Ugrás a tartalomhoz

Növényi biotechnológia és géntechnológia

Dudits Dénes, Heszky László

Agroinform Kiadó

1. fejezet - I. Bevezetés

1. fejezet - I. Bevezetés

1. A növényi biotechnológia és géntechnológia alapjai (Heszky L.)

1.1. Fogalma

A növényi biotechnológia és különösen a növényi géntechnológia nemzetközileg is új fogalomnak tekinthető, melyet sokféleképpen értelmeznek, ezért pontos és egyértelmű definíciója rendkívül fontos.

A klasszikus biotechnológia vagy biológiai technológia „olyan gyártási eljárást jelent, melyben valamilyen élő szervezet vagy annak alkotórészei (pl. enzimek) végzik a termék előállítását”. E megfogalmazásból azonnal kitűnik, hogy ezt műszaki aspektusból értékelték, tehát olyan ipari gyártási eljárásokat neveztek biotechnológiának, melyben bizonyos lépéseket mikroorganizmusok vagy enzimek végeznek. Mivel ezek az iparágak (gyógyszeripar, élelmiszeripar stb.), illetve a takarmánytartósítás viszonylag régen kialakultak, a biotechnológia fogalmát kizárólagosan e területeken használták a 70-es évek végéig. Ezek a zömében mikrobiális fermentációra, erjesztésre stb. alapozott technológiák – nem lebecsülve gazdasági jelentőségüket – a hagyományos vagy klasszikus biotechnológiának tekintendők.

Az új és hagyományos biotechnológia között a határvonalat a genetikai módosítás jelenti.

Az új biotechnológiai eljárásokban tehát az ember által bizonyos célból megváltoztatott, genetikailag módosított élő szervezetek vesznek részt. Ezek az élő szervezetek pedig már a mikroorganizmusokon kívül lehetnek növényi vagy állati sejtek, sőt növények, vagy állatok is. Az új biotechnológiai technikák gyors elterjedése a kutatásban és egyre növekvő gazdasági jelentősége szükségessé tette a 80-as évek elején a biotechnológia fogalmának módosítását.

Az újra csak műszaki szempontból megfogalmazott nemzetközi nómenklatúra szerint az új biotechnológia: „a biokémia, a mikrobiológia és a műszaki tudományok olyan integrált alkalmazása, amelynek célja a mikroorganizmusok, tenyésztett növényi, állati sejtek vagy azok valamely részének technológiai felhasználása”. E megfogalmazás ugyan jelentett valamilyen előrelépést, azonban bonyolult, hiányos és nehezen értelmezhető a mezőgazdaság oldaláról.

A növényi biotechnológia: a növények, növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai programjának megváltoztatását és az így kialakított új képességeik technológiai felhasználását jelenti.

A növényi biotechnológia tehát az új biotechnológiák közé tartozik és két fő lépésből áll. Az elsőben új tulajdonságokkal rendelkező egyedeket (sejt vagy növény) állítunk elő, melyeket a második lépésben a gyakorlatban használunk fel. A gyakorlat a növényi biotechnológia esetében a növénynemesítést, a növényvédelmet és a szaporítóanyag-előállítást, illetve a növénytermesztési technológiákat jelenti.

A növényi biotechnológia végeredményben nem tekinthető önálló diszciplínának, hanem különböző tudományok, tudományterületek eredményeit szintetizáló, módszereit gyakorlati cél érdekében komplexen felhasználó, új tudományos és gazdaságfejlesztési irányzatnak.

A fogalomban jelzett két lépés összhangban van magának a biotechnológiának, mint szónak az összetéte-lével is. A növényi biotechnológia fogalmának első lépésében jelzett genetikai módosítás jelenti tulajdonképpen a „bio” oldalt. Azokat a kísérletes biológiai diszciplínákat, amelyek elméleti eredményeinek és módszereinek alkalmazásával új értékek hozhatók létre. Ezek három csoportba sorolhatók: a szaporodás biotechnológiája, szomatikus sejtgenetika és géntechnológia.

A szaporodás (reprodukció) biotechnológiája: a növények ivaros (szexuális) és ivartalan (aszexuális) szaporodásának módosítását jelenti a növényi sejtek, szövetek, vagy szervek in vitro tenyészeteiben.

A szomatikus sejtgenetika a növényi sejtek genetikai programjának megváltoztatását jelenti, közvetve sejtszintű manipulációval, sejt- és protoplaszttenyészetekben.

A géntechnológia a növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai programjának megváltoztatását jelenti, molekuláris genetikai módszerekkel.

A géntechnológia tehát része a növénybiotechnológiának. Tudományos és gazdasági jelentősége azonban felülmúlja a másik két megközelítést.

A hazai és nemzetközi törvényi szabályozásnak megfelelően csak a géntechnológiával megváltoztatott sejtek és növények tekintendők genetikailag módosítottnak, azaz GM-nek.

A GM növények (géntechnológiával módosított növények, transzgénikus növények, transzformáns növények stb.) tehát azok, melyek sejtmagjába (genomjába), a géntechnológia molekuláris módszereivel idegen gént (transzgén) juttatnak be és az integrálódik, működik és öröklődik.

A transzgénikus növények, illetve fajták (GM fajták) tehát abban különböznek a hagyományostól, hogy a növény minden sejtje sejtmagjában általában egy vagy több transzgént és citoplazmájában ezekről a génekről szintetizálódott fehérjéket tartalmaz.

A fentiek alapján egyértelmű a különbség a növényi biotechnológia és a hagyományos biotechnológia között, valamint az újabb biológiai eljárások (pl. biotermesztés, biokert, biohumusz stb.), illetve a bioaktív anyagokat (serkentők és gátlók) felhasználó technoló-giák között. Erre a megkülönböztetésre rendkívül nagy szükség van, mert a növényi biotechnológia végül is nem a már ismert és más fogalmakkal bevezetett eljárások átkeresztelése, hanem minőségileg újat, új piacot és értéket teremtő molekuláris és sejtgenetikai, valamint sejt- és szövettenyésztési eljárások, illetve azok eredményeit felhasználó technológiák összessége.

E könyv következő fejezeteiben a sejt- és szövettenyésztés, valamint a sejt- és molekuláris genetikai módszereket, azok fejlesztési lehetőségeit, eredményeit és gazdasági jelentőségét ismertetjük, három fő egységben (szaporodás biotechnológiája, szomatikus sejtgenetika és géntechnológia), utalva a technológiai vonatkozásra ott, ahol ez már napjainkban is lehetséges.

1.2. Tárgya

A növénybiotechnológiának biológiai oldalról két meghatározó eleme van: az első a genetikai módosítás, a második a növényi sejt. Ebből logikusan következik, hogy a növényi biotechnológia tárgya nem lehet más, mint a növények örökítő anyaga (DNS), illetve az azt hordozó legkisebb totipotens élő egysége, a növényi sejt.

A növényi biotechnológia központjában tehát a sejt (ivarsejt, szomatikus sejt) áll, függetlenül attól, hogy a genetikai manipulációt molekuláris, sejt- vagy egyedszintű megközelítéssel végezzük. Ennek oka, hogy a sejt a növénynek az a legkisebb része, amelynek teljes genetikai információkészlete van, tehát totipotens. Másképpen fogalmazva nem ismerünk olyan, a sejtnél kisebb egységet, amelyből intakt növényt lehetne regenerálni. Ebből az következik, hogy molekuláris megközelítés (géntechnológia) esetén is sejtszintű molekuláris transzformációra van szükség ahhoz, hogy a transzgén integrációját – az in vitro rekombinációt – követően genetikailag módosított növényt kaphassunk. Ebből logikusan következik, hogy a GM sejtből regenerált GM növény minden sejtje tartalmazni fogja a transzgént.

Kép

1/1. ábra: A növényi sejt (A) és az abból izolált protoplaszt (B) sematikus ábrázolása, különös tekintettel az örökítő vagy genetikaianyag lokalizációjára

Biotechnológiai szempontból a növényi sejt (1/1. ábra) néhány specialitással rendelkezik. Először is a szilárd, általában másodlagosan vastagodott sejtfala tűnik szembe, amely – az állati sejttel szemben – nehezíti idegen információt hordozó molekulák, sejtorganellumok bejuttatását. Enzimkezeléssel eltávolítva a sejtfalat, sejtfal nélküli növényi sejteket, úgynevezett protoplasztokat kapunk (1/1. ábra), melyek ideális objektumai a genetikai beavatkozásnak.

A DNS legnagyobb része (90–99%) a kettős hártyával, membránnal határolt sejtmagbantalálható. A DNS szerkezete lineáris és az eukariótákra jellemző szerveződést mutat. Hosszúsága néhány centimétertől néhány méterig terjed. A genom mérete megközelítőleg 1 x 108 és 10 x 1010 bázispár között változik, ami 0,07–100 pg értéknek felel meg. A kultúrnövények genomjának mérete elérheti, sőt jelentősen meghaladhatja az emberi genomét (3 x 109). Ennek oka részben a poliploidia, részben az ismétlődő (repetitív) szekvenciák nagy aránya (25–95%). A genomiális DNS kromoszómákba csomagolva található a sejtmagban, melyek száma általában 2n = 10–48 között van (1/2. ábra).

Kép

1/2. ábra: A növények minden sejtje a sejtmagban tartalmazza a teljes genomot, melynek hosszúsága fajonként jelentős eltérést mutat

A gének száma 30–50 ezerre tehető. A növényi genom analízisét az ún. Genom Projektek végzik. Céljuk a genomokban lévő genetikai információ megfejtése.

Az információt a DNS 4 építőelemének, a nukleotidoknak (A,T,G,C) sorrendje határozza meg. Az első lépésben – a DNS szekvenálás során – a különböző kultúrfajok genomiális DNS-ének nukleotid sorrendjét határozzák meg. Ez időigényes feladat, hiszen a kukorica genomja 3,9 milliárd (3,9 x 109), a búzáé 17 milliárd (1,7 x 1010) nukleotidból áll. A második lépésben kell majd a gének helyét meghatározni (térképezni) a láncban (funkcionális genomanalízis). Ami a szekvenálást illeti, a növények közül az Arabidopsis genomja, mely a legkisebb (1 x 108 bp) áll a legközelebb a befejezéshez, de előrehaladottnak tekinthető a kukorica és a rizs (1 x 109 bp) genomanalízise is.

A genetikai anyag 1–10%-a található a sejtorganellumokban, tehát a plasztiszokban (átlag 20–40 db/ sejt) és a mitokondriumokban (átlag 100–200 db/ sejt). Az organellum DNS prokarióta típusú és több, átlagosan 10–40 másolata található egy organellumban. Ennek következtében az organellum genom kópiáinak száma egy sejtben meghaladhatja az ezret, tehát az organellum DNS-nek ,,populációi” találhatók egy-egy növényi sejtben (1/1. táblázat).

Kép

A kloroplasztisz genom egy kópiájának átlagos mérete a kultúrnövények esetében 100–200 kb, amelyen 50–100 gén található.

A mitokondrium genom egy példányának mérete átlagosan 100–2500 kb. A kódolt fehérjék száma kevesebb vagy hasonló a kloroplasztiszéhoz.

Végeredményben a növény tulajdonságai részben a sejtmagban, részben az egyes organellumokban lévő DNS-ben kódoltak. Az utóbbiak az extrakromoszomális tulajdonságok hordozói, amelyek ún. anyai öröklésmenetet mutatnak.

A géntechnológiai módosításra tehát három egymástól elkülönült helyen, a sejtmag- (genom) DNS-ben, a plasztisz-DNS-ben, illetve a mitokondrium-DNS-ben kerülhet sor.

A növényi biotechnológia sikerének és alkalmazhatóságának másik elemét az a követelmény jelenti, hogy a genetikai módosítást követően a transzformált, fúzionált, szelektált stb. sejtekből növényeket lehessen felnevelni. Ennek lehetőségét a növényi sejt- és szövettenyésztésnek az utóbbi évtizedekben elért eredményei teremtették meg. A növényi sejt totipotenciája in vitro realizálásának lehetősége viszont szemléletmódosítást igényel (1/3. ábra).

Kép

1/3. ábra: A növényi biotechnológiaés a sejt-növény rendszer két alaptechnikája, a kallusztenyésztés (A és B) és a sejttenyésztés (C és D) A: kallusz szövet, mely differenciálatlan parenchima sejtekből áll; B: dohány növényregenerálás organogenezissel; C: sejtszuszpenzió, mely sejtaggregátumokból áll; D: sárgarépa növényregenerálás szomatikus embriógenezissel (Heszky L. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növén nemesítés Tanszék, Gödöllő)

A növénybiotechnológiában a sejt egyenlőnek tekinthető a növénnyel. Gyakorlatilag ez azt jelenti, hogy a növénybiotechnológus, amikor sejtekkel dolgozik, tulajdonképpen növénnyel dolgozik. A biotechnológia szempontjából a sejt azért tekinthető egyenlőnek a növénnyel, mert genetikai anyaga minden olyan információt tartalmaz, amely az intakt növényre jellemző, és a sejtekből in vitro növények regenerálhatók. A sejtszintű rendszer tehát elvben bármikor növényszintre hozható (1/4. ábra).

Kép

1/4. ábra: Biotechnológiai eredetű fajta előállításának sémája. A genetikai módosítás a kiválasztott növények in vitrotenyészeteiben történik. Ezt követően a kultúrákból (sejt, protoplaszt) növényeket kell regenerálni, majd szántóföldi kísérletekkel kell igazolni a genetikai módosítás növényszintű manifesztációját és stabil öröklődését. Ezt követően a genetikailag manipulált növények a klasszikus nemesítés, fajtaminősítés rendszereken keresztül válhatnak minősített fajtává, ami a növénytermesztési alkalmazás feltétele

1.3. Célja és gazdasági jelentŐsége

A növényi biotechnológia különböző tudományok eredményeit szintetizáló, azok módszereit piaci célok érdekében komplexen felhasználó, új tudományos és gazdaságfejlesztési irányzatként jellemezhető. Ebből a megközelítésből kiindulva a növényi biotechnológia célja nem lehet más, mint a növények genetikai információjának módosításával új, gazdaságilag értékes fajták, hibridek előállítása, valamint új növénytermesztési technikák, szabadalmak és technológiák kifejlesztése (1/5. ábra).

Kép

1/5. ábra: A géntechnológiai megközelítés lényege, hogy a gének megfelelő módosításával lehetővé teszi a kapcsolt fehérjék megváltoztatását úgy, hogy azokkal a kívánt fenotípus elérhető legyen

Gazdasági jelentősége miatt külön kell említenünk a géntechnológiát és az abban rejlő tudományos és gazdasági lehetőségeket. Elöljáróban piaci szempontból néhány alapvető kérdést kell tisztáznunk. A Földön élő valamennyi szervezet, így a növények összes tulajdonsága is, az örökítő anyagban, a DNS-ben (30–50 ezer génben) van kódolva (lásd előző pontban).

A gén fogalmát a géntechnológia szempontjából úgy definiálhatjuk, hogy a DNS azon szakasza, mely egy vagy több fehérje kódját és annak megnyilvánulásához szükséges regulációs szekvenciákat tartalmazza. Végeredményben a gén egy olyan programcsomagot jelent, mely – a tárolt információ szempontjából – szerkezeti és működési egységet alkot.

A növényi géntechnológia során tulajdonképpen ilyen programcsomagokat viszünk át a donor fajból a recipiens növénybe.

A transzgénikus növények tehát azok, melyek sejtmagjába (genomjába) – géntechnológiával – idegen gént (transzgén) juttatunk be és az integrálódik, működik és öröklődik.

A Földön az élet információja minden élőben többé-kevésbé azonos rendszer szerint van kódolva. Ezért a transzgén származhat vírusból, baktériumból, gombából, rovarból, állatból, sőt emberből is. Bárhonnan származik a gén, alapvető feltétel az, hogy azt a növényben működő szabályozó szekvenciákkal kell ellátnunk.

A GM növényfajta genetikailag tehát abban különbözik a hagyományos fajtától, hogy genomjában egy vagy több géntechnológiával kialakított „idegen gént” és citoplazmájában ezekről a génekről szintetizálódott egy vagy több új fehérjét tartalmaz. Ennek következtében a GM fajta néhány tulajdonságban eltér a hagyományos fajtáktól. Ezeknek a tulajdonságoknak azonban komoly termesztéstechnológiai, kereskedelmi és ipari értékük lehet.

Végül is a géntechnológia molekuláris eszköztára az emberiség kezébe adta azt a lehetőséget, hogy a növényfajokat olyan új tulajdonságokkal, képességekkel ruházza fel, melyek az adott fajban az evolúció során nem, vagy nem az ember által kívánt mennyiségben és minőségben alakulhattak ki. Ennek a lehetőségnek a kihasználására a világon az elmúlt évtizedben géntechnológiai verseny alakult ki a transzgénikus növényfajták XXI. században várható piacainak megszerzéséért. E verseny a globalizáció jegyében zajlik, mely során vegyipari konszernek fúzionálnak vagy vásárolnak fel biotechnológiai, illetve vetőmag vállalatokat. Ennek következtében – eddig nem ismert méretű – tőkekoncentráció jött, és jön létre a vetőmagiparban, mely évente dollármilliárdokat képes befektetni a gazdaságilag jelentős transzgénikus növények előállításába, a gének, eljárások, fajták, termékek, szabadalmi védelmébe és bevezetésébe az egész világon.

1.4. Módszereinek csoportosítása

A növényi biotechnológia mint diszciplína, tárgyának (növényi sejt) és céljának (genetikai módosítás) megfelelően három nagy egységre osztható. A csoportosítás alapelve az, hogy az örökítő anyagban közvetlenül vagy közvetve hozunk-e létre információváltozást. Ennek megfelelően a molekuláris szintű megközelítést a géntechnológia, a sejtszintű technikákat a szomatikus sejtgenetika, továbbá a szövet- és szervszintű módszereket a szaporodás biotechnológiája jelentik.

Géntechnológia

A géntechnológia az örökítő anyag közvetlen molekuláris módosítását teszi lehetővé. A molekuláris biológia, sejtgenetika és szövettenyésztés különböző módszereit alkalmazza, melyek lehetővé teszik: a/ az egyes tulajdonságokért felelős gének izolálását, jellemzését és felszaporítását (klónozását); aa/ a gazdaságilag jelentős gén olyan vektorba építését, mellyel lehetővé válhat a gén átvitele a recipiens sejtbe, biztosítja továbbá a genomba való integrációját és működését; aaa/ a genetikailag módosított sejtekből a kifejlett szervezet (transzgénikus növény) előállítását (regenerációját).

Szomatikus sejtgenetika

A géntechnológiával szemben ezeknek a technikáknak a tárgya nem közvetlenül az örökítő anyag, a DNS, hanem a sejt vagy a sejtorganellum. Ennek ellenére alkalmazásuk közvetve molekuláris szintű változásokat okoz a genomban, illetve a plazmonban. A sejtgenetika a protoplasztfúzióra alapozott szomatikus hibridizáció, cibridizáció, sejtszintű mutánsizolálás, szomaklonális variabilitás stb. különböző sejtszintű és sejttenyésztési módszereit alkalmazza.

A szaporodás biotechnikája

A genetikai módosítás az ivaros és ivartalan szaporodás laboratóriumi manipulációjával történik általában sejt-, szövet- és szervtenyészetekben. Módszerei a haploidia, az embriókultúra, az in vitro termékenyítés, a ginogenezis, a merisztémakultúra, a vegetatív mikroszaporítás, a szomatikus embriógenezis stb. E csoportba tartoznak azok a módszerek is, amelyek felhasználásakor a genetikai módosítással nem a megváltozást, hanem ellenkezőleg, a genetikai stabilitást, a homozigóta állapotot, a genetikai homogenitást kívánjuk elérni és azt változatlan formában fenntartani, valamint megőrizni, illetve felszaporítani.

Kép

1/6. ábra: A növényi biotechnológia és géntechnológia fontosabb területei, valamint módszerei

Az 1/6. és 1/7. ábrán az izolátum jellege szerinti, az irodalomban leggyakrabban használt csoportosítást mutatjuk be. Újabban a gyakorlati alkalmazás egyre jobban elkülönülő területei is bizonyos csoportosítást jelentenek (pl. növénynemesítési biotechnológia, növényvédelmi biotechnológia, vegetatív mikroszaporítás stb.). Sőt napjainkban növénycsoportok, illetve növényfajok szerinti elkülönülés is tapasztalható (gabonafélék biotechnológiája, burgonya biotechnológiája, erdészeti fajok biotechnológiája stb.). Végeredményben a növényi biotechnológia egyre bővülő ismeretei, széleskörű gyakorlati elterjedése egyre specializáltabb csoportosítást eredményez, de a genetikai módosítás szintje alapján történő hármas tagolódás minden esetben érvényesül.

Kép

1/7. ábra: A sejt- és szövettenyésztés fontosabb technikái. 1. In vitro ginogenezis: ovárium, ovulum izolálás táptalajra és növényregenerálás haploid sejtből. 2. In vitro termékenyítés: ovárium izolálás táptalajra, megtermékenyítés kémcsőben tömlőt hajtó pollennel, magfejlődés és csírázás. 3. Embriótenyésztés: proembriók fejlődésének fenntartása kémcsőben és növényregenerálás. 4. Vegetatív szaporítás: járulékos embriógenezis indukcióval. 5. Vegetatív szaporítás merisztématenyésztéssel: izolált merisztémacsúcsból járulékos merisztémák nevelése, feldarabolás növényregeneráció. 6. Kalluszkultúra: a növény osztódó kambiális szöveteiből kalluszindukció, majd növényregenerálás. 7. Protoplaszt tenyésztés: protoplasztok izolálása levél mezofillum sejtekből, növényregenerálás. 8. Szomatikus hibridek: izolált protoplasztok fúziója, növényregenerálás. 9. Portok, mikrospórakultúra: portokokban táptalajon a pollenből haploid növényregenerálás androgenezissel

Felhasznált és ajánlott irodalom

Altman, A. et al. eds. (1999): Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht–Boston–London.

Altman, A. ed. (1998): Agricultural Biotechnology. Marcel Dekker, Inc. New York–Basel–Hong-Kong.

Dudits D., Dohy J. szerk. (1998): Biotechnológia, lépéstartás Európával. MTA, Budapest.

Dudits D., Heszky L. (1990): Növényi biotechnológia. Mg. Kiadó, Budapest.

Heszky L. (1995): Növényi biotechnológia. Az Agrárgazdaság jövőképe. Agro 21. Füzetek 5, 37–56.

Maróti M. (1976): A növényi szövettenyésztés alapjai. Akadémiai Kiadó, Budapest.

Skjervold, H. (1989): Biotechnológia. Mg. Kiadó, Budapest.

A növényi biotechnológia története tulajdonképpen a növények sejt- és szövettenyésztésével kezdődik. Ismertetésekor csak a fejlődés fő vonulatát követjük nyomon, utalva a legfontosabb személyekre, eredményekre, megvilágítva néhány összefüggést. E fejezetben nem kívánunk az egyes technikák történetével és különböző fajokon való felhasználásával foglalkozni. Ezeket a könyv későbbi fejezeteiben az adott technika bemutatásakor részletezzük.

A növényi sejtek és szövetek tenyésztésének történetét – talán nem túlzás, – de 1838-ban kell indítanunk, amikor is két német kutató, a botanikus SCHLEIDEN és a biológus SCHWANN nyilvánosságra hozta sejtelméletét. A mi szempontunkból nem azon a megállapításukon van a hangsúly, hogy minden szervezetet sejtek, szövetek és szervek építenek fel, hanem azon, hogy a soksejtű szervezetek minden egyes differenciálódott sejtje valószínűleg megtartja mindazon ,,információt”, amely a kiinduló egyetlen sejtben, a megtermékenyített petesejtben jelen van.

Néhány évtizeddel később, a múlt század hetvenes éveiben WÖCHTING a keltike (Corydalis solida) gumójának vágásfelületén megfigyelt organizációval (levél- és gyökérfejlődés) in vitro kísérletesen bizonyította ezt a hipotézist. Tulajdonképpen már csak egy lépésnek tűnt a növényi szomatikus sejtek totipotenciájának in vitro bizonyítása. Ennek gondolatát elsőként az 1854-ben, a Mosonmagyaróváron született német HABERLANDT vetette fel 1902-ben.

Kép

Végeredményben tehát a századfordulón kezdődött a mai értelemben vett növényi sejt- és szövettenyésztés története (2/1. táblázat). Az elmúlt évszázad növényi biotechnológiával kapcsolatos eredményeit 3 fő szakaszra osztva mutatjuk be.

Az első, amely az 1940-es évek végéig tartott, a steril technika és a legalapvetőbb módszerek kidolgozásának időszaka volt. A másodikban, 1950–1980 között a különböző szervek, merisztémák, haploid és szomatikus sejtek, valamint protoplasztok totipotenciáját sikerült bizonyítani, mely utóbbi eredményekre alapozva, indult a növényi szomatikus sejtgenetika kialakulása. Ezt a harmadik szakasz követte 1980-tól, mely napjainkban is tart és a növényi géntechnológia forradalmi és látványos előretörését, sőt a GM növények köztermesztésbe kerülését eredményezte, a 90-es évek közepén.

2.1. A szövettenyésztés alapjainak megteremtése (1900–1950)

HABERLANDT 1902-ben közölt munkájában elsőként próbálkozott a növények vegetatív sejtjeinek tenyésztésével egyszerű táptalajon. Abból indult ki, hogy ha tényleg létezik a totipotencia, akkor megfelelő feltételek között olyan fejlődés tartható fenn, ami intakt növény kialakulásához vezet. Természetesen ennek bizonyítása – az akkori tenyésztési feltételek, táptalajok és a konkrét izolátum (epidermisz-, sztóma-, és szőrsejtek) miatt – neki még nem sikerülhetett. Ez azonban nem keserítette el és bízott abban, hogy egyszer valakinek sikerülni fog embriókat felnevelni a növények vegetatív sejtjeiből.

HABERLANDT-tal egyidőben, 1904-ben sikeres kísérleteket végzett HANNIG, retekembriókkal. A kipreparált embriók – ásványi sókat és szacharózt tartalmazó tápközegben – tovább folytatták fejlődésüket, s belőlük növényeket kapott. Nyilvánvalóvá vált, hogy a további kutatásokat nem a sejt-, hanem az egyedfejlődés előrehaladottabb szervezettségi szintjén kell folytatni, amelyet az embrió, illetve gyökér- és hajtásmerisztéma jelentett.

A HANNIG eredményes munkáját követő három évtized a növényi szövettenyésztés módszereinek megalapozó évtizedei voltak. LAIBACH 1925-ben képes volt táptalajon hibrid embriókat is életben tartani és belőlük hibrid növényeket felnevelni. A fejlődés fő vonalát azonban nem az embriók mesterséges felnevelése (embriótenyésztés vagy embriókultúra), hanem a szervkultúrák jelentették.

Az 1920-as évek elején Amerikában ROBBINS, Európában egy HABERLANDT-tanítvány, KOTTE sikerrel oldotta meg a gyökérmerisztémák növekedéséhez szükséges mesterséges feltételek kialakítását. A szervetlen sókat és glükózt tartalmazó tápoldatban az izolált borsó- és kukorica-gyökércsúcsok intenzíven növekedtek és elágazó gyökérré fejlődtek. Folyamatos tenyésztésüket azonban a tenyészetek algás, bakteriális és gombás fertőződései megakadályozták.

Ezek a tapasztalatok vezettek el a mai értelemben vett steril szövettenyésztési módszerek kidolgozásához. Nyilvánvalóvá vált ugyanis, hogy a növényi szövetek, szervek mesterséges tenyésztése más táptalajokat és más feltételeket kíván, mint az akkoriban példának tartott állati szövettenyésztés. Teljesen steril (csíramentes) feltételek nélkül az izolált növényi részek tartós tenyésztése megoldhatatlan. Az új módszerek kidolgozását végül is siker koronázta és ezzel elérkeztünk az 1930-as évek végéhez.

A harmincas években két szövettenyésztési iskola hívta fel magára a figyelmet, az egyik White körül az USA-ban, a másik Gautheret körül Franciaországban. Talán nem tévedünk, ha a mai értelemben vett szövettenyésztés kezdetét e két csoport munkásságától számítjuk. White 1932-ben már sikerrel tenyésztett ovulumokat. A fejlődés szempontjából azonban sokkal fontosabb volt 1934-es vizsgálata, amikor paradicsom- (Lycopersicon esculentum) gyökércsúcsból indított gyökértenyészetben szervetlen sókat, szacharózt és élesztőkivonatot tartalmazó – mely utóbbit később B-vitaminokkal helyettesített – folyékony táptalajban teremtette meg a folyamatos tenyésztés feltételeit. E munka lett a későbbi szervtenyészetek (levél, hajtás, virág) kiindulópontja is. A sikeres paradicsom gyökértenyészet – amelyet 7 naponta kellett az oldalgyökerekről átoltani, és amely White 1968-ban bekövetkező halálakor már 1726 passzálást ért meg – tekinthető a korlátlan idejű növényi szövettenyészetek első állomásának.

Közben Gautheret elsőként indukált kalluszt in vitro és a szintén francia Nobécourt-ral együtt 1939-ben kidolgozott egy hathetente folyamatosan átoltható, jól osztódó sárgarépa kalluszkultúrát. A módszer kidolgozásakor a kor legújabb kutatási eredményeit használta, a táptalajt agarral szilárdította és White-féle vitaminokkal (tiamin, piridoxin, niacin) egészítette ki, továbbá felhasználta az 1937-ben Went és THIMANN által felfedezett auxint, az indolecetsavat (IES) is.

White szintén 1939-ben számolt be a Nicotiana glauca és N. langsdorffii keresztezéséből származó hibridből indított, folyamatosan növekvő kalluszról. A kallusz az in vitro tenyésztett differenciálatlan, folyamatosan osztódó növényi sejtek tömege. E két növény, a dohány és a sárgarépa, valamint in vitro tenyészeteik azóta a növényi sejt- és szövettenyésztési alapkutatások gyakran használt tesztobjektumaivá váltak.

Most egy pillanatra térjünk vissza Haberlandt posztulátumára. A kutatóknak tehát 1939-ben sikerült, ha nem is izolált egyes sejteket, de sejtek tömegét mesterséges feltételek között életben tartani, növekedésük és osztódásuk feltételeit biztosítani. A következő lépéshez, a totipotencia in vitro bizonyításához azonban még további felfedezésekre volt szükség és csak 20 évvel később sikerült.

2.2. A tenyésztett sejtek totipotenciájának bizonyítása és a szomatikus sejtgenetika kialakulása (1950–1980)

Van Overbeek, Conklin és Steward az embriókultúrákban tesztelt kókuszdiótejjel és az időközben szintetikusan előállított auxinnal – a 2,4-D-vel (2,4-diklórfenoxi-ecetsav) – képesek voltak kalluszt indukálni a már differenciálódott sejtekből is. Ezek a kísérletek új növényi növekedési hormoncsoport, a citokininek felfedezésén keresztül a totipotencia in vitro bizonyításához vezettek.

Elérkeztünk egy újabb jelentős név, Skoog (USA) munkásságához. Skoog megállapította, hogy a dohánykallusz in vitro fejlődését a heringspermából kivont friss DNS nem befolyásolja, viszont bizonyos idő után („régi minta”) serkenti. A friss DNS aktiválható volt autoklávozással, enyhén savas közegben. Egy évvel később sikerült izolálni az osztódás serkentéséért felelős vegyületet, amelyet Skoog 6-furfurilamino-purinként határozott meg és kinetinnek nevezett el. A kés–bbi kutatások igazolták, hogy a citokininek a növények természetes növekedésszabályzó anyagai, és a zeatin volt az első citokinin, amit növényből sikerült izolálni.

 Az auxinok és a citokininek használata a táptalajban már bizonyos organizációt eredményezett a kalluszban. Elsőként White és Nobécourt figyelt meg véletlenszerű gyökér- és hajtásdifferenciálódást a tenyésztett kalluszban.

Skoog egyik munkatársával, Miller-rel 1957-ben számolt be – a ma már klasszikussá vált – kísérletéről, a dohánykallusz hajtás- és gyökérregenerációjának hormonális szabályzásáról. Ennek lényege, hogy a kallusztenyésztéshez szükséges optimális auxin-kinetin arány csökkentésével hajtásfejlődés, növelésével pedig gyökérfejlődés indukálható.

E munka alapján napjainkig számos más faj esetében is sikerült a növényregeneráció tenyésztett sejtekből, bár bebizonyosodott, hogy a fajok többségénél a morfogenezis indukciója sokkal bonyolultabb, mint az első látásra Skoog kísérletéből következett.

 Skoog professzornál és iskolájánál maradva feltétlenül említést kell tennünk az indiai származású Murashige kollégájával dohánykalluszon 1962-ben kidolgozott – de azóta szinte minden növényfajnál széles körben használt – táptalajáról, az MS-táptalajról. Az MS alaptáptalajon és módosított változatain érték el a kutatók azokat az eredményeket, amelyek a növényi szövettenyésztés utolsó, csaknem három évtizedét fémjelzik.

Visszatérve azonban Haberlandt gondolatához, tehát az ötvenes évek második felére sikerült a kalluszsejtek totipotenciáját in vitro bizonyítani. A kutatók azonban nem rendelkeztek olyan módszerekkel, amelyek izolált egyedi (single) sejtek tenyésztését tették volna lehetővé. Az első lépéseket ebbe az irányba Hildebrandt munkatársai tették. 1954-ben sikerült kalluszból folyékony táptalajban olyan sejtszuszpenziót létrehozniuk, amely különálló sejtekből és néhány sejtes aggregátumokból állt. Az első folyamatosan fenntartható sejtszuszpenzióról NICKELL 1956-ban számolt be, objektuma a bab (Phaseolus vulgaris) volt.

A szuszpenziós kultúrák módszertanát Melchers és Bergmann 1959-ben tökéletesítette. Ez azóta sem sokat változott.

A szuszpenziós kultúrák tehát részben már egyedi sejtek tenyészetét jelentették. Az ötvenes évek végén és a hatvanas évek elején ezek totipotenciáját is sikerült bizonyítani. A növényregeneráció azonban a dohányon megfigyelt szervdifferenciálódás helyett egy új ontogenetikai utat követett, az embriógenezist.

A berlini Reinert és a New York-i Steward munkássága nyomán (1958) vált ismertté a szomatikus embriógenezis, amely a sárgarépa sejtszuszpenzió egyedi sejtjeiből indult. Steward a Cornell Egyetemen az 1960-as évek közepén csaknem százezer embriót kapott egy lombikban, miután enzimes kezeléssel egy fejlődő sárgarépa embriót sejtjeire bontott, majd a különálló sejtekben indukálta az embriógenezist. E munka már ténylegesen megfelelt Haberlandt posztulátumának és – a zigótához hasonló embriógenezissel – bizonyította a tenyésztett egyedi sejtek totipotenciáját. Ez a sejtszintű klónozás alapja, amelyet Taylor a világszerte ismertté vált ,,Biológiai pokolgép” c. könyve kiinduló gondolataként használt 1968-ban.

Ezek az eredmények azonban a szomatikus vagy testi (diploid 2n) sejtek totipotenciáját bizonyították. A haploid (n) ivarsejtek kipreparálása és tenyésztése – az állatoktól eltérően – a növényeknél rutinszerűen még nem volt megoldott. Ezért a tenyésztést magával az ivarszervvel együtt végezték.

Portokkultúrából haploid növényeket először a hatvanas évek közepén a Delhi Egyetemen az indiai MahesHwari körül csoportosuló fiatal kutatóknak sikerült regenerálniuk 1965-ben. A tesztnövény a Datura volt. Eredményüket 1968-ban sikerrel ismételte meg a francia Nitsch dohányon és a japán Ono rizsen. Azóta több száz faj pollenhaploid alakjait állították elő a világon.

Végeredményben az ötvenes és hatvanas évek gyors fellendüléssel jellemezhetők a növényi szövettenyésztés történetében, aminek során a növényregeneráció feltételeit sikerült megteremteni. Erre az időszakra tehető – a gyakorlati szempontból is rendkívül jelentős technika – a merisztématenyésztésre alapozott vegetatív mikroszaporítás kidolgozása is. Ezt azonban megelőzte a különböző szervek sikeres in vitro tenyésztése (2/2. táblázat).

Kép

Lehetővé vált 1945-ben az izolált hajtások (Loo); 1947-ben a merisztémák (MoReL); 1951-ben az ováriumok (Nitsch); 1957-ben pedig a levelek (Steeves) tenyésztése, sőt 1960-ban az in vitro termékenyítés (Kanta) is.

A francia Morel vírusmentesítési kutatásai során – amelyeket különböző Orchidea fajok merisztémáival 1947-től folytatott – 1960-ban a Cymbidium nemzetségben az izolált hajtáscsúcson járulékos merisztéma fejlődést figyelt meg. Az in vitro csírázó orchidea magvakon fejlődő protokormokhoz hasonló járulékos merisztéma differenciálódáson alapuló mikroszaporítási eljárását 1965-ben ismertette. A módszer azóta a világon széles körben elterjedt, és ma már közel egy milliárdra tehető évente az e módszerrel előállított növények száma (2/2. táblázat).

 A hatvanas évek végére tehát a szövettenyésztés fontosabb tesztnövényei esetében (dohány, sárgarépa, rizs, árpa stb.) készen állt a növény–sejt–növény rendszer arra, hogy a kutatók az egyedszintű genetikai és élettani kutatásokat a sejtszintre is kiterjeszthessék.

A sejtszintű genetikai kutatásokat – az állati sejtekkel ellentétben – a növényeknél a kemény poliszacharid sejtfal gátolja, illetve nehezíti. Ezért már a hatvanas években elkezdődtek a kutatások sejtfalnélküli növényi sejtek, az ún. protoplasztok előállítására. Cocking elsőként tenyésztett protoplasztokat 1960-ban, melyeket a paradicsom gyökércsúcs sejtjeiből celluláz enzim segítségével izolált. Növényt azonban csak 10 évvel később, 1971-ben sikerült regenerálniuk Nagata és Takebe japán kutatóknak. Felfedezésüket követően csak egy évet kellett várni az első szomatikus hibridre.

Carlson az USA-ban, munkatársaival 1972-ben sikerrel fúzionáltatta a Nicotiana glauca és a N. langsdorffii protoplasztjait és a hibrid sejtekből sikerült növényt is regenerálnia. Az első szomatikus nemzetséghibridet Melchers munkatársaival 1978-ban állította elő a burgonya (Solanum tuberosum) és a paradicsom (Lycopersicon esculentum) protoplasztjainak fúziójával. Eredménye nagy feltűnést keltett és nagy publicitást kapott, főleg a nem szakmai sajtóban. A lakosságban számos téves elképzelés és túlzott elvárás alakult ki a növényi biotechnológia gyakorlati lehetőségeivel kapcsolatban. Természetesen az azóta eltelt időszak alatt számos fajból izoláltak protoplasztokat, regeneráltak növényt és állítottak elő szomatikus hibrideket. A távoli szomatikus hibridizáció igen ígéretes és gyakorlati eredményekkel is biztató módja az aszimmetrikus hibridizáció, amellyel az első nemzetséghibridet Dudits és munkatársai 1980-ban állították elő.

A protoplasztfúzióra alapozott szomatikus hibridizáció szükségessé tette és felgyorsította a mutáns sejtvonalak in vitro izolálását, amelyre Melchers 1959-es eredményeivel már felhívta a figyelmet. Binding sztreptomicinrezisztens petúnia kalluszokat, Carlson pedig auxotróf dohány sejtvonalakat állított elő. A hetvenes évek elején Maliga és munkatársai regenerálták az első mutáns növényt, sztreptomicinrezisztens dohányszövetekből. Napjainkig több száz spontán és indukált mutánst szelektáltak, illetve írtak le.

 A protoplasztfúzió azonban lehetőséget ad arra is, hogy a sejtmagtól függetlenül csak a citoplazmát hibridizáljuk, illetve cseréljük ki a fúziós termékekben, amelyekből ún. cibrid sejteket, illetve növényeket kaphatunk. Ezek a módszertani lehetőségek és eredmények a hetvenes évek közepétől GALUN és MALIGA munkásságának eredményeként az ún. növényi extrakromoszomális genetika fellendülését, és sikeres kloroplasztisz- és mitokondrium-transzferhez, valamint -rekombinációhoz vezettek.

A sejtfúzióra alapozott genetikai információátvitel tökéletesítését jelentették azok a kutatások, amelyek már az izolált organellumok átvitelére irányultak. Izolált sejtmagokat elsőként Potrykus 1973-ban Svájcban, kloroplasztiszokat Davey és munkatársai Angliában, kromoszómákat Szabados és munkatársai 1981-ben hazánkban voltak képesek protoplasztokba átvinni.

A mutáns sejtek, illetve növények in vitro szelekciója már a hetvenes években felhívta a figyelmet a tenyésztett sejtek genetikai instabilitására. Először ezt a tényt a szövettenyésztés hátrányaként értékelték. A módszerek gyakorlati alkalmazása szempontjából Larkin és Scowcroft ausztrál kutatók a jelenséget a meglévő természetes variabilitást növelő új módszerként értelmezték. A szomaklonális variabilitás létezéséről és annak genetikai magyarázatáról azonban még napjainkban is sok vita van a kutatók között. A növénynemesítők azonban egyre szélesebb körben alkalmazzák a genetikai variabilitás új forrásaként.

2.3. A növényi géntechnológia kialakulása és felhasználása (1980-tól)

A nyolcvanas években gyors előrehaladás volt tapasztalható a növényi sejtfermentáció területén. Hatóanyagok kinyerésének gondolata sejttenyészetekből már a hatvanas években felmerült. Az 1970-es években azonban csak néhány sejttenyészetben észlelték a kívánt hatóanyag szintézisét. A nyolcvanas évek közepére már legalább 50 sejttenyészet rendszer vált ismertté, amelyekkel speciális anyagcseretermékeket lehetett előállítani. Az ipari méretű fermentálás elsőként a japánoknak sikerült. A Mitsui cég kétlépcsős eljárást dolgozott ki és vezetett be a Lithospermum erytrorhizon tenyésztésével, a színezékként és gyógyszerként is használható sikonin előállítására.

Megkezdődött a vegetatív mikroszaporítás automatizálása, megjelentek az első fajták (rizs, búza, repce), amelyeknek nemesítésében biotechnológiai módszereket (androgenezis, szomaklón) is alkalmaztak. A biotechnológia és ezen belül a növényi biotechnológia a nemzetgazdaságok, a gazdaságfejlesztési programok és stratégiák részévé vált.

A növényi biotechnológia története harmadik szakaszának meghatározó területe azonban a növényi géntechnológia. Az első kísérleti eredményekről a kutatók 1979-ben Edinburgh-ban számoltak be. Ezen a konferencián már körvonalazódtak a molekuláris növénygenetikai kutatások fő irányai. Megindult a növényi genom molekuláris szerveződésének analízise, növényi gének izolálása. A nyolcvanas évek elején már intenzíven folytak a kutatások a Ti-plazmidokra épülő transzformációs rendszerek kifejlesztésére is.

Az első transzgénikus növényekről (dohány) 1983– 84-ben egyidőben több kutatócsoport is (FRALEY és mtsai, HORSCH és mtsai, DE BLOCK és mtsai) beszámolt. Ezekben az években tökéletesítették a transzformációs technikát is (bináris vektor, marker gén stb.).

Az igazi áttörést az 1986-os év jelentette, amikor a Science és a Nature hasábjain szinte egyidőben számoltak be vírus- (POWEL és mtsai, BAULCOMBE és mtsai), rovar- (VAECK és mtsai) és herbicidrezisztens (SHAH és mtsai) GM növények sikeres előállításáról. Ezt követően 1986-tól először az USA-ban, később 1988-tól Európában is elkezdődtek a GM növények első szántóföldi kísérleti kipróbálásai.

Az első transzgénikus növény 1994-ben került forgalomba. A GM növényfajták termőterülete a 90-es évek végén – főleg az amerikai kontinensen – már elérte a több tízmillió hektárt.

A GM növények előállítása és felhasználása gyors karriert futott be az elmúlt 15 évben. Tudományos szempontból e rövid időszak alatt rendkívül sokféle transzgénikus növényt állítottak elő és szinte követhetetlen a különböző molekuláris stratégiák, valamint megközelítések változatossága.

A napjainkig előállított gazdaságilag is jelentős transzgénikus növények három nagy csoportba sorolhatók:

Az első generációs transzgénikus növények esetében a cél a mezőgazdasági termelés segítése volt. A konkrét genetikai módosítások céljait a biotikus stressz (vírus, gomba, baktérium, rovar) rezisztencia, illetve az abiotikus stressz (herbicid) rezisztencia kialakítása jelentették. Napjainkig tulajdonképpen rovarrezisztens és herbicidrezisztens növények azok, melyeket a legnagyobb területen termesztenek a világon. Különösen sikeresnek tekinthetők a GM fajták gyapot, szója, repce és kukorica fajok esetében. Az 1995–96-os bevezetésüket követően termőterületük az USA-ban és Kanadában, a nulláról 30–60%-ra emelkedett és nagyságrendjük több tízmillió hektárt ért el.

A zöld és környezetvédő mozgalmak ellenállása és aktivitása miatt az első generációs transzgénikus növényfajták elterjedése a világon azonban sok akadályba ütközött és ütközik. A kutatók és a multinacionális cégek figyelme ezért a zárt rendszerben – főleg ipari feldolgozás céljára – termelhető GM növények előállítása felé fordult, melyek már a második generációs transzgénikus növényeket jelentik.

A második generációs transzgénikus növények előállításakor a konkrét genetikai módosítások célja a növények anyagcseréjének (fehérje, zsírsav, szénhidrát stb.) és fejlődésének (érés, hímsterilitás stb.) módosítása volt. Ezek közül az anyagcseréjükben módosított paradicsom, repce és burgonya már köztermesztésbe kerültek. Terjedésük azonban lényegesen lassúbb, mint az első generációs GM növényfajtáké volt.

A harmadik generációs transzgénikus növények esetében a stratégiát speciális anyagok előállítása jelenti főleg ipari (gyógyszeripar, élelmiszeripar, műanyagipar stb.) felhasználásra. Köztermesztésbe kerülésük a 21. században várható.

2.4. Hazai története

2.4.1. A növényi biotechnológia pionírjai (1930–1980)

A hazai szövettenyésztési kutatások története kis jóindulattal egyidősnek tekinthető a növényi sejt és szövettenyésztés nemzetközi történetével, hiszen HabErlandt professzor Altenburgban, a mai Mosonmagyaróvárott született 1854-ben. Az in vivo szervdifferenciálódást karalábén Orsós Ottó már 1938-ban vizsgálta és oktatta. Az első ténylegesen in vitro vizsgálatokat GIMESI NÁNDOR és munkatársai végezték a Lilium portokjainak tenyésztésével.

Az ötvenes években, több kutatólaboratóriumban foglalkoztak szövettenyésztéssel. RÉDEl GYÖRGY 1955-ben, búzaembriók majd ováriumok in vitro tenyésztésével, MARÓTI MIHÁLY bab gyökér- és hajtáskultúrával, FALUDI BÉLA munkatársaival a burgonya kalluszkultúráival foglalkozott.

A három laboratórium közül azonban csak egy, a MARÓTI MIHÁLY által vezetett folytatta a szövettenyésztési kutatásokat az elkövetkező évtizedekben is. Így 1956–1970 között az ELTE Növényélettani Tanszékén, majd az ELTE Biológiai Állomásán végzett kutatások elévülhetetlen jelentőségre tettek szert a hazai növényi biotechnológia alapjainak megteremtésében. MARÓTI professzor vegetatív mikroszaporítási kutatásaira és oktatómunkájára alapozva létesültek az első üzemi (Óbuda Tsz, Sasad Tsz, Kertészeti Mgtsz, Szombathely és Rozmaring Tsz) mikroszaporító-laboratóriumok a hatvanas évek végén és a hetvenes évek elején az orchideák, a szegfű és a gerbera stb. szaporítására. Ő írta az első hazai szövettenyésztési jegyzetet (1972) és könyvet (1976) is.

A hatvanas évek utolsó és a hetvenes évek első felében több kutatólaboratórium is alakult, amelyek közül az Országos Agrobotanikai Intézetben HESZKY LÁSZLÓ által vezetett csoport az embriótenyésztésben, az androgenezisben és a genetikai tartalékok in vitro tárolásában, az MTA Genetikai Intézetében alakult, majd az MTA Szegedi Biológiai Központjába áttelepült, MALIGA Pál által vezetett csoport a mutáns szelekcióra és a protoplasztfúzióra alapult organellum átvitelben, az ELTE Genetikai Tanszékén KOVÁCS ERVIN által vezetett csoport a tenyésztett sejtek genetikai instabilitásában, valamint az MTA Szegedi Biológiai Központ Genetikai Intézetében DUDITS DÉNES csoportja a szomatikus hibridizációban ért el nemzetközileg is figyelemreméltó eredményeket.

A kertészeti növények közül a csonthéjas gyümölcsfajokkal a Kertészeti Kutatóintézetben, Budatétényben VÉRTESSY JUDIT, a bogyósgyümölcs-fajokkal a Fertődi Kutató Állomáson ZATYKÓ JÓZSEF és munkatársai, a gyógynövényfajokkal a SOTE Gyógynövény- és Farmakológiai Intézetében VERZÁRNÉ PETRI GIZELLA és SZőKE ÉVA végeztek úttörő jellegű munkát ebben az időszakban.

2.4.2. A növényi sejtgenetika és szövettenyésztés módszereinek alkalmazása (1980-tól)

Az alkalmazott biotechnológia kialakulásában fontos esemény volt a nyolcvanas évek elején a szövettenyésztési laboratóriumok megszervezése a két legjelentősebb, nemesítéssel foglalkozó hazai intézetünkben a Gabonatermesztési Kutató Intézetben Szegeden, (SÁGI FERENC, Mórocz Sándor, Pauk János és Purnhauser LászLó) és az MTA Mezőgazdasági Kutató Intézetében Martonvásárott (Barnabás Beáta, Kovács Géza, KARSAI ILDIKÓ és Galiba Gábor). Ma már mindkét intézetben a sikeres nemesítési munkát szolgálják ezek a laboratóriumok.

A 90-es években nemzetközi színvonalú eredményeket értek el Polgár Zsolt és munkatársai (1999) a Keszthelyi Egyetem Burgonyakutatási Osztályán a S.tuberosum x S.brevidens szomatikus hibridek jellemzésében, Zatykó József és munkatársai (1997) a Fertődi Gyümölcs és Dísznövénytermesztési Kutató Állomáson az in vitro nitrogénkötő szamóca előállításában, a Nyíregyházi Mezőgazdasági Kutató Intézetben Dobránszki Judit és munkatársai (1999) a burgonya in vitro gumóindukálásában. A szőlőbiotechnológia kifejlesztése HAYDU ZSOLT és munkatársai nevéhez fűződik Kecskeméten a Szőlészeti és Borászati Kutató Intézetben.

A Gödöllői MBK-ban Mitykó Judit-nak és munkatársainak (1995) a világon elsők között sikerült paprika androgenetikus haploidokat előállítani. Bánfalvi Zsófia csoportja (1996) a burgonyagumó abiotikus stressz-specifikus fehérjéinek azonosításában és izolálásában ért el nemzetközileg jegyzett eredményeket. FárI Miklós több szabadalommal és műszerrel gazdagította az in vitro technika eszköztárát, melyek közül a Propamatic és Clonmatic mikroszaporító automaták érdemelnek figyelmet. Az utóbbi berendezés Párizsban Moet-Henessy díjat is kapott.

Mórocz Sándor munkatársaival (1990) jól regeneráló kukorica sejt-protoplaszt-növény rendszert dolgozott ki, mely európai szabadalmat kapott és évekig egyetlen működőképes regenerációs rendszer volt a világon. Ugyan abban az intézetben (Gabonatermesztési Kutató Kht, Szeged) Pauk János munkatársaival (1997) állította elő az első magyar DH búzafajtát (Délibáb), Purnhauser László munkatársaival (1987) pedig bizonyította az ezüst ionok meghatározó szerepét az in vitro növényregenerációban, ami szintén nemzetközi szabadalom.

Az MTA Szegedi Biológiai Központban Dudits Dénes munkatársaival, Deák Máriá-val, Bögre László-val, Györgyey János-sal a lucerna szomatikus embriógenezis kísérleti rendszerét fejlesztették tovább. Ebben a laboratóriumban Fehér Attila és Preiszner Johanna a burgonya protoplasztrendszert használták Solanum tuberosum x S. brevidens szomatikus hibridek előállítására.

Nemzetközi szintű kutató csoport működik Barnabás Beáta (1999) irányításával a búza és kukorica ivaros folyamatainak biotechnikai módosításában, az izolált gamétái mikromanipulációjában, a pollen krioprezervációjában és az in vitro genom-duplikációs módszer kidolgozásában Martonvásárott az MTA Mg. Kutatóintézetében. Ugyanott Galiba Gábor, Sutka József (1997) a hidegtűrésekért és jarovizációért felelős géneket azonosított és térképezett búzában. Jámborné Benczúr Erzsébet munkatársaival (1997) különböző cserepes levél és virágos, valamint évelő dísznövények, díszfák mikroszaporítási technikáját dolgozta ki és oktatja a Kertészeti Egyetemen. A zöldségnövényekből G. Juhász Anikó és mtsai állítottak elő sikeres andro- és ginogenetikus haploidokat.

A GATE Genetika és Növénynemesítés tanszékén HESZKY LÁSZLÓ vezetésével a Növényi biotechnológia és Géntechnológia oktatására 1992-től nappali szakirányú képzés indult, emellett „Növénynemesítés genetikai és biotechnológiai módszerekkel” c. doktori program is szolgálja a növénybiotechnológus tudományos utánpótlás nevelését. Kutatási eredményeik közül figyelemreméltó az első magyar biotechnológiai úton előállított növényfajta (DAMA rizs 1992) állami elismerése, valamint a tenyésztett növényi sejtek sikeres krioprezervációja (JEKKEL ZS.), szomaklónok (GYULAI G.) továbbá az antiszensz transzgénikus alma, szegfű és paradicsom (KISS E.) és DH nyár (KISS J.) előállítása.

A fenti felsorolás közel sem teljes, de bizonyítja, hogy a hazai növényi biotechnológiai és géntechnológiai kutatások a század végén is nemzetközi színvonalon vannak.

2.4.3. A növényi géntechnológiai kutatások kezdete és az első eredmények

A rekombináns DNS-módszerek alapjainak kidolgozása mikroorganizmusokban történt, de már a hetvenes években általánossá vált a restrikciós endonukleázok, ligázok használata, génbankok készítése. Így természetes, hogy a növénybiológusok is éltek az új módszerek nyújtotta lehetőségekkel. 1979-ben került sor az első, növényi gének izolálásával foglalkozó tudományos rendezvény megszervezésére Edinburgh-ban. Ezzel egy teljesen új fejezet kezdődött a növények életjelenségeinek, funkcióinak kutatásában. Idehaza az első növényi génizolálási program elindítása Koncz Csaba nevéhez fűződik, aki frissen végzett biológusként az SZBK Genetikai Intézetében, Dudits Dénes csoportjában kezdett el dolgozni. Hosszabb vizsgálódás után a kukorica mitokondriumban található plazmid megklónozása fogalmazódott meg, mint érdekes kutatási téma, ami egyben alapot adhatott transzformációs vektor kifejlesztéséhez is. A plazmid jellemzéséről Koncz és mtsai közleménye 1981-ben jelent meg. A klónozási munkák lucerna cDNS-bank elkészítésével folytatódtak, amelyet Györgyey János szomatikus embriók felhasználásával hozott létre. Az első növényi gének, amelyeket Magyarországon izoláltak, lucerna hisztonfehérjéket kódoltak (WU és mtsai, 1988). Ehhez a genomikus génbankot Kiss Gy. Botond és mtsai készítették. A 90-es évek elején már intenzíven folytak a lucerna gének izolálására épülő kutatások. A sejtosztódás szabályozásában és a stresszválaszban szerepet játszó génekről jelentek meg az első közlemények (HIRT és mtsai, 1991; GYÖRGYEY és mtsai, 1991). Jelentős eredmény volt a lucerna genetikai térképének elkészítése, amelyhez számos molekuláris markert is felhasznált Kiss Gy. Botond és csoportja (KISS és mtsai, 1993). Nagy Ferenc amerikai tanulmányútja után az SZBK Növényélettani Intézetében folytatta a klorofill a/b kötőfehérjét (Cab1) kódoló gén promoterének részletes funkcionális vizsgálatát (FEJES és mtsai, 1990). Gödöllőn, a Mezőgazdasági Biotechnológiai Központban a burgonyagumó fejlődésével kapcsolatos gének sorában egy patatin cDNS klónozására került sor (BÁNFALVI és mtsai, 1994). A rekombináns DNS-technikák igen fontos szerepet kaptak a virológiai kutatásokban. Több növényi vírus szerkezetének feltárását tették lehetővé ezek a kutatások (BURGYÁN és mtsai, 1993; SALÁNKI és mtsai, 1994).

A hazai géntechnológiai kutatás és fejlesztés szempontjából igen jelentős eredmény volt az első, idegen gént hordozó növény előállítása. Deák Mária és mtsai 1986-ban közölték azt a cikket, amely beszámolt transzgénikus lucerna előállításáról. Az Agrobacterium-fertőzésre alapozott génbeépítés tárgya a kanamicin-rezisztenciáért felelős gén volt. Az idegen gén működését a transzformáns növényekben különböző molekuláris módszerekkel lehetett igazolni. Már agronómiai hasznosítási célja is volt annak a transzformációnak, amelynek során a burgonya X-vírus köpenyfehérjegén bevitelére került sor (FEHÉR és mtsai, 1992). A burgonya transzformánsok virológiai jellemzését Balázs Ervin végezte. Mérései szerint a transzformánsok kimutatható vírus-ellenállósággal rendelkeztek. Kukorica és repce transzformánsok előállítására is sor került Szegeden a Biológiai Központban. (OMIRULLEH és mtsai, 1993; STEFANOV és mtsai, 1994). A transzformációhoz szükséges metodikai háttér több intézetben is rendelkezésre áll. Génpuskával folyik a génbeépítés rizsbe, búzába, a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Központban és a szegedi Gabonatermesztési Kht-ben. A Jenes Barnabás által kifejlesztett génbelövési rendszer több hazai és külföldi laboratóriumban is felhasználásra került. Így többek között az MTA Mezőgazdasági Kutatóintézetben, Martonvásáron. Agrobacterium közvetítésével létrehozott burgonya Y-vírus rezisztens dohány növények (BALÁZS ERVIN, Mezőgazdasági Biotechnológiai Központ) vagy az etilén anyagcserében megváltoztatott szegfű (GATE Genetikai és Növénynemesítési Tanszék, Gödöllő) szabadföldi és üvegházi értékelése folyamatban van.

A géntechnológiai módszerekre épülő növénynemesítés eredményeinek hasznosítását az 1998. évi géntechnológiai törvény elfogadása nagymértékben elősegíti. Megalakult a Géntechnológiai Bizottság Venetianer Pál elnökletével. Balázs Ervin több nemzetközi bizottság munkájában vesz részt a biztonsági kérdések vizsgálata céljából.

Felhasznált és ajánlott irodalom

Bánfalvi Zs., A. Molnár, G. Molnár, L. Lakatos, L. Szabó (1996): Starch synthesis-, and tuber storage protein genes are differenctly expressed in Solanum tuberosum and in Solanum brevidens. FEBS Letters 383, 159–164.

BÁNFALVI, ZS., KOSTYÁL, ZS., BARTA, E. (1994): Solanum brevidens possesses a non-sucrose-inducible patatin gene. Mol. Gen. Genet., 245, 517–522.

Barnabás B. (1999): Biotechnology of reproductive processes in cereals. J. Plant Biotechnol. 1, 56–60.

BURGYÁN, J., TAVAZZA, M., DALMAY, T., LUCIOLI, A., BALÁZS, E. (1993): Consequences of gene transfer between distantly related tombusviruses. Gene, 129, 191–196.

Conger, B. V. (ed.) (1986): Cloning Agricultural Plants via in Vitro Techniques. CRC Press. Inc., Boca Raton, Florida

DEÁK M., KISS GY. B., KONCZ CS., DUDITS D. (1986): Transformation of Medicago by Agrobacterium mediated gene transfer. Plant Cell Rep., 5, 97–100.

Dobránszki J, K. M. Tábori, A. Ferenczy (1999): Light and genotypes effects on in vitro tuberization of potato plantlets. Potato Res. (in press)

Dudits D. (1982): Fuzionált sejtek. hibrid növények. Korunk tudománya sorozat. Akadémiai Kiadó, Budapest.

Dudits D., Maliga P., Farkas G. (szerk.) (1979): Növényi sejtgenetikai és szövettenyésztési módszerek alkalmazása. Akadémiai Kiadó, Budapest.

Dudits D., Heszky L. (1990): Növénybiotechnológia Mg. Kiadó, Budapest.

Dudits, D., BÖGRE, L. and GYÖRGYEY, J. (1991): Molecular and cellular approaches to the analysis of plant embryo development from somatic cells in vitro J. Cell Sci. 99, 473–482.

Evans, A. D., Sharp. R. W., Ammirato. P., Yamada,. Y, (eds.) (1983): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 1–4. McMillan Publ. Comp., New York.

FEHÉR, A., SKRYABIN, K. G., BALÁZS, E., PREISZNER, J., SHULGA, O. A., ZAKHARYEV, V. M., DUDITS, D. (1992): Expression of PVX coat protein gene under the control of extensin-gene promoter confers virus resistance on transgenic potato plants. Plant Cell Rep., 11, 48–52.

FEJES, E., PÁY, A., KANEVSKY, I., SZÉLL, M., ÁDÁM, É., KAY, S., NAGY, F. (1990): A 268 bp upstream sequence mediates the circadian clock-regulated transcription of the wheat Cab-1 gene in transgenic plants. Plant Mol. Biol., 15, 921–932.

Galiba G., I. Kerepesi, J. W. Snape, J. Sutka (1997): Location of a gene regulating cold induced carbohydrate production on chromosome 5A of wheat. Theor. Appl. Genet., 95, 265–270.

Gautheret, R.J. (1959): La culture des tissues végétaux techniques et réalisations. Masson, Paris.

GYÖRGYEY, J., GARTNER, A., NÉMETH, K., MAGYAR, Z., HIRT, H., HEBERLE-BORS, E., DUDITS, D. (1991): Alfalfa heat shock genes are differentially expressed during somatic embryogenesis. Plant Mol. Biol., 16, 999–1007.

Heszky L. (szerk.) (1982): A növényi szövettenyésztés és a gyakorlat szimpózium. Agrártudományi Közlemények 41, 203–262.

Heszky L., Dudits D. (szerk.). (1986): Növénybiotechnológia. in: Napjaink biotechnológiája sorozat, OMIKK OMFB. Budapest, 1–199.

Heszky L.E., Simon-Kiss I. (1992): ’DAMA’ the first plant variety of biotechnology origin in Hungary, registered in 1992. Hungarian Agricultural Res. 1, 30–32.

HIRT, H., PÁY, A., GYÖRGYEY, J., BAKÓ, L., NÉMETH, K., BÖGRE, L., SCHWEYEN, R. J., HEBERLE-BORS, E., DUDITS, D. (1991): Complementation of a yeast cell cycle mutant by an alfalfa cDNA encoding a protein kinase homologous to p34cdc2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1636–1640.

Jámbor-BenCzúr E., Batiz E., Imre Cs., Nagy T., Dlusztus M., Csillag A. (1997): In vitro culture of Microsorum punctatum ’Grandiceps’ investigation of the alternation of generations and induction of sprouts. Horticultural Sci., 29, 5–9.

KISS, G. B., CSANÁDI, G., KÁLMÁN, K., KALÓ, P., ÖKRÉSZ, L. (1993): Construction of a basic genetic map for alfalfa using RFLP, RAPD, isozyme and morphological markers. Mol. Gen. Genet., 238, 129–137.

KONCZ, CS., SÜMEGI, J., UDVARDY, A., RAMCSÁNY, M., DUDITS, D. (1981): Cloning of mtDNA fragments homologous to mithochondrial S2 plasmid-like DNA in maize. Mol. Gen. Genet., 183, 449–458.

Maróti M. (1976): A növényi szövettenyésztés alapjai. Akadémiai Kiadó. Budapest.

Mitykó J., A. Andrásfalvy, G. Csilléry and M. Fári (1995). Anther-culture response in different genotypes and F1 hybrids of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Breeding 114, 78–80.

Mórocz S, G. Donn, J. Németh, D. Dudits (1990): An improved system to obtain fertile regenerants via maize protoplasts isolated from a highly embryogenic suspension culture. Theor. Appl. Genet, 80, 721–726.

OMIRULLEH, S., ÁBRAHÁM, M., GOLOVKIN, M., STEFANOV, I., KARABAEV, M., MUSTÁRDY, L., MÓROCZ, S., DUDITS, D. (1993): Activity of a chimeric promoter with the doubled CaMV 35S enhancer element in protoplast-derived cells and transgenic plants in maize. Plant Mol. Biol., 21, 415–428.

Pauk J, Z. Kertész (1997): Production and evaluation of doubled haploid wheat lines. J. Appl.Genet. 28, 425–435.

Polgar Zs., S. M. Wielgus, S. Horvath, J. P. Helgeson (1999): DNA analysis of potato x Solanum brevidens somatic hybrid lines. Euphytica 105, 103–107.

Preininger É., J. Zatykó, P. Szűcs, P. Korányi, I. Gyurján (1997): In vitro establishment of nitrogen-fixing strawberry (Fragaria x Ananassa) via artificial symbiosis with Azomonas insignis. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 33, 190–194.

Purnhauser, L., Medgyesi P., Czakó M., Dix P. J., Mátzon L. (1987): Stimulation of shoot regenerating in Triticum aestivum and Nicotiana plumbaginifolia Viv tissue cultures using ethylene inhibitor AgNO3. Plant Cell Rep. 6, 1–4.

Reinert, J., Bajaj Y. P. S. (eds.) (1977): Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell Tissue and Organ Culture. Springer Verlag, Berlin.

SALÁNKI, K., BALÁZS, E., BURGYÁN, J. (1994): Nucleotide sequence and infectious in vitro transcripts of RNA 3 of tomato aspermy virus pepper isolate. Virus Res., 33, 281–289.

Sreet,.H. E. Dawey, M.R. (ed.) (1974): Tissue Culture and Plant Science. Acad. Press., London.

STEFANOV, I., FEKETE, S., BÖGRE, L., PAUK, J., DUDITS, D. (1994): Differential activity of the mannopine synthase and the CaMV 35S promoters during development of transgenic rapeseed plants. Plant Science, 95. 175–186.

Steward F. C., Mapes, M. O., Mears, K. (1958): Growth and organized development of cultured cells. II. Organization in cultures growth from freely suspended cells. Am. J. Bot. 45, 705–708.

Thorpe, T. A. (ed.) (1981): Plant Tissue Culture. Methods and Application in Agriculture. Academic Press, Inc., New York.

Vasil, I. K., Scowroft, W R., Frey K. J. (eds.) (1982): Plant Improvement and Somatic Cell Genetics. Academic Press. New York.

White, P. R. (1954): The Cultivation of Animal and Plant Cells. Ronald Press, New York.

WU, S. C., BÖGRE, L., VINCZE, E., KISS, GY. B., DUDITS, D. (1988): Isolation of an alfalfa histone H3 gene: structure and expression. Plant Molec. Biol., 11, 641–649.