII. Cong. EUCARPIA Reproductive Biology and Plant Breeding. Anger, France pp. 24–30.