Ugrás a tartalomhoz

Immunológia

Anna, Erdei, Gabriella, Sármay, József, Prechl (2012)

Medicina Könyvkiadó Zrt.

A B- és a T-limfociták antigénkötő receptorainak kialakulása

A B- és a T-limfociták antigénkötő receptorainak kialakulása

A B-sejt-receptorok (BCR), illetve a plazmasejtek által termelt immunglobulinok és a T-sejt-receptorok (TCR) közös tulajdonsága, hogy a környezetükben lévő antigéneket képesek specifikusan felismerni, és megkötni. A limfocitarepertoár minden tagja más-más antigénkötő receptort fejez ki, amelyek egyediségét a molekula antigénkötő, N-terminális régiója biztosítja. A szervezetben jelenlévő milliárdnyi különböző specificitású limfocita összességében biztosítja az egyénnek azt a képességét, hogy az antigének óriási sokféleségét képesek felismerni. A BCR rendkívüli variabilitását az Ig-molekula N-terminális szakasza (V-régiója, lásd 9. fejezet) biztosítja; amihez kapcsolódik a konstans régió (C-régió), amely az effektor funkciókért felelős. Ez utóbbi régió állandósága indokolt, hiszen a szervezetben mindig azonos struktúrákhoz, receptorokhoz vagy adapter molekulához kell, hogy kapcsolódjon. A variábilis részt érintő hatalmas repertoár kialakulásának magyarázata sokáig váratott magára, és a „megoldás” nemcsak az immunológusokat, de a genetikusokat is meglepte.

Többek között az Ig-gének működésének megismerése vezetett ahhoz, hogy a Beadle és Tatum által 1941-ben megfogalmazott alaptételt, miszerint egy polipeptidláncot egyetlen gén kódol – legalábbis az eukarióta szervezetekben – felül kellett vizsgálni. Dreyer és Bennett már 1965-ben felvetette, hogy minden ellenanyag-molekulát legalább két gén kódol: az egyik a variábilis, a másik a konstans molekularészt, és ezek a gének DNS-szinten kombinálódva hozzák létre a fehérjét kódoló mRNS-molekulát. E teória több mint egy évtizeddel később igazolódott, amikor kiderült, hogy egyes sejtek differenciálódásakor bizonyos fehérjék expressziója során különböző, a csírasejtekben (germline) még egymástól távol lévő génszakaszok kapcsolódnak össze. Az ily módon – „génrekombinációval” – létrejött egységekről készül az mRNS, amelyről a riboszómák felszínén a polipeptidlánc keletkezik. Ezt a jelenséget mutatta ki Tonegawa és munkacsoportja a B-sejtek őssejtekből történő érése során, vagyis még mielőtt a sejtek antigénnel találkoznak. E mechanizmus ismeretében értelmezhetővé vált az immunglobulinok nagyfokú variabilitása, más szóval genetikai diverzitása. Felfedezésüket 1974-ben közölték, majd 1987-ben orvosi Nobel díjjal jutalmazták. Hamarosan hasonló bizonyítékok láttak napvilágot a TCR-génekre és termékeikre vonatkozóan is.

Az immunglobulin gének genomikus szerveződése

Az emberi csírasejtekben az immunglobulin nehézláncait és két könnyűláncát (λ és κ) kódoló gének három különböző kromoszóma meghatározott lókuszán szerveződnek (11.6.ábra). Az ábrán láthatóhoz nagyon hasonló a többi emlős immunglobulin-génjeinek szerveződése is, bár a kromoszomális elrendeződés és az egyes génszegmensek száma eltérő (lásd 15. fejezet). Az emberi génszegmenseket és az átrendezésüket követően általuk kódolt nehéz- és könnyűláncdoméneket mutatjuk be a 11.6. ábrán.

11.6. ábra Az immunglobulin gének szerveződése és a kifejeződő fehérje szerkezete. A felső panel a humán immunglobulin nehéz- és könnyűlánc gének szerveződését mutatja. A variábilis szakaszt kódoló V-, D- és a J-szegmenseket követően, a 3’ vég felé haladva, a különböző izotípusokat kódoló CH-géneket egy-egy blokk jelzi. A fehérjedoméneket kódoló exonokat és a közöttük lévő intronokat csak a Cμ esetében tüntettük fel. (L – leader, V – variábilis, D – diverzitás, J – kapcsoló szakaszok; C – konstans, enh – enhanszer régió). Az alsó panelen az immunglobulin-láncok doménszerkezetének kialakulása látható. A szaggatott vonallal jelzett szakaszok a hipervariábilis régiókat (CDR1, CDR2, CDR3) jelölik. A CDR1- és CDR2-elemeket a V-gén, míg a CDR3-elemet a nehézlánc esetében a V-, a D- és a J-gének, a könnyűlánc esetében a V- és a J-gének együttesen kódolják. Az IgM nehézláncának membránkötött formájában a transzmembrán (TM) és citoplazmikus (CYT) szegmenseket önálló exonok kódolják.

Az immunglobulin génrégiókban variábilis (Variable – V), konstans (Constant – C) és az ezeket összekötő kapcsoló (Joining – J) gének találhatók. A nehézlánc esetében egy további típus, a diverzitás (Diversity – D) régió is itt lokalizálódik. Az egyes kódoló géneket nem-kódoló DNS-szakaszok választják el egymástól. Az immunglobulin lókuszok 5' végén helyezkedik el a V-gének csoportja, melyek száma az egyes láncok esetében eltérő: emberben a nehézlánc lókuszán kb. 100, a κ-lókuszon mintegy 35, míg a λ-lókuszon csaknem 30 V-gén található. (Érdekesség, hogy az egér nehézláncának V régiója mintegy 1000 gént tartalmaz.) A V-gének jelentős helyet foglalnak el az egyes lókuszokon (közel 2000 kilobázis méretű), míg egyenkénti hosszuk kb. 300 bázispár. Minden egyes V-génszakasz előtt egy promoter régió található, ami a gén transzkripcióját szabályozza. Ez azonban általában csak az átrendeződést követően történhet meg, mivel a csíravonalban a hatékonyságot biztosító „enhancer” génszakasz túlságosan távol helyezkedik el a promoter régiótól. Az egyes V-gének elején nagyjából 90 bp hosszúságú, 20-30 aminosavat kódoló hidrofób, ún. szignálszekvenciák (Leader – L) mutathatók ki. Ezek a szakaszok irányítják az átírt polipeptidláncot az endoplazmatikus retikulumba, ahol a fehérjék érése során lehasítódnak.

A V-génektől 3' irányban, kisebb-nagyobb nem kódoló DNS-szegmensekkel elválasztva, 30-50 bp hosszúságú J-régió, és csak a nehézláncokban D-génszegmensek is találhatók. Az emberi nehézlánc lókuszán, a C-génekhez közel, egy 6 génből álló J-család; a J- és a V-gének között pedig egy 20 D-génből álló család lokalizálódik. A κ-lókuszon öt J-szegmens található, a λ-lókuszon pedig minden egyes C-gén előtt áll egy J-szegmens. A későbbiekben részletezésre kerülő rekombinációs mechanizmus összekapcsol egy-egy V-, D- és J-szegmenst (a könnyű láncok esetében csak egy V- és egy J-szegmens kapcsolódik), és létrehozza az immunglobulin variábilis részét kódoló gént. Míg a V-génekben kódolva vannak a CDR1- és CDR2-szakaszok, addig a D-J (könnyűláncok esetén csak a J) szegmensek a V-régió karboxi-terminális végeihez kapcsolódva hozzák létre a variábilis régió harmadik hipervariábilis részét, a CDR3-t.

A J-régiótól 3’ irányban találjuk a C-géneket. A κ-lánc esetében egy, a λ-lánc esetében négy funkcionális C-gén található, amelyek egy-egy exont kódolnak. Az emberi nehézlánc esetében kilenc C-gént azonosítottak, amelyek a különböző immunglobulin izotípusokat kódolják (lásd 10. fejezet). Minden C-gén 3-4, hozzávetőlegesen 300 bp méretű exont tartalmaz (ezek kódolják a nehézlánc doménjeit), és emellett minden C-gén 3' végén kisebb, az immunglobulin nehézláncok karboxi-terminális részét (transzmembrán és a citoplazmikus szakaszokat) kódoló exonok is találhatók (11.6. ábra).

A V- és a C-gének ismétlődő elrendeződése a genomban arra utal, hogy az immunglobulin szupergéncsaládba tartozó V- és C-gének a filogenezis során sorozatos génduplikációk eredményeképpen alakultak ki. Bár a V-, D-, J- és C-gének egyes szakaszai közti DNS-szegmensek nem vesznek részt a fehérje kódolásában, fontos szerepet töltenek be az antigénkötő receptorok kialakulásában. Amint a továbbiakban látni fogjuk, ezek a szakaszok a rekombinációs mechanizmust biztosító enzimek fontos felismerő pontjait tartalmazzák, illetve bizonyos transzkripciós faktorok megkötésével a génexpressziót szabályozó (promoter, enhancer, és silencer) tulajdonságokkal is rendelkeznek.

A TCR génlókusz szerveződése

A TCR α-, β- és γ-láncokat kódoló szegmensek mind különböző kromoszómákon vannak, míg a δ-láncot kódoló gének az α-láncot kódoló lókuszban találhatók (11.7. ábra).

11.7. ábra. A humán TCR antigén-felismerő láncait kódoló gének szerveződése és a kifejeződő fehérje szerkezete. A felső panel a humán TCR-gének szerveződését mutatja. A TCR-α-, β- és γ-láncokat kódoló szegmensek mind különböző kromoszómákon találhatók, míg a δ-láncot kódoló gének az α-láncot kódoló lókuszban helyezkednek el. (Megjegyezzük, hogy az ábrán az exonok és intronok nem méretarányosak, továbbá csak a kifejeződő géneket tüntettük fel; a pszeudogéneket nem.) A C-géneket csupán egy blokkal jelöltük, kivéve Cβ-1-et, ahol feltüntettük az exonokat és a közöttük lévő intronokat is. (L – leader, V – variábilis, D – diverzitás, J – kapcsoló szakasz; C – konstans, enh – enhanszer, sil – silencer régió.). Az alsó panelen a TCR-α és β fehérjeláncának doménszerkezete látható. A szaggatott vonallal jelzett szakaszok a hipervariábilis régiókat jelölik (CDR1, 2, 3). Látható, hogy a CDR1- és CDR2-elemeket a V-gén, míg a CDR3-elemet a TCR-β-lánc esetében a V-, a D- és a J-gének, a TCR-α-lánc esetében a V- és a J-gének együttesen kódolják. A TCR C-régiójában az extracelluláris konstans domént, a transzmembrán (TM) és a citoplazmatikus (CYT) szegmenseket önálló exonok kódolják.

Minden egyes TCR-lókusz V-, J- és C-szegmensekből áll. Ezen kívül a TCR β- és a TCR δ-lókusz D-szegmenst is tartalmaz (az IgH-lókuszhoz hasonlóan). A TCR-lókusz 5’ végén egy csoport V-génszegmens található, amelyek szerveződése az Ig-génekhez nagyon hasonló, azaz tartalmaz egy promoter régiót, majd egy szignálpeptidet kódoló szakasz következik. A TCR-V-génektől különböző távolságra találhatók a C-régiót kódoló génszakaszok. A TCR β- és γ-lánc C-lókuszain kettő, míg az α- és δ-lókuszon egy C-gén található. Minden TCR-C-gént négy exon kódol, egy az extracelluláris domént, egy a rövid kapocs (hinge) régiót, egy a transzmembrán domént és végül az utolsó a citoplazmikus domént kódolja. A V- és a C-gének között találhatók a J-génszegmensek (minden egyes C-régió előtt a megfelelő J-csoport áll), illetve csak a TCR β- és δ-lánc esetében a D-gének is. A TCR-génszegmensek és a TCR-proteinek közötti összefüggést sematikusan a 11.7. ábra mutatja.

A V(D)J-rekombináció

Az érett B-, illetve T-limfociták kivételével minden magvas sejtünk csíravonal konfigurációban tartalmazza az immunglobulin-, illetve TCR-géneket. A funkcionálisan aktív immunglobulin- és TCR-molekulák szintézise csak a génátrendeződés szigorúan szabályozott eseménysora után valósulhat meg. Ez mai tudásunk szerint csak a B-, illetve T-limfociták sajátos egyedfejlődése során, B-sejtek esetében a csontvelőben, T-limfociták esetében pedig a tímuszban jöhet létre. A rekombinációs folyamat során egymástól nagyon távol lévő gének kerülnek közel, és alakul ki közöttük kapcsolódás. A kezdeti lépésben a kromatinnak az antigénreceptort kódoló génszakasz meghatározott helyein fel kell nyílnia. Ezután a DNS adott pontjain kettősszálú törések alakulnak ki, majd ezt követi a nem homológ végek összekapcsolódásának folyamata. A limfocitarepertoár diverzitása kialakulásának egyik alapvető mozzanata, hogy a nem homológ végek összekapcsolása során nukleotidok épülnek be, vagy éppen eliminálódnak. A V(D)J-rekombináció során az Ig vagy a TCR lókuszon egy V- és egy J-szegmens (illetve ha jelen van, akkor egy D-szegmens) választódik ki véletlenszerűen minden egyes limfocitában, majd ezek a gének összekapcsolódnak, és kialakítják a V(D)J génszakaszt, ami az antigénkötő receptor variábilis szakaszát kódolja. A konstans (C) régiók ettől a már kialakult V(D)J szegmenstől távoli génszakaszon helyezkednek el, és nem kódoló szakaszok választják el, még a primer RNS-átiraton is. A primer RNS átszabása (splicing) következtében a szignál, a V(D)J és a C-régió exonjai összekapcsolódva létrehozzák a mRNS-t, amelyről megindulhat az antigénkötő receptorláncok transzlációja. A limfociták különböző klónjaiban egyedi V-, D- és J-kombinációk jönnek létre, amik létrehozzák a csak az adott klónra jellemző receptort. A diverzitás jelentősen tovább fokozódik a gének összekapcsolódásakor beépülő, vagy éppen törlődő nukleotidok (N/P nukleotidok) hatására (11.8. ábra és lásd később)

Az Ig- és TCR-gének átrendeződése egy sajátos, nem homológ DNS-rekombinációnak tekinthető, amelyet számos enzim összehangolt működése tesz lehetővé. Ezek közül az enzimek közül néhány kizárólag a fejlődő limfocitákban van jelen, mások viszont általánosan előforduló DNS duplaszáltörést javító (double strand break repair, DSBR) enzimek. A V(D)J-rekombináció során a limfocita-specifikus komponensek egyedi DNS-szakaszokat, az ún. rekombinációs szignál szekvenciákat (Recombination Signal Sequences – RSS) ismerik fel. Ezek valamennyi V-gén 3’-végén, a J gének 5’-végén, illetve a D-génszakaszok mindkét oldalán találhatók. A rekombinációs szignálszekvenciák rendkívül konzervált, 7 és 9 bp hosszúságú (heptamer és nonamer) DNS-szekvenciákból állnak. A heptamer a kódoló génszakaszokhoz kapcsolódik, és attól 12 vagy 23 bp távolságban található a nonamer szekvencia (11.9. ábra). A 12 és a 23 bp hosszúságú szakasz („spacer”) egy, illetve két csavart jelent a DNS kettősspiráljában, és feltehetően az a szerepe, hogy a heptamer és a nonamer szekvenciákat olyan pozícióba hozza, hogy azokhoz a rekombináz enzimek egyidejűleg hozzáférhessenek.

11.8. ábra. Az antigénkötő receptorok diverzitásának alapja. Ugyanabból a csírasejtgenomból a V(D)J-rekombináció révén többféle receptor keletkezhet. A bemutatott ábrán három különböző összetételű variábilis domén alakul ki a különböző V-, D- és J-gének rekombinációjával, valamint a gének összekapcsolódásakor beépülő vagy éppen törlődő nukleotidok (N/P nukleotidok) hatására.

11.9. ábra. A V(D)J-rekombináció mechanizmusa. A V(D)J-rekombinázok limfocitaspecifikus komponensei egyedi DNS-szakaszokat, az ún. rekombinációs szignálszekvenciákat (RSS) ismerik fel. Ezek a konzerválódott heptamer (7 bp) és nonamer (9 bp) szekvenciák, amelyeket 12, ill. 23 bp hosszúságú szegmensek választanak el egymástól, a V- és a J-géneket (a κ- és λ-láncok esetében) ill. a V-, a D- és a J-géneket (nehézláncok esetében) határolják (A-panel). A V(D)J-rekombinázok itt hasítják a kettősszálú DNS-t, majd az egyes génszakaszokat egymás közelébe hozzák, és összekapcsolják azokat. A V- és J-gének rekombinációja delécióval, ill. inverzióval valósul meg. A piros nyilak az enzimatikus hasítás és az összekapcsolás pontjait jelölik (B- és C-panel).

A kihurkolódást követően a V(D)J rekombinázok mindkét DNS-szálban törést idéznek elő, és ezzel elhasítják a heptamer és a vele kapcsolatban lévő V-, D- és J-gének közötti szakaszt. A könnyűláncok esetében ez a törés a V-gén 3’- és a J-gén 5’-végén következik be. A köztes DNS-szakasz gyűrűvé záródik, és eltávolításra kerül. Ezt követi a két elvágott szál összekapcsolódása, így a V- és J-gének csatlakoznak (deléciós mechanizmus). Az Ig-κ-lókuszon néhány V-gén irányultsága fordított, és ezáltal a V-gén 5’-vége azonos irányú, mint a J-gén 3’ vége. Ezekben az esetekben a közbülső DNS-szakasz megfordítást követően olvad egybe a V- és a J-szegmentum (inverziós mechanizmus) (11.9. ábra).

A rekombináció csak akkor valósul meg két DNS-szegmens között, ha az egyikhez egy 12 bp, a másikhoz pedig egy 23 bp hosszúságú „spacer” csatlakozik. Ez az úgynevezett 12/23 bp szabály. A spacer szekvenciák lokalizációja biztosítja azt, hogy a megfelelő génszakaszok kapcsolódjanak egymáshoz.

A V(D)J-rekombinációs folyamat négy jól elkülönülő eseményre tagolható, amelyek szigorú sorrendben követik egymást (11.10. ábra):

  1. Rekombinációs szinapszis létrejötte – az antigénkötő receptort hordozó kromoszóma egyes részei a rekombinációs mechanizmus számára hozzáférhetővé válnak, majd a két kiválasztott szakasz az RSS-szekvenciákkal együtt egy kromoszómahurok révén egymás mellé kerül, és rögzítődik az ezután következő hasítás, majd összekapcsolás számára.

  2. Hasítás – a DNS duplaszálú törését az RSS-szignálszekvenciát felismerő enzimek váltják ki (limfoidspecifikus folyamat).

  3. A kódoló végek módosítása – az elhasított kódoló végek szekvenciáját a hozzáadott vagy törölt nukleotidok módosítják, és ezzel jelentősen fokozzák a diverzitást.

  4. Összekapcsolás – az elhasított kódoló szakaszok, valamint a szignálszekvenciák összekapcsolódnak az általánosan előforduló DNS-duplaszáltörést javító (DSBR) enzimek révén.

11.10. ábra. A V(D)J-rekombináció egymást követő eseményei. A DNS-szinapszis kialakítását, majd a hasítást a Rag-1- és Rag-2-enzimek végzik. A kódoló végek hajtűszerű kapcsolatait az Artemis endonukleáz nyitja fel, míg a felhasadt végeket különböző együttműködő enzimek (Ku70, Ku80 stb.) kapcsolják össze.

A V(D)J rekombinázok limfocitaspecifikus komponense a rekombinációaktiváló gén-1 (Recombination Activating Gene-1 - RAG-1), ill. a rekombinációaktiváló gén-2 (RAG-2) által kódolt enzimekből kialakuló tetramer komplex.

A Rag-1 és a Rag-2 együttesen vesz részt a kromoszóma megfelelő génszegmenseinek kihurkolásában és a szinapszis kialakításában. Ezt követően a Rag-1 elhasítja a DNS egyik szálát („nick”) a heptamer és a kódoló szakasz között. A kódoló szakasz 3’ végén felszabaduló OH csoport kovalens kötéssel hajtűszerű hurkot hoz létre a másik szállal. A szignálszekvencia végei (a heptamerrel és az RSS-szekvenciával együtt) nem képeznek hajtűszerű hurkot, hanem tompán végződnek, és a továbbiakban sem módosulnak. A Rag-1 és a Rag-2 komplex a hasítást követően is egyben tartja a hajtűkanyarvégeket, valamint a tompavégeket is, mielőtt az előbbin további módosulások következnének be.

A Rag-1 és Rag-2 enzimek csak az érés alatt lévő sejtekben (B-, T-sejtalakokban) fordulnak elő, és sosem expresszálódnak a már érett limfocitákban. Ez magyarázza azt, hogy azokban a sejtekben, amelyek már rendelkeznek BCR-, ill. TCR-struktúrákkal, nem jönnek létre további antigénkötő receptorok.

A kettősszálú DNS-töréseket követően a kódoló szakaszok végein kialakult hajtűkanyarhurkok felnyílnak, majd véletlenszerűen hozzáadott vagy lehasított nukleotidok módosítják a kódot. Ezután a szálak pontosan összekapcsolódnak egymással. A további folyamatok során mindössze egyetlen limfoidspecifikus enzim vesz részt a folyamatokban, a terminális dezoxiribonukleotidil-transzferáz (TdT), ami a felnyílt kódvégekhez, véletlenszerűen kapcsol nukleotidokat. A többi résztvevő általánosan előforduló hibajavító enzim, ami a nem homológ végek összekapcsolásában, azaz a limfoid sejtekben a V(D)J-rekombináció során keletkező törések összekapcsolásában vesz részt. Ide tartoznak a Ku70 és Ku80 fehérjék, amelyek a DNS szabad végeihez kötődnek, és odakapcsolják a DNS-függő protein-kináz (DNA-PK) katalitikus alegységét, mely egy kétszálú DNS-javító enzim. Ennek az enzimnek a hiánya fordul elő a SCID (Severe Combined Immunodeficiency Syndrome) egerek esetében is, amelyekben nem fejlődnek ki érett limfociták. A DNA-PK foszforilálja és aktiválja az Artemis nevű enzimet, ami felnyitja a kódoló végeken kialakult hajtűkanyarhurkot. (Ennek az enzimnek a hiánya vagy mutációja szintén a T- és B-sejtek hiányához vezet – lásd 20. fejezet.) A szabadon lévő szakaszok összekapcsolását a DNS ligáz IV enzim végzi (11.10. ábra).

A V(D)J-rekombináció egyik következménye, hogy V-gén 5’ végén lévő promoter közel kerül a V- és C-gének közötti szakaszon, illetve a C-gének 3’ végénél található enhancer régiókhoz. Mindez hozzájárul ahhoz, hogy a V gének promoter régióinak hatása maximális mértékben megvalósuljon és az antigénreceptorok transzkripciója hatékony legyen (11.11. ábra).

11.11. ábra. Az immunglobulin gének transzkripciós szabályozása. A V(D)J-rekombináció egymás közelébe hozza a promoter szakaszt (P) és a konstans (C) régió közelében lévő enhancer (enh) régiókat, aminek hatására a transzkripció felerősödik.

A B- és a T-sejtek diverzitásának kialakulása

A B- és a T-sejtrepertoár hatalmas méretű diverzitásának elsődleges forrása az Ig- és a TCR-gének szomatikus rekombinációs mechanizmusa. A sokféleség kialakulásához ezen túl még több genetikai mechanizmus is hozzájárul, amelyek relatív jelentősége a különböző receptorlókuszok esetében eltérő.

– Rekombinációból eredő diverzitás. A V(D)J-rekombinációs események számos csíravonal génszegmenst érintenek, amelyek a folyamat során véletlenszerűen rekombinálódnak. Ezen események során a maximálisan előforduló diverzitást a V-, a J- és ha jelen van, a D-szegmensek száma határozza meg. Miután a rekombináció lezajlik, és a receptor-alegységek kifejeződnek, a diverzitást tovább növeli az ugyanabban a sejtben keletkezett receptoralegységek (azaz az Ig esetén a VH és a VL, ill. a TCR esetén a Vα- és a Vβ-láncok) véletlenszerű kombinációjának lehetősége is. A valóságban kialakuló rekombinációból eredő diverzitás mértéke azonban jelentősen elmarad az elméleti maximumtól. Ennek oka, hogy nem minden génszegmens vesz részt egyforma eséllyel a rekombinációs folyamatokban, és nem minden VH és a VL, ill. a Vα- és a Vβ-lánc képes funkcionális receptort alkotni. Mindezek alapján a rekombinációból eredő diverzitás mértéke több ezres nagyságrendű lehet, ami messze elmarad a valódi repertoártól.

– Összekapcsolódásból eredő diverzitás. Az antigénkötő receptorok diverzitásához legnagyobb mértékben a V-, J- (és ha jelen van, a D-) szegmensek összekapcsolódásakor, a kódvégekhez adott, vagy onnan eliminált nukleotidok járulnak hozzá. Ezzel olyan új szekvenciák keletkeznek, amelyek eredetileg nem voltak a jelen a csíravonalgenomban. A kódoló végeken, a Rag-1 által létrehozott hurkokat az Artemis gyakran nem szimmetrikusan hasítja fel, így az egyik DNS-szál hosszabb lesz, mint a másik. A rövidebb szálnak komplementer módon kell kiegészülnie, hogy elérje a másik szál hosszát, még mielőtt a két szegmens összekapcsolódása bekövetkezik. Az ún. P-nukleotidok hozzáadásával tehát új szekvencia keletkezik a kiegészülő szálon. Egy másik mechanizmus során a felhasadt, kódoló DNS-szálakhoz randomszámban és összetételben ún. N-nukleotidokat épít be a TdT (11.12. ábra). Az N-diverzitás gyakrabban alakul ki az Ig nehézláncában, valamint a TCR β- és δ-láncaiban, mint az Ig κ- vagy λ-láncában. A P- vagy N-nukleotidok beépülése gyakran vezet a leolvasási keret módosulásához, ami hátrányos ugyan, de elkerülhetetlen velejárója ennek a nagyon hatékony folyamatnak, ami a diverzitásért leginkább felelős.

– Az V(D)J-szegmensek rekombinációja és az összekapcsolódásból eredő diverzitás lényegesen jelentősebb, mint a V-génekben kódolt különbségek. Éppen ezért, a CDR3-régió diverzitása messze meghaladja a CDR1- és CDR2-régiókét, és az antigénreceptor specificitásért is leginkább a CDR3 felelős.

Mindezek alapján az Ig- és a TCR-diverzitás elméletileg szinte végtelennek adódik, ám ennek valódi értéke feltehetően 107 nagyságrendű (11.1. táblázat). Ez arra is rávilágít, hogy a random-szekvenciák által generált antigénreceptorok legtöbbször nem jutnak túl a szelekciós folyamatokon, amelyek a sejtek éréséhez nélkülözhetetlenek.

11.12. ábra. Az összekapcsolódásból eredő diverzitás mechanizmusa. A különböző génszegmensek kapcsolódásakor nukleotidok hozzáadása vagy elvétele történhet, ami a szekvencia megváltozásával jár. A P-nukleotidok hozzáadása aszimmetrikusan felhasadt hurkok esetében valósul meg, a hosszabb szálat mint templátot használva. Ezzel szemben az N-nukleotidok beépülése véletlenszerű, templát nélküli folyamat.

11.1. táblázat - 11.1. táblázat. A különböző mechanizmusok hatása az Ig- és TCR-repertoár kialakításában

Mechanizmus

Immunglobulin

TCR- α β

TCR- γ δ

Nehézlánc

κ

α

β

γ

δ

Variábilis (V) szegmens

85

35

54

67

14

20-30

Diverzitás (D) szegmens

27

0

0

2

0

3

N-régiódiverzitás

V-D, D-J

Nincs

V-J

V-D, D-J

V-J

V-D1, D1-D2, D1-J

Kapcsolódási (J) szegmens

6

5

61

4

5

4

Teljes potenciális repertoár

~1011

~1016

~1018


A korai B- és T-sejtfejlődés transzkripciós szabályozása

A közös limfoid progenitor (CLP) sejtekből a csontvelőben a B-sejtek, míg a tímuszban a T-sejtek képződnek (11.5. ábra). A B- és T-sejtek elköteleződése számos transzkripciós faktor összehangolt szabályázásának tulajdonítható (11.13. ábra). A Notch-család tagjai olyan sejtmembránfehérjék, amelyek proteolitikusan lehasadnak, ha kapcsolatba kerülnek a szomszédos sejtek specifikus ligandumaival. A Notch levált citoplazmatikus doménje a sejtmagba kerül, ahol különféle gének átírását szabályozza. E család tagja a Notch-1, amely a GATA-3 transzkripciós faktorral együtt a T-sejtelköteleződést irányítja. A B-sejtek esetében az EBF és az E2A transzkripciós faktorok hatására indukálódik a Pax-5, és e három szabályozó faktor együttes hatása vezet a progenitor sejtek B-limfocita irányú elköteleződéséhez.

11.13. ábra. A B- és a T-sejtek elköteleződését irányító transzkripciós faktorok. A Notch-1 a GATA-3 transzkripciós faktorral együtt irányítja a T-sejtek elköteleződését. A B-limfociták esetében az EBF és az E2A transzkripciós faktorok hatására termelődik a Pax-5, és e három szabályozó faktor együttesen váltja ki a progenitor sejtek elköteleződését.