Ugrás a tartalomhoz

Borászati kémia

Kállay Miklós

Mezőgazda Kiadó

Másodlagos (szekunder) termékek keletkezése

Másodlagos (szekunder) termékek keletkezése

Tejsav képződése

A monoszacharidok erjesztése során az élesztő mindig termel kis mennyiségben tejsavat. A kb. 400 mg/l-es erjedési tejsav-koncentráció (a kiindulási cukor 0,2-0,3%-a) enzimatikus úton képződik: csekély mennyiségű piroszőlősav nem dekarboxileződik, hanem közvetlenül tejsavvá redukálódik a tejsav-dehidrogénáz katalizálta reakcióban:

Kétféle tejsav-dehidrogenáz enzimet ismerünk, amelyek a D(-)-tejsavat, valamint az L(+)-tejsavat eredményező reakciókat katalizálják. A borélesztők szinte kizárólag D(-)-tejsavat állítanak elő a cukorból (kivétel a Saccharomyces veronae (érvényes fajtanév: Kluyveromyces veronae), amely kizárólag L(+)-tejsavat termel. Az ún. biológiai almasavbomlás során a tejsavbaktériumok az L(-)-almasavból L(+)-tejsavat képeznek. (Az L konfigurációjú, a poláros fehér fény síkját balra forgató almasavból ugyancsak L konfigurációjú, de jobbra forgató tejsav keletkezik.) A glikolízis és az erjedés kapcsolatát az 52. és az 53. ábra mutatja be.

52. ábra - A glikolízis és az alkoholos erjedés kapcsolata

kepek/52-abra.png


53. ábra - A szénhidrát-lebontó anyagcsere (katabolizmus) és az ebből kiinduló szintézisfolyamatok (anabolizmus) kapcsolatának vázlata

kepek/53-abra.png


A glicerin képződése, a glicerin-piroszőlősavas erjedés

Ha megvizsgáljuk az alkoholos erjedés biokémiai reakcióit, szembetűnő, hogy az acetaldehid-3-foszfát oxidációja a megfelelő savvá, illetve az acetaldehid redukciója párhuzamosan futó folyamatok. A glikolízis kezdetén azonban a közegben még nincs jelen acetaldehid, így a NADH2 (amely a glicerinaldehid-3-foszfát oxidációjakor keletkezik), hidrogénjét nem tudja az acetaldehidnek leadni, így a glikolízis folyamatossága érdekében más úton kénytelen újraoxidálódni. Az erjedő közegben jelen van a dihidroxi-acetonfoszfát, amely glicerin-3-foszfáttá redukálódik, majd egy része hidrolizálódva (foszfatázenzim) glicerinné alakul és kilép a sejtből. Tehát az alkoholos erjedés indukciós periódusát – bevezető szakaszát – nevezzük „glicerin-piroszőlősavas” erjedésnek.

A NADH2 glicerinképződés közben újra oxidálódik, így nincs akadálya a glikolízis további lépéseinek. Miután képződött a piroszőlősav és belőle dekarboxileződéssel az acetaldehid, gyakorlatilag nincs lehetőség a közvetlen tejsavvá, illetve alkohollá való redukálódásnak, a piroszőlősav és az acetaldehid felhalmozódik a közegben. Az acetaldehid megjelenése az alkoholos erjedés kezdete. Az acetaldehid felhalmozódásával párhuzamosan egyre inkább átveszi az elektronakceptor szerepét a NAD-koenzimek regenerálásában, így az alkoholos erjedés fokozatosan túlsúlyra jut a kezdeti glicerin-piroszőlősavas erjedéssel szemben. A glicerin jelenlétét az alkoholos erjedés közegéből – különösen bor esetében – Pasteur mutatta ki (54. ábra).

54. ábra - A glicerin-piroszőlősavas erjedés vázlata

kepek/54-abra.png


Összefoglalva tehát az alábbi megfigyeléseket tehetjük:

  1. A glicerin képződése sokkal nagyobb intenzitású az erjedés induló fázisában (természetesen egy adott egyensúly szerint a teljes erjedési folyamat alatt van bizonyos mértékű glicerinképződés).

  2. Az acetaldehid és a glicerinaldehid-3-foszfát egyenlő koncentrációja esetén az acetaldehid redukálódik gyorsabban.

  3. SO2 folyamatos adagolása az acetaldehid megkötése révén növekvő glicerin-koncentrációt eredményez az erjedő közegben. Íly módon a cukor 25–30% glicerinné alakítható. (A normális erjedési folyamatban 3–8%.) Az 52. ábra alapján azonban belátható, hogy ez csakis az alkoholtermelés rovására valósítható meg, és az élesztő számára kevesebb ATP színtézisét teszi lehetővé.

Ecetsav képződése az erjedés alatt

Ha az erjesztett cukormennyiség függvényében vizsgáljuk, az erjedés kezdetén ecetsav-növekedést, majd ecetsavcsökkenést figyelhetünk meg. A lefutás nagyban függ az erjesztést végző élesztőtörzstől (55. ábra). Az ecetsavképződés módjával kapcsolatban jelenleg több hipotézis van. Az egyik szerint valószínűleg az acetaldehid diszmutációja révén keletkezik:

2 CH3-CHO + H2O → CH3COOH + CH3CH2OH.

A redoxreakciónak a magasabb pH kedvez, de kifejezetten savas közegben is lejátszódik az acetaldehid egy részével, tehát ebből ered az erjedő közegben jelen lévő ecetsav (0,05–0,50 g/l).

A képződés másik lehetséges módja enzimatikus. Az élesztőknek ugyanis van NADP-koenzimmel működő aldehid-dehidrogenáz enzimük is, amely az acetaldehidet ecetsavvá oxidálja. Bár az enzim működését a semlegeshez közeli vagy lúgos pH támogatja, egyes szerzők szerint szerepe van a must erjedése során keletkező ecetsav képződésében is (56. ábra).

55. ábra - A glicerin-piroszőlősavas erjedés vázlata

kepek/55-abra.png


Az erjedés során az élesztők nemcsak termelnek, hanem fel is használhatnak ecetsavat. Az élesztők ecetsav-hasznosítása acetaldehiddé redukálással indul, előnyben részesítve az alkoholos erjedést a glicerin-piroszőlősavas erjedéssel szemben (csökkent glicerinkoncentráció), nő az acetaldehidből képződő másodlagos termékek koncentrációja.

Fentiek alapján tehát áterjesztéssel bizonyos határig csökkenthető a borok illósav-tartalma.

Piroszőlősavból származtatható másodlagos termékek

A piroszőlősav átlagos koncentrációja borokban 80 mg/l. Ahogy azt már az előzőekben említettük, számos másodlagos termék keletkezésének kiindulópontja lehet (56. ábra).

56. ábra - Másodlagos erjedési termékek képződési lehetőségei piroszőlősavból (Usseglio-Tomasset, 1995)

kepek/56-abra.png


Prekurzora lehet az acetil-CoA-nak, melyből hidrolízissel ecetsav keletkezik.

Az acetil-koenzim-A képződésének két útja ismert:

a) Oxidáció NAD segítségével szén-dioxid-képződés közben

b) Hangyasav képződésével

Ez utóbbi elhanyagolható, a képződött hangyasav mennyisége néhány mg literenként.

Acetoin (acetilmetil-karbinol) keletkezése

Két molekula piroszőlősav kondenzációjakor keletkezik (ún. acetoin-kondenzáció).

Elsősorban az erjedés kezdeti szakaszában, aerobiózisban képződik (57. ábra).

57. ábra - Az acetaldehid, acetoin és magasabbrendű alkoholok képződése az alkoholos erjedés során

kepek/57-abra.png


Diacetil képződése

Az acetoin oxidációjával keletkezik néhány mg/l-es koncentrációban, szintén az erjedés elején.

A diacetil 0,5–2,5 mg/l-es koncentrációban hozzájárul a jellegzetes boraroma kialakulásához.

Feltételezhető egy „hagyományos” kondenzáció is az acetaldehid és az ecetsav között, majd az így nyert diacetilből egy redoxreakcióban egy acetoin- és egy ecetsav-molekula képződik:

Az előzőektől eltérően is képződhet a diacetil, piroszőlősav és acetaldehid reakciójával, az α-aceto-hidroxisav-szintetáz enzim segítségével.

Az erjesztendő közegben (must) levő valin koncentrációja befolyásolja az α-aceto-hidroxisav-szintetáz enzim képződését, így az α-acetolaktátét is (ha kevés a valin, sok az enzim is fordítva). A prekurzor végül is nem a valin, hanem a piroszőlősav, amelyből acetoinon keresztül képződik a diacetil.

2,3 butándiol vagy butilénglikol

Az erjedés anaerob fázisában keletkezik az acetoin redukciójával. Maximális koncentrációja borokban 1 g/l (58. ábra).

58. ábra - Az ecetsav, glcerin, 2,3-butándiol és a kötött savak képződése az alkoholos erjedés alatt

kepek/58-abra.png


Almasav képződése piroszőlősavból

A piroszőlősav a Wood-Werkman-reakcióban karboxileződik oxálecetsavat eredményezve, amelyet aztán az élesztő almasavvá alakít. Ez az elméletileg bebizonyított reakció a borban gyakorlatilag nem jelent almasav többletet, mivel a spontán almasavbomlás kompenzálja a koncentrációnövekedést.

Borostyánkősav képződése piroszőlősavból

a) Piroszőlősav → almasav (lásd fentebb) → fumársav → borostyánkősav

b) Borostyánkősav képződhet két molekula Acetil-CoA oxidatív kondenzációjakor is:

Az így kapott borostyánkősav dekarboxileződés után propionsavvá alakulhat (ez utóbbi normál erjedés esetén nyomokban megtalálható a borban). A két képződési reakció valószínűleg egymás mellett, párhuzamosan játszódik le. A képződött borostyánkősav az egyik legjellegzetesebb másodlagos erjedési termék, maximális koncentrációja 1,5 g/l körüli. A borostyánkősav képződését aminosavból (glutaminsav) levezetve (dezaminálás, dekarboxilezés, oxidáció) is magyarázták.

Jóllehet az élesztők enzimrendszere képes a fenti átalakításra, a mennyiségi viszonyok figyelembevételével azonban a borostyánkősav képződése nem magyarázható, ugyanis ez utóbbi képződött mennyisége jóval nagyobb, mint az a közegben lévő aminosavból következhet még akkor is, ha annak folyamatos szintézise biztosított.

A borostyánkősav tehát tipikus erjedési „melléktermék”, ha egészséges, érett szőlőből származó mustot erjesztünk. Amennyiben nem teljes érésben lévő vagy mikroorganizmusok (pl. Botrytis) által fertőzött szőlőről van szó, akkor a mustban is előfordulhat. Normális esetben azonban csak a bor alkotórésze.

Citramálsav (metil-almasav) képződése piroszőlősavból

Régebben a citromsav baktériumos lebontásából eredeztették, azonban bizonyították, hogy csak az alkoholos erjedés során képződik, és a biológiai almasavbomlás során a tejsavbaktériumok a citromsavból nem képezik.

Az élesztő, ecetsav (Ac-CoA) és piroszőlősav koncentrációjával szintetizálja:

A citramálsav a borokban 0–300 mg/l-es koncentrációban fordul elő.

Nitrogéntartalmú összetevők lebontása az alkoholos erjedés során

A nitrogéntartalmú vegyületek a mustban ammónia, aminosavak, polipeptidek és fehérjék (proteinek) formájában vannak jelen. Az élesztők a fehérjéken kívül képesek mindegyik típus szükség szerinti nitrogénforrásként való felhasználására, kezdve a legkönnyebben asszimilálható ammónia-nitrogénnel. Mindazonáltal a jellemző aminosavak jelenléte a szubsztrátumban megkönnyíti az erjedést, amennyiben az élesztő képes a háromféle nitrogénasszimiláció valamelyikére:

1. Közvetlen aminosav-felvétel a szubsztrátból.

Az aminosavak nagyobb része így vevődik fel, az élesztő csak abban az esetben dezaminálja az aminosavakat, ha a különböző aminosavak aránya számára nem megfelelő.

2. Az aminosavakból egy oxidációs-redukciós mechanizmus során ammónia szabadul fel, mely könnyen asszimilálható.

Az aminosavak között vannak H-donorok és H-akceptorok, ez tehát megmagyarázza, hogy egy aminosav-keverék miért hatásosabb, mint a keverék összetevői külön-külön.

Lejátszódnak ugyanis a következő típusú reakciók:

Adjuk össze a két egyenletet:

Látszik tehát, hogy az aminosav-keverék bőséges ammónia-nitrogén forrás, amely az élesztő számára könnyen asszimilálható.

A H-donor típusú aminosavakból 4H szabadulhat fel, amely a NAD számára felvehető. Ennek a reakciónak a lejátszódása a következő:

  • aminosavból oxidációval iminosav keletkezik:

  • az iminosav hidrolizálódik ketosav és ammónia képződése közben:

  • oxidatív dekarboxilezés: egy szénatommal rövidebb karbonsav, CO2 és 2H keletkezése

3. Ehrlich-féle asszimiláció

Dezaminálás és dekarboxileződés során magasabb rendű alkoholok képződnek (59.ábra). A ketosavakhoz (amelyek aztán dekarboxileződnek majd redukálódnak) az ún. transzaminálódással is el lehet jutni. A transzaminálódási folyamatokban az α-keto-glutársav vesz részt (60. ábra).

59. ábra - Magasabb rendű alkoholok képződése aminosavakból

kepek/59-abra.png


60. ábra - Magasabb rendű alkoholok képződése aminosavakból transzaminálódással

kepek/60-abra.png


Ugyanilyen mechanizmus szerint képződik a valinból a 2-metil-1-propanol (izobutilalkohol), a leucinból a 3-metil-1-butanol (inaktív izoamilalkohol) izolencinból a 2-metil-1-butanol (aktív izoamilalkohol). Ezek a bor legfontosabb magasabb rendű alkoholjai, amelyek közvetlen prekurzora, az α-aminovajsav, nem található meg a mustban.

Nézzük meg most röviden az élesztő aminosav-szintézisének mechanizmusát, ugyanis miközben az erjedéskor a must aminosav-tartalmát az élesztő nitrogénforrásként hasznosítja, az erjedés során maga is „termel” aminosavakat.

Az ammónia-nitrogén felhasználása az α-keto-glutársav segítségével történik, glutaminsav képződése közben:

A többi szintetizált aminosav vagy a glutaminsav-váz módosításával, vagy a megfelelő ketosav és a glutaminsav közötti transzaminálódással származtatható.

Magasabb rendű alkoholok képződése

Ahogy az előzőekben láttuk, az aminosavakból dezaminálással és/vagy transzaminálással képződött ketosavakból magasabb rendű alkoholok alakulnak ki. Ezekhez a ketosavakhoz azonban a glikolízis során is el lehet jutni (lásd: piroszőlősav), tehát végső soron a magasabb rendű alkoholok ily módon az erjeszthető monoszacharidokból is kialakulhatnak az élesztő tevékenysége révén.

Nagy valószínűséggel tehát a magasabb rendű alkoholok az alkoholos erjedés során aminosavakból is és cukorból is képződnek.

Megfigyelték, hogy az élesztő ammónia-nitrogént felhasználva képes a számára szükséges összes aminosav szintetizálására, illetve ha kizárólag ammónia vagy karbamid a nitrogénforrás, csak csekély mennyiségű magasabb rendű alkohol képződik.

Ha pedig a nitrogénforrás csak aminosavakból áll, azaz szükséges a dezaminálás, jelentős koncentrációban (600–1000 mg/l) képződnek magasabb rendű alkoholok.

Usseglio-Tomasset (1978) szintetikus közegben végzett erjesztési kísérletei szerint a következők állapíthatók meg:

Egy 180 g/l cukrot tartalmazó, 3,2 pH-jú oldatban nitrogénforrásként vagy ammóniát (karbamidot) vagy egyenként különböző aminosavakat adagoltak, majd borélesztővel kierjesztették. Az aminosavak minőségétől függetlenül mindig négyféle magasabb rendű alkohol képződik:

  • 1-propanol,

  • 2-metil-1-propanol (izobutilakohol),

  • 3-metil-1-butanol (inaktív izo-amil alkohol),

  • 2-metil-1-butanol (aktív izo-amil alkohol).

Az élesztő tehát a fenti alkoholok prekurzor-ketosavait szintetizálja, amelyek dekarboxileződésével, illetve redukciójával az egy szénatommal rövidebb láncú alkoholok nyerhetők. Ezek a ketosavak a következők:

  • α-ketovajsav (4C), 

  • α-ketoizovaleriánsav (5C),

  • α-ketokapronsav (6C),

  • α-keto-β-metilvaleriánsav (6C).

Természetesen ezek a ketosavak természetes közegben az Ehrlich-féle mechanizmus szerint – a többi aminosavból képződött ketosavval együtt – is képződhetnek.

A magasabb rendű alkoholok tehát a cukorból képződött piroszőlősavból (lásd glikolízis) kiindulva is keletkezhetnek, az alábbi reakcióséma szerint:

Amennyiben természetes szőlőmust nitrogénkoncentrációját ammónia-nitrogénnel növeljük, csökken a képződött magasabb rendű alkoholok koncentrációja.

Kéntartalmú aminosavak képződése

Az élesztő az alkoholos erjedés során képes a mustban található szulfátok redukciójával kénhidrogén (H2S; 10–100 μg/l) szintetizálására, továbbá szulfitionok (SO32-) képzésére, amelyek a borban biszulfition formájában (HSO3-) találhatók. Az élesztő típusától és a körülményektől függően 10–80 mg/l SO2 képződhet, azonban az élesztők nagy része nem termel 10–20 mg/l-nél többet; csak a különleges, direkt SO2-termelő törzsek azok, amelyek az akár 200 mg/l SO2-képződést is lehetővé teszik. Nézzük tehát a két fő kéntartalmú aminosav (L-cisztein és a metionin) bioszintézisét prekurzoraikból (aszparaginsav, illetve szerin) és a szulfátredukcióból származó H2S-ből kiindulva (61. ábra).

61. ábra - Kéntartalmú aminosavak keletkezése

kepek/61-abra.png


Az erjedés alatti H2S-képződés nem keverendő össze a merkaptánok jelenlétével, amelyek az erjedés után sokáig seprőn tartott borokban keletkezhetnek. Néhány mg/l koncentrációban jelen lévő kéntartalmú komponensek merkaptán esetében nehezen eltávolíthatók és a bornak kellemetlen ízt, illatot kölcsönöznek. Az erjedés alatti H2S természetesen nem csak a szulfátok redukciójából származhat, hanem a must mint szubsztrátum kéntartalmú aminosavainak lebontásából is, amelyet a még élő, de már nem erjesztő élesztők végeznek el.

A képződött H2S különösen az erjedés induló szakaszában érezhető érzékszervileg, normális esetben a CO2 gyakorlatilag kiűzi az erjedő borból.